Summary
En protokol præsenteres for bekvem og høj gennemstrømning isolering og berigelse af kirtelcapitate stilkede og sessile trichomer fra Cannabis sativa. Protokollen er baseret på en tør, ikke-bufferekstraktion af trichomer ved kun at bruge flydende nitrogen, tøris og nylonsigter og er velegnet til RNA-ekstraktion og transkriptomisk analyse.
Abstract
Dette papir præsenterer en protokol for bekvem og høj gennemstrømning isolering og berigelse af kirtelcapitate stilkede og sessile trichomer fra Cannabis sativa. De biosyntetiske veje til cannabinoid og flygtig terpenmetabolisme er primært lokaliseret i cannabistrichomerne, og isolerede trichomer er gavnlige for transkriptomanalyse. De eksisterende protokoller til isolering af kirteltrichomer til transkriptomisk karakterisering er ubelejlige og leverer kompromitterede trichomehoveder og en relativt lav mængde isolerede trichomer. Desuden er de afhængige af dyre apparater og isolationsmedier, der indeholder proteinhæmmere for at undgå RNA-nedbrydning. Den nuværende protokol foreslår at kombinere tre individuelle modifikationer for at opnå en stor mængde isolerede kirtelcapitate stilkede og sessile trichomer fra henholdsvis C. sativa modne kvindelige blomsterstande og vifteblade. Den første modifikation indebærer at erstatte flydende nitrogen med det konventionelle isolationsmedium for at lette passagen af trichomer gennem mikrosigterne. Den anden ændring indebærer at bruge tøris til at løsne trichomerne fra plantekilden. Den tredje modifikation indebærer, at plantematerialet ledes fortløbende gennem fem mikrosigter med faldende porestørrelser. Mikroskopisk billeddannelse viste effektiviteten af isolationsteknikken for begge trichome-typer. Derudover var kvaliteten af RNA ekstraheret fra de isolerede trichomer passende til nedstrøms transkriptomisk analyse.
Introduction
Kirteltrichomer er hårlignende strukturer, der findes i planter, der indeholder mange sekundære metabolitter1 og repræsenterer en værdifuld bank af nye biosyntetiske gener og enzymer2. I cannabis er biosyntesen af de vigtige sekundære metabolitter, cannabinoider3 og terpener4, lokaliseret i trichomerne. I betragtning af trichomers rolle i bestemmelsen af kvaliteten af cannabis både til medicinske og rekreative anvendelser er undersøgelsen af trichome-genekspression af interesse. For at karakterisere ekspressionen af trichome-specifikke gener skal trichomerne af interesse først isoleres. Trichome-isolationsprotokoller blev først beskrevet allerede i 19925, og deres seneste udvikling er for nylig blevet gennemgået2. Generelt kan protokoller til ekstraktion af kirteltrichomer til transkriptomisk karakterisering opdeles i to forskellige sekventielle trin. Det første trin indebærer en grundig fysisk adskillelse af trichomerne fra plantevævet. Dette trin kan udføres ved hjælp af tøris5, glasperler med et kommercielt apparat6,7, formaling af plantematerialet mod en maskesigte8 eller hvirvelstrøm af plantevævet i en isolationsbuffer9. Det andet trin indebærer en mere raffineret adskillelse af de relevante trichomer fra de mikroskopiske planterester og/eller andre trichometyper. Dette trin kan udføres ved hjælp af densitetsgradientcentrifugering 8,10 eller sigter i forskellige størrelser 7,9. På grund af RNA's ekstreme følsomhed i forarbejdede væv over for nedbrydende midler udføres disse to sekventielle trin sædvanligvis i det iskolde isolationsmedium, ofte i nærvær af proteinhæmmere4.
Konventionelle trichome-isolationsprotokoller kræver, ud over de iskolde temperaturer, store mængder isolationsmedium for at sikre en effektiv ekstraktionsprocedure. Kombinationen af disse komponenter resulterer i en besværlig, tidskrævende isoleringsproces, der forhindrer høj gennemstrømning. Præsentation af en ligetil, brugervenlig alternativ trichome-isolationsprotokol vil derfor sandsynligvis være gavnlig for forskellige aspekter forbundet med trichome-karakterisering. Dette papir sigter mod at tilbyde en alternativ protokol til isolering af stilkede og siddende kirtelcapitate-trichomer fra Cannabis sativa ved at kombinere og integrere flere elementer fra de konventionelle protokoller. Disse elementer omfatter tøris5, passage af trichomerne gennem flere mikrosigter med faldende porestørrelser 7,9 og erstatning af flydende nitrogen (LN) med isolationsmediet8.
Nyheden ved den nuværende trichome-isolationsprotokol sammenlignet med konventionelle protokoller præsenterer på en række måder. Denne protokol er praktisk, da den ikke kræver farlige komponenter. Proceduren kan udføres i laboratoriet med minimale forholdsregler og letter høj gennemstrømning. Erstatning af LN for standard væskeisoleringsmediet sikrer trichomernes integritet gennem hele isolationsprocessen, hvilket muliggør efterfølgende transkriptomisk analyse. Ved sublimering af LN og tøris efterlades de isolerede trichomer fri for skadelige rester. Endvidere tillader LN's tilbøjelighed til at sublimere ved stuetemperatur dets generøse anvendelse i hele protokollen. I modsætning hertil skaber brugen af store mængder konventionelt isoleringsmedium praktiske vanskeligheder ved håndteringen. Endelig reducerer protokollen adskillelsen af diskcellen fra den resterende skrøbelige hovedstruktur i kirtellomen, hvilket muliggør bevarelse af headspace-indholdet.
Denne protokol præsenteres på en detaljeret trin-for-trin måde designet til at hjælpe den tekniske praksis med at isolere C. sativa glandular capitate trichomes. Protokollen giver en håndterbar arbejdsgang, der resulterer i isolerede trichomer med en høj koncentration og renhed, der er passende til nedstrøms molekylær analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Plantematerialet, der blev anvendt i denne undersøgelse, bestod af fire C. sativa ARO-Volcani-stammer (CS-11, CS-12, CS-13 og CS-14), der blev dyrket i Volcani Center, Israel, som beskrevet andetsteds11. Glandular capitate stalkede trichomer blev isoleret fra modne blomstrende blomsterstande, og kirtelcapitate sessile trichomes blev isoleret fra store vifteblade fra modne ikke-blomstrende moderplanter. Alt plantemateriale blev friskplukket og straks opbevaret ved -80 °C.
FORSIGTIG: Tøris og LN anvendes i hele protokollen. Disse stoffer er yderst farlige. De isolerede trichomer kan indeholde tørispartikler, der kan skabe farligt gastryk, når de indsættes i forseglede rør; Derfor skal alle hætter nålepunkteres. Brug af beskyttelsesbriller, passende laboratorieslid og handsker til håndtering ved ekstremt lave temperaturer anbefales stærkt.
1. Opsætning til den indledende adskillelse af trichomer fra plantematerialet
- Knus en tørisblok i små fine flager med en hammer og en hård flad genstand i en 5 L plastbeholder.
- Sigt de fine tørisflager (mindre end 5 mm) fra den ikke-knuste tøris med en stor si (via porer mindre end 5 mm) i en anden 5 L plastbeholder. Hæld ca. 200 cm3 (200 ml mærke) af tørisflagerne i et opretstående 1 L glasbægerglas.
- Tilsæt op til 10 g frosne C. sativa-blomsterstande (fra nu af benævnt plantemateriale) på det første lag knust tøris, og dæk med et ekstra lag på 200 cm3 fint knust tøris.
- Dæk åbningen af 1 L glasbægeret med to til tre lag 1 mm skærmdør myggenet, og fastgør det til ydersiden af glaskoppen med elastikker (figur 1).
- Hæld LN i en stor rundbundet beholder i rustfrit stål (se materialetabel), hvor de isolerede trichomer vil blive opsamlet.
- Indsæt en 350 μm maske i en melsigte/sigtesil for at dække melsigtemasken nedefra (figur 2). Hvis der findes en melsigte med en aftagelig plastring, skal du indsætte masken på 350 μm, så den fastgøres under melsigterens maske. Hvis ikke, fastgøres masken på 350 μm til melsigtets omkreds med gummibånd.
- Mel sigtet over den store rundbundede beholder af rustfrit stål fyldt med LN (figur 3). Sørg for, at beholderens bredde overstiger melsigtets bredde for at minimere tabet af den sigtede masse uden for den rundbundede beholder i rustfrit stål.
2. Adskillelse af trichomer fra plantematerialet
- Ryst 1 L-glasset med åbningen pegende nedad mod melsigten, som om du brugte en stor saltryster (figur 4).
- 1 L glasbægerglasset sættes til side hvert 2.-3. minut for at gøre det muligt at sigte den knuste tøris og plantemateriale, der er akkumuleret på melsigten.
- Sigt melsigten vandret for at lette passagen af plantematerialet ind i LN i den rundbundede beholder i rustfrit stål nedenfor.
- Tilsæt LN til beholderen i rustfrit stål og knust tøris til 1 L glasbægeret, når deres niveauer er lave. Det brugte plantemateriale i glasbægeret fyldes op med yderligere 10 g frisk plantemateriale, når plantematerialet på melsigten er udtømt. Genopfyldningen behøver normalt ikke gentages mere end to gange.
- Gentag trin 2.1-2.4, indtil en tilstrækkelig mængde berigede trichomer er opsamlet i den rundbundede beholder i rustfrit stål. Generelt er 20 g frisk plantemateriale tilstrækkeligt til RNA-ekstraktion og transkriptomanalyse.
- Kontroller, at der er et hvidt pulverlignende stof (bestående af planteaffald, kirteltrichomer og knust tøris) i bunden af beholderen i rustfrit stål nedsænket i LN. En mikroskopisk observation vil hjælpe med at afgøre, om der er indsamlet en tilstrækkelig mængde trichomer; Dette trin kan dog blokere protokollens flow. Normalt er 10-20 g indledende plantemateriale tilstrækkeligt til de fleste isolationer; Der kan dog være forskelle i planternes trichometæthed.
BEMÆRK: Fra dette tidspunkt kan eksperimentet sættes på pause og genstartes senere. Hvis det sættes på pause i kort tid, skal der tilsættes tilstrækkelige mængder LN, så trichomerne forbliver nedsænket. Alternativt kan trichomerne opsamles og opbevares ved -80 °C i op til 3 måneder til senere brug, som beskrevet i trin 5.
3. Adskillelse af kirtelcapitate trichomer (stilkede og siddende) fra andre trichometyper, såsom pæreformede og cystolitiske trichomer og snavs
- Tilsæt en lille mængde LN til en ren, lille rundbundet beholder i rustfrit stål.
- Fold en 40 cm x 40 cm mikrosigte med en maskestørrelse på 150 μm to gange for at opnå en foldning på 20 cm x 20 cm, og åbn den. Sørg for, at den ligner en keglelignende form (figur 5).
- Fastgør netkeglen til kanten af den rundbundede beholder i rustfrit stål med en eller to tøjklemmer, så den åbne del af keglen er lodret, og dens spidse del er delvist nedsænket i LN.
- Hæld forsigtigt LN og det hvide pulverlignende stof fra trin 2.6 i mikrosigtekeglen.
- Påfør forsigtigt en bred børste for at samle og overføre eventuelt resterende plantemateriale fra den første beholder til 150 μm mesh-keglen.
- Tilsæt mere LN til den første beholder, og gentag børstningsbevægelsen, indtil alt plantematerialet er overført til mikrosigtekeglen.
- Fjern forsigtigt tøjklemmen fra beholderens låg, og åbn mikrosigtekeglen, så trichomerne er placeret midt i den åbne mikrosigte. Hold alle fire hjørner af mikrosigten sammen, så den midterste del, der indeholder trichomerne, forbliver nedsænket i LN (figur 6).
- Mens du holder alle fire hjørner af mikrosigten, dyppes og rystes mikrosigten forsigtigt i LN i stålbeholderen, som om du infunderer en tepose. Fortsæt denne dypning/rystelse (lodret og vandret) bevægelse i 1 min. Der er en afvejning mellem isolationskvalitet og kvantitet. Længere dyppebevægelser kan resultere i større mængder trichomer, men deres isolationsgrad kan være dårligere. Samlet set anbefales 1 minut som passende for både kvalitet og kvantitet.
BEMÆRK: Denne sigtebevægelse er den mest kritiske del af protokollen og skal udføres i overensstemmelse hermed. - Valgfrit: Hæld det ikke-sigtede planteaffald og større trichomer (stadig nedsænket i LN), der er pakket ind i midten af mikrosigten, i et 13 ml eller 50 ml reagensglas og opbevar ved -80 °C til fremtidig brug.
FORSIGTIG: For at undgå ophobning af trykgas (fra tøris og LN-rester) skal du punktere et hul i reagensglassets hætte med en steriliseret nål. Hætten kan udskiftes, når trykket er reduceret, hvilket normalt er efter 24 timer.
4. Passerer trichomer gennem mikrosigter med faldende porestørrelse
- De sigtede trichomer nedsænket i LN i bunden af den lille rundbundede beholder af rustfrit stål overføres sekventielt gennem mikrosigter med faldende porestørrelser (105 μm, 80 μm, 65 μm og 50 μm) på samme måde som vist i trin 3.
5. Indsamling af de ønskede trichomer
- Fjern de ønskede trichomer nedsænket i LN og pakket ind i 50 μm mikrosigten ved hjælp af en forkølet (i LN) ske. Læg dem på en ren tallerken.
BEMÆRK: I dette sidste isoleringstrin opsamles de ønskede trichomer fra sigten. - Overfør hurtigt de pulverlignende trichomer til et mærket forkølet 1,5 ml rør via en forkølet spatel eller en scoopula indsat i røret (figur 7). Glassene opbevares straks ved -80 °C til yderligere undersøgelser.
BEMÆRK: Et skematisk arbejdsgangsdiagram, der viser hele isolationsprotokollen, er vist i figur 8.
6. Observation og analyse af de rensede trichomer
- Placer en lille mængde (10 mg) isolerede trichomer på et mikroskopglas ved hjælp af en forkølet (via LN) spatel. Tilsæt en dråbe vand, og observer direkte på et lysmikroskop uden farvning. Evaluer den samlede isolations- og kontamineringsgrad ved hjælp af lave (10x) og høje (40x) forstørrelser. Berigelse estimeres visuelt ud fra den relative mængde trichomer i forhold til ikke-trichomevæv, som vist i figur 9.
- Udfør RNA-ekstraktion og kvalitetsanalyse fra 50 mg isolerede C. sativa-kirtelkapit , stilkede og siddende trichomer.
BEMÆRK: Et kommercielt ekstraktionssæt (se materialetabel), der anvender en poly-A-baseret strategi for mRNA-oprensning, blev anvendt til RNA-ekstraktionen.- Resuspender 50 mg af de isolerede trichomer i lysisopløsningen, hvirvel i 30 s, sonikere i en iskold ultralydsrensningsenhed ved 35 kHz i 5 min, og ekstraher mRNA'et fra prøverne i henhold til producentens protokol (se materialetabel).
- For at estimere integriteten af RNA'et ekstraheret fra trichomerne bestemmes RNA-koncentrationen, den samlede mængde og RNA-integritetstallet (RIN) værdier ved hjælp af et lab-on-a-chip-system (se materialetabel).
- Udfør RNAseq-analyse af trichomefraktionerne (valgfrit). RNAseq-analyse og bioinformatikanalyser af sekventerede aflæsninger kan udføres af standard outsourcing-tjenester
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den vigtigste ændring inkluderet i denne protokol sammenlignet med konventionelle trichome-isolationsprotokoller er at erstatte standardisolationsmediet med LN. Brug af LN som isolationsmedium tillader en afslappet arbejdsgang, fordi så længe prøverne er nedsænket i LN, er metabolisk nedbrydning sandsynligvis ikke forekommende. Da protokollen desuden undgår de farlige komponenter (dvs. aurintricarboxylsyre og β-mercaptoethanol), der anvendes i traditionelt trichome-isolationsmedium, er arbejdet ikke begrænset til en kemisk hætte. Ikke desto mindre er det vigtigt at tage de nødvendige forholdsregler ved håndtering af tøris og LN.
For at vurdere fordelene ved denne protokol blev trichome-isolationsresultaterne fra denne protokol sammenlignet med dem, der blev opnået ved hjælp af en konventionel trichome-isolationsprocedure (hvor der blev anvendt en vandig buffer, glasperler og en fin sigte til trichome-isolering)12, oprindeligt ved hjælp af et lysmikroskop. En sammenligning af komponenterne fra forskellige isolationsfaser via lysmikroskopinspektion illustrerer den stigende trichome-isolationsgrad, efterhånden som isolationsprocessen skrider frem. I den indledende fase af isolationsprocessen (105-150 μm mikrosigte) var stykker bladvæv fremherskende i den isolerede del (figur 9A) i modsætning til det endelige isolationsprodukt, som næsten udelukkende bestod af isolerede trichomer (figur 9C). Der skal udvises omhu for at validere, at de isolerede prøver er kontamineringsfri (figur 9B).
Selvom trichometætheden ikke blev kvantificeret i denne undersøgelse, kan kvaliteten af de isolerede kirtelcapitate stilkede og siddende trichomer i det endelige isolationstrin observeres i figur 10. Renheden kan sammenlignes med den, der opnås med trichomeisolering ved anvendelse af en konventionel protokol12 (figur 10C). I den nuværende protokol bevares den sarte stilkede trichomehovedstruktur, og hele hovederne på den isolerede stilkede trichome er synlige (figur 10D), mens den komplette trichomehovedstruktur mangler ved hjælp af den konventionelle protokol, og kun skivecellerne er til stede (figur 10E). Udbyttet kan også øges kraftigt, da brugen af tøris og LN fjerner grænsen for plantemateriale, der kan ekstraheres. En yderligere fordel ved vores ikke-vandige protokol er, at den kun bruger tøris og LN, og derfor er der ingen resterende komponenter i isolationsmediet tilbage, når de fordamper. Brug af LN forhindrer frigivelse af klæbrige sekundære metabolitter, der kan føre til aggregering af trichomerne13. I denne protokol blev de isolerede trichomer i det sidste isolationstrin genfundet som et tørt fint pulver.
De ekstremt lave temperaturer, der opretholdes i hele denne protokol, vil sandsynligvis være tilstrækkelige til at opfylde målene for konventionelle buffermedier - forhindre RNA-nedbrydning (så længe prøverne holdes nedsænket) og lette molekylære anvendelser nedstrøms. For at validere denne antagelse ekstraherede vi RNA fra de isolerede trichomer og estimerede RNA-integriteten ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits. De opnåede høje RIN-værdier (9,4 til 10) og distinkt gelkromatografi (figur 11) indikerer tydeligt en høj RNA-integritet. RNA-prøverne blev yderligere analyseret af RNAseq, og >20 M læsninger af høj kvalitet blev opnået fra alle biblioteker.
For at validere, at mRNA'et fra den isolerede trichomefraktion faktisk er beriget med trichome-udtrykte gener, sammenlignede vi vores genekspressionsresultater for blomsterstanden og tilsvarende isolerede stilkede trichomer med tidligere resultater præsenteret af Livingston et al.14, som karakteriserede genekspressionen af oprensede trichomer af cannabis (tilpasset fra deres supplerende tabel 1 ). Deres protokol bestod af blanding i vandig buffer, filtrering gennem sigter og endelig trichomerensning ved hjælp af en Percoll-gradient. Trichome-udtrykte gener blev karakteriseret som de mest korrelerede (p > 0,95) med genekspressionen af cannabidiolsyresyntase (CBDAS), en trichome-specifik genmarkør14. Sammenligningen af genekspression mellem resultaterne opnået med denne protokol og dem, der præsenteres i Livingston et al.14, viser, at de 12 højest berigede gener i vores trichomefraktion også blev beriget i Livingston et al. studie14, herunder trichomemarkørgenet CBDAS (tabel 1). Navnlig blev der opnået en betydeligt højere berigelsesgrad fra denne protokol. Disse resultater bekræfter gyldigheden af den nuværende protokol til undersøgelse af trichome-beriget genekspression.
Derudover sammenlignede vi ekspressionsdata for fem actingener af cannabis, da actin ofte bruges som referencegen til transkriptomundersøgelser (tabel 2). Vores resultater for både isolerede stilkede og siddende trichomer var sammenlignelige med dem, der blev rapporteret af Livingston et al. studie14.
Endelig beregnede vi ekspressions- og trichomeberigelsesdata for klorofyl a-b-bindende proteinfamiliegener, som formodentlig ikke er trichomeberigede (tabel 3). Faktisk viste de 12 medlemmer af denne genfamilie en trichome-berigelsesfaktor på <1, der tjener som en negativ kontrol for trichome-berigelse. Disse kombinerede resultater indikerer de unikke ekspressionsmønstre for blomsterstanden og isolerede trichomefraktioner og understøtter trichomeintegriteten og kvaliteten af den isolerede trichomefraktion.
Figur 1: Opsætning til ilægning af 1 L glasbægerglas. 1 mm skærmdørnet er fastgjort til siderne af glasbægeret via et par elastikker (ikke vist). 1 L glasbægerglasset skal lægges lodret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Opsætning af melsigteren. Melsigtet er forsynet med en 350 μm mikrosigte via elastikker i bunden (ikke vist). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Opsætning af det første trin i trichome-isolation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Opstilling af glasbægeret. Glasbægeret er udstyret med tre lag 1 mm skærmdørsnet (myggestik) fastgjort via elastikker ved åbningen. Bægerglassets åbning peger nedad. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Opsætning af mikrosigtekeglestrukturen, der anvendes til trichomeisolering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Opsætning til dyppe- og rystebevægelse af mikrosigten, der indeholder isolerede trichomer. Den vandrette/lodrette bevægelse skal ligne en teposeinfusion. Opsætningen er identisk for hver anvendt maskestørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Opsætning til overførsel af de endelige isolerede trichomer. De sidste isolerede trichomer overføres til et mærket 1,5 ml rør. Alle redskaber skal forkøles med LN. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Rutediagram, der skitserer protokollen. Isolering af kirtelcapitate trichomer fra C. Sativa involverer tre trin: (1) den indledende løsrivelse af trichomerne fra plantekilden og passage via to sigter (1 mm og 350 μm), (2) passage af plantematerialet via fem mikrosigter med faldende porestørrelser (150 μm, 105 μm, 80 μm, 65 μm og 50 μm) og (3) opsamling af de isolerede trichomer i et forkølet 1,5 ml rør. Tilbageholdt væv fra et hvilket som helst mikrosigtestadie kan ligeledes opsamles. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Mikroskopibilleder af de isolerede trichomer ved hjælp af den nuværende protokol. (A, B, C) Kirtelcapitate sessile trichomes fra C. sativa fan blade. A) Midtisolering fra mikrosigter med porestørrelser fra 105 μm til 150 μm. Bemærk tilbageholdelsen af store mængder grønt, ikke-trichome-materiale. B) Afslutning af isolation fra mikrosigter med porestørrelser fra 50 μm til 65 μm, forurenet med plantekilde (rød pil) og C) fri for kontaminering. Skalastænger = (A) 100 μm, (B,C) 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Mikroskopibilleder af de isolerede trichomer. (A,B) Kirtelcapitate trichomer fra C. sativa: (A) stilket type, isoleret ved hjælp af den nuværende protokol, og (B) sessile type, isoleret ved hjælp af den aktuelle protokol. (C) Stilkede trichomer isoleret ved hjælp af en konventionel protokol. Det lave udbytte og manglen på kompromisløse hoveder på trichomerne er tydelige. (D,E) Stalkede kirtelcapitate trichomer isoleret ved hjælp af (D) nærværende protokol og (E) den konventionelle protokol. F) Kirtelstilkede trichomer isoleret fra 65 μm til 105 μm mikrosigter (nærbillede). Bemærk den høje isolering af stilkede trichomer med løsrevne hoveder og stilkdele. De røde pile angiver cystolitiske trichomer, de blå pile angiver et par stilkdele fra kirtelkapitælen stilkede trichomer, og de gule pile angiver adskilte skiveceller. Skalastænger = (A,C,D,E,F) 100 μm, (B) 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 11: Analyse af integriteten af RNA ekstraheret fra trichomerne. Kromatografer og geler af ekstraherede RNA-prøver fra kirtelkapitulerede stilkede og siddende trichomer isoleret ved hjælp af denne protokol. Resultater for RNA fra (A-D) de stilkede trichomer af de fire kultivarlinjer, der anvendes i denne undersøgelse, henholdsvis CS-11, CS-12, CS-13 og CS-14, og (E-H) de sessile trichomer, CS-11, CS-12, CS-13 og CS-14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Sammenligning af den trichome-berigede genekspression opnået med RNAseq under anvendelse af nærværende protokol med resultaterne opnået af Livingston et al.14. De 12 gener, der viser den højeste korrelation til cannabidiolsyresyntase (CBDAS) ekspression af Livingston et al.14 (fra deres supplerende tabeldata S4, tilpasset med tilladelse fra Wiley-udgivere), betragtes som en trichome-specifik genmarkør, blev valgt til sammenligning. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Sammenligning af genekspression (FPKM) af fem cannabisactingener af isolerede stilkede og sessile trichomer fra denne protokol (vores genekspressionsdata fra cannabissorten CS-11 11 (Var CS-11)) med tidligere offentliggjorte resultater tilpasset fra Livingston etal.14. Resultaterne af Livingston et al.14 blev præsenteret baseret på Finola FN-referencegenomet, og deres data blev oversat til CS10.2-referencegenomet. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: Genekspression (FPKM) af cannabisklorofyl a-b-bindende gener af hele blomsterstande og isolerede stilkede trichomer fra denne protokol (vores genekspressionsdata fra Var CS-11). Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenlignet med de aktuelt tilgængelige trichome-isolationsprotokoller er to hovedændringer beskrevet i denne protokol. Disse omfatter frigørelse af trichomerne fra plantematerialet ved hjælp af tøris i det indledende trin og erstatning af LN for det almindeligt anvendte flydende buffermedium. Den første ændring for C. sativa trichome rensning er baseret på en tidligere protokol, der introducerede brugen af knust tøris til at løsne trichomerne fra geranium pedicels5. Mens traditionelle trichome-isolationsprotokoller generelt bruger et lille (50 ml) reagensglas, blev der anvendt et 1 L glasbægerglas i denne undersøgelse med en generøs mængde knust tøris, hvilket gjorde det muligt at behandle et større volumen oprindeligt plantemateriale (op til 10 g). Desuden blev der i den nuværende protokol indført to yderligere passager af trichomerne gennem mikrosigter i det første isolationstrin. Det første trin anvender en lodret op-og-ned kraftig saltshaker-lignende bevægelse, og det andet anvender en vandret sigtebevægelse gennem mikrosigten i melsigten. De kombinerede vandrette og lodrette sigtebevægelser foreslås at fremme en forbedret adskillelse baseret på trichomestørrelse og form.
Den anden, mest betydningsfulde ændring vedrører isolationsmediet, hvori passagen gennem mikrosigterne udføres. I denne protokol erstattes det konventionelle vandige isolationsmedium fuldstændigt med LN. En tidligere protokol8 brugte også LN i det første trin til trichomeisolering, adskillelse af trichomer fra plantematerialet (ved at rive blomstermaterialet mod en maskesigte), men fortsatte med en væskebufferekstraktion og Percoll-densitetsseparation. Ved at erstatte LN med det konventionelle isolationsmedium elimineres behovet for særlige procedurer forbundet med de toksiske komponenter i det konventionelle isolationsmedium, hvilket muliggør en afslappet arbejdsgang og høj gennemstrømning.
Et centralt træk ved denne protokol er afhængig af tørisens og LN's tilbøjelighed til hurtigt at sublimere ved stuetemperatur. Denne funktion muliggør deres generøse anvendelse gennem hele isolationsprocessen. I modsætning hertil ville anvendelse af en stor del af den konventionelle isolationsbuffer føre til tekniske komplikationer i forbindelse med håndteringen af dens store mængder.
Mens isolationsprocessen i denne protokol fremmer bevarelsen af den skrøbelige hovedstruktur af kirtelcapitaten stilket trichome, fremmer de konventionelle protokoller adskillelsen af diskcellerne fra det resterende kirtelmateriale, som let vaskes væk og kun efterlader diskcellerne. Dette fænomen kan tydeligt ses i vores resultater, der sammenligner en konventionel isolationsprotokol med vores nye protokol (figur 10D, E). Udover den mikroskopiske observation indikerer kvalitetsanalysen af RNA'et ekstraheret fra trichomerne (isoleret ved hjælp af denne protokol) tydeligt, at RNA-integriteten bevares under isolationsprocessen, og at den er egnet til transkriptomisk analyse.
Desuden indikerer genekspressionsresultaterne fra vores isolerede trichomefraktion, at fraktionen er højt beriget i etablerede trichome-udtrykte gener (tabel 1), og at ikke-trichome-udtrykte gener ikke er repræsenteret (tabel 3).
Den største begrænsning ved denne protokol er dens eksklusive egnethed til isolering af trichomer i henhold til deres tilbøjelighed til at passere gennem mikrosigter. Selvom protokollen ikke kan anvendes direkte på trichomeisolering ved hjælp af en densitetsgradient, er den egnet til isolering af trichomerne før densitetsgradienttrinnet, hvis det er nødvendigt. I denne undersøgelse gennemgik trichomerne, der blev isoleret ved hjælp af denne protokol, ikke en proteomisk karakterisering, og deres egnethed til en sådan anvendelse skal verificeres. Da RNA-prøverne ekstraheret fra både stilkede og siddende trichomer imidlertid ikke udviste nogen nedbrydning, som det fremgår af komatograferne og de høje RIN-værdier, kan det antages, at trichomerne isoleret med denne protokol sandsynligvis opfylder de krav, der er nødvendige for proteomisk analyse.
Isolationsgraden (fra den oprindelige plantekilde og andre typer trichomer) af kirtelcapitate sessile trichomes fra ventilatorbladene er meget høj, da ventilatorbladene mangler kirtelkapitulenten stilket trichome type15,16, og de cystolitiske og pæreformede trichomer isoleres let fra de sessile trichomer på grund af deres strukturelle og størrelsesforskelle. Med hensyn til isolering af trichomer af kirtelcapitate stilkede er det imidlertid bedst at behandle deres isolationsgrad som berigelse, da plantekilden, den modne kvindelige blomsterstand, indeholder alle fire trichometyper ud over præstilktype14. Det er indlysende, at de fleste af de isolerede kirtelcapitattrichomer er af stilktypen, da deres forhøjede position (i forhold til de epidermalbundne sessile trichomer) øger sandsynligheden for, at de kolliderer med en tørispartikel og løsner sig fra planten. Desuden betragtes skæringspunktet, der forbinder hovedet og stilkdelene af den stilkede trichome, som et svaghedspunkt forbundet med abscissionen af kirtelhovedet17. Det ville således være nøjagtigt at henvise til den stilkede trichome-del som en højt beriget fraktion med potentielt lav forurening af den siddende type. Der blev imidlertid ikke foretaget yderligere analyser for at validere denne antagelse.
Den nuværende protokols egnethed til at udvinde kirteltrichomer fra andre plantearter er endnu ikke fastlagt. Den høje trichometæthed i C. sativa bidrager formodentlig til succesen med den nuværende protokol. Det forekommer imidlertid usandsynligt, at dette er den eneste grund, da en relativt stor plantematerialekilde (op til 10 g pr. isolationscyklus) kan behandles effektivt. Andre undersøgelser har præsenteret detaljerede protokoller til isolering af forskellige trichometyper fra andre planter, for eksempel rosetbladtrichomer fra Arabidopsis thaliana18,19. Mens anvendeligheden af den nuværende protokol til isolering af andre trichome-typer ikke blev undersøgt i dette arbejde, vil elementer præsenteret i dette arbejde, især erstatningen af LN for isolationsbufferen, sandsynligvis forbedre trichome-isolationsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender økonomisk støtte fra CannabiVar Ltd. Alt plantemateriale blev generøst leveret af professor Hinanit Koltai fra Volcani Center, Israel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
