Summary
Viene presentato un protocollo per l'isolamento e l'arricchimento conveniente e ad alto rendimento dei tricomi ghiandolari e sessili da Cannabis sativa. Il protocollo si basa su un'estrazione secca e non tampone di tricomi utilizzando solo azoto liquido, ghiaccio secco e setacci di nylon ed è adatto per l'estrazione dell'RNA e l'analisi trascrittomica.
Abstract
Questo articolo presenta un protocollo per l'isolamento e l'arricchimento conveniente e ad alto rendimento dei tricomi ghiandolari capitati e sessili da Cannabis sativa. Le vie biosintetiche per il metabolismo dei cannabinoidi e dei terpeni volatili sono localizzate principalmente nei tricomi della cannabis e i tricomi isolati sono utili per l'analisi del trascrittoma. I protocolli esistenti per isolare i tricomi ghiandolari per la caratterizzazione trascrittomica sono scomodi e forniscono teste di tricoma compromesse e una quantità relativamente bassa di tricomi isolati. Inoltre, si basano su costosi apparati e mezzi di isolamento contenenti inibitori proteici per evitare la degradazione dell'RNA. Il presente protocollo suggerisce di combinare tre singole modifiche per ottenere una grande quantità di dimostri ghiandolari isolati e tricomi sessili rispettivamente dalle infiorescenze femminili mature e dalle foglie a ventaglio di C. sativa. La prima modifica prevede la sostituzione dell'azoto liquido per il mezzo di isolamento convenzionale per facilitare il passaggio dei tricomi attraverso i microsetacci. La seconda modifica prevede l'uso di ghiaccio secco per staccare i tricomi dalla fonte vegetale. La terza modifica prevede il passaggio consecutivo del materiale vegetale attraverso cinque micro-setacci di dimensioni dei pori decrescenti. L'imaging microscopico ha dimostrato l'efficacia della tecnica di isolamento per entrambi i tipi di tricomi. Inoltre, la qualità dell'RNA estratto dai tricomi isolati era appropriata per l'analisi trascrittomica a valle.
Introduction
I tricomi ghiandolari sono strutture simili a capelli presenti nelle piante che contengono molti metaboliti secondari1 e rappresentano una preziosa banca di nuovi geni ed enzimi biosintetici2. Nella Cannabis, la biosintesi degli importanti metaboliti secondari, cannabinoidi3 e terpeni4, è localizzata nei tricomi. Considerando il ruolo dei tricomi nel determinare la qualità della cannabis sia per usi medicinali che ricreativi, lo studio dell'espressione genica dei tricomi è interessante. Per caratterizzare l'espressione di geni specifici del tricomi, i tricomi di interesse devono prima essere isolati. I protocolli di isolamento dei tricomi sono stati descritti per la prima volta già nel 19925 e i loro ultimi sviluppi sono stati recentemente rivisti2. In generale, i protocolli per l'estrazione dei tricomi ghiandolari per la caratterizzazione trascrittomica possono essere suddivisi in due fasi sequenziali distinte. Il primo passo prevede un'accurata separazione fisica dei tricomi dal tessuto vegetale. Questo passaggio può essere eseguito utilizzando ghiaccio secco5, perle di vetro con un apparato commerciale6,7, macinando il materiale vegetale contro un setaccio a maglie8 o vorticando il tessuto vegetale in un tampone di isolamento9. La seconda fase prevede una separazione più raffinata dei tricomi di interesse dal residuo vegetale microscopico e / o da altri tipi di tricomi. Questo passaggio può essere eseguito utilizzando centrifugazione a gradiente di densità 8,10 o setacci di varie dimensioni 7,9. A causa dell'estrema sensibilità dell'RNA nei tessuti trasformati agli agenti degradanti, queste due fasi sequenziali sono solitamente condotte nel mezzo di isolamento ghiacciato, spesso in presenza di inibitori proteici4.
I protocolli convenzionali di isolamento dei tricomi richiedono, oltre alle temperature gelide, grandi quantità di mezzo di isolamento per garantire una procedura di estrazione efficiente. La combinazione di questi componenti si traduce in un processo di isolamento arduo e dispendioso in termini di tempo che ostacola l'elevata produttività. Presentare un protocollo alternativo di isolamento dei tricomi semplice e intuitivo è, quindi, probabile che sia utile per vari aspetti associati alla caratterizzazione dei tricomi. Il presente articolo mira a offrire un protocollo alternativo per isolare i tricomi ghiandolari peduncolari e sessili dalla Cannabis sativa combinando e integrando diversi elementi dei protocolli convenzionali. Questi elementi includono il ghiaccio secco5, il passaggio dei tricomi attraverso diversi micro-setacci con dimensioni dei pori decrescenti 7,9 e la sostituzione dell'azoto liquido (LN) per il mezzo di isolamento8.
La novità dell'attuale protocollo di isolamento dei tricomi, rispetto ai protocolli convenzionali, si presenta in diversi modi. Questo protocollo è conveniente, in quanto non richiede componenti pericolosi. La procedura può essere condotta in laboratorio con precauzioni minime e facilita l'elevata produttività. La sostituzione di LN per il mezzo di isolamento liquido standard garantisce l'integrità dei tricomi durante tutto il processo di isolamento, consentendo una successiva analisi trascrittomica. Dopo la sublimazione del LN e del ghiaccio secco, i tricomi isolati vengono lasciati liberi da residui nocivi. Inoltre, la propensione di LN a sublimare a temperatura ambiente ne consente l'uso generoso in tutto il protocollo. Al contrario, l'utilizzo di grandi volumi di mezzi di isolamento convenzionali genera difficoltà pratiche nella sua gestione. Infine, il protocollo riduce la separazione della cellula del disco dalla restante fragile struttura della testa del tricoma ghiandolare, consentendo la conservazione del contenuto dello spazio di testa.
Questo protocollo è presentato in modo dettagliato passo-passo progettato per aiutare la pratica tecnica di isolamento dei tricomi capitati ghiandolari di C. sativa. Il protocollo fornisce un flusso di lavoro gestibile che si traduce in tricomi isolati con un'alta concentrazione e purezza che sono appropriati per l'analisi molecolare a valle.
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Protocol
NOTA: Il materiale vegetale utilizzato in questo studio consisteva in quattro ceppi di C. sativa ARO-Volcani (CS-11, CS-12, CS-13 e CS-14) che sono stati coltivati nel Volcani Center, Israele, come descritto altrove11. I tricomi ghiandolari capitati sono stati isolati dalle infiorescenze a fioritura matura e i tricomi ghiandolari capitati sono stati isolati da grandi foglie a ventaglio di piante madri mature non fiorite. Tutto il materiale vegetale è stato raccolto di fresco e immediatamente conservato a -80 °C.
ATTENZIONE: ghiaccio secco e LN sono utilizzati in tutto il protocollo. Queste sostanze sono estremamente pericolose. I tricomi isolati possono contenere particelle di ghiaccio secco che possono creare una pericolosa pressione di gas quando vengono inserite in tubi sigillati; Pertanto, tutti i tappi devono essere perforati con ago. Si consiglia vivamente l'uso di occhiali protettivi, abbigliamento da laboratorio appropriato e guanti per la manipolazione a temperature estremamente basse.
1. Impostazione per la separazione iniziale dei tricomi dal materiale vegetale
- Schiacciare un blocco di ghiaccio secco in piccoli fiocchi fini usando un martello e un oggetto piatto duro in un contenitore di plastica da 5 litri.
- Setacciare i fiocchi di ghiaccio secco fine (più piccoli di 5 mm) dal ghiaccio secco non frantumato con un colino grande (attraverso pori più piccoli di 5 mm) in un altro contenitore di plastica da 5 L. Versare circa 200 cm3 (200 mL) dei fiocchi di ghiaccio secco in un becher di vetro verticale da 1 L.
- Aggiungere fino a 10 g di infiorescenze congelate di C. sativa (d'ora in poi denominate materiale vegetale) sul primo strato di ghiaccio secco tritato e coprire con un ulteriore strato di 200 cm3 di ghiaccio secco finemente tritato.
- Coprire l'apertura del becher di vetro da 1 litro con due o tre strati di zanzariera da 1 mm e fissarla ai lati esterni della tazza di vetro con elastici (Figura 1).
- Versare LN in un grande contenitore di acciaio inossidabile a fondo tondo (vedi Tabella dei materiali), dove verranno raccolti i tricomi isolati.
- Inserire una maglia da 350 μm in un sifatto/colino setaccio per coprire la rete del setaccio della farina dal basso (Figura 2). Se è disponibile un setaccio per farina con un anello di plastica staccabile, inserire la maglia da 350 μm in modo che sia fissata sotto la rete del setaccio della farina. In caso contrario, fissare la maglia da 350 μm alla circonferenza del setaccio di farina con elastici.
- Posizionare il setaccio della farina sopra il grande contenitore di acciaio inossidabile a fondo tondo riempito con LN (Figura 3). Assicurarsi che la larghezza del contenitore superi quella del setaccio della farina per ridurre al minimo la perdita della massa setacciata all'esterno del contenitore in acciaio inossidabile a fondo tondo.
2. Separazione dei tricomi dal materiale vegetale
- Agitare il bicchiere da 1 litro con l'apertura rivolta verso il basso verso il setaccio della farina come se si utilizzasse una grande saliera (Figura 4).
- Mettere da parte il becher di vetro da 1 L ogni 2-3 minuti per consentire la setacciatura del ghiaccio secco tritato e del materiale vegetale accumulato sul setaccio della farina.
- Setacciare orizzontalmente il setaccio della farina per facilitare il passaggio del materiale vegetale nel LN nel contenitore in acciaio inossidabile a fondo tondo sottostante.
- Aggiungere LN al contenitore in acciaio inossidabile e ghiaccio secco frantumato al becher di vetro da 1 L quando i loro livelli si esauriscono. Reintegrare il materiale vegetale usato nel becher di vetro con altri 10 g di materiale vegetale fresco quando il materiale vegetale sul setaccio della farina è esaurito. Il rifornimento di solito non deve essere ripetuto più di due volte.
- Ripetere i passaggi 2.1-2.4 fino a quando una quantità sufficiente di tricomi arricchiti è stata raccolta nel contenitore di acciaio inossidabile a fondo tondo. Generalmente, 20 g di materiale vegetale fresco sono sufficienti per l'estrazione dell'RNA e l'analisi del trascrittoma.
- Verificare che ci sia una sostanza bianca simile alla polvere (costituita da detriti vegetali, tricomi ghiandolari e ghiaccio secco frantumato) sul fondo del contenitore di acciaio inossidabile immerso nel LN. Un'osservazione microscopica aiuterà a determinare se è stata raccolta una quantità sufficiente di tricomi; Tuttavia, questo passaggio potrebbe ostacolare il flusso del protocollo. Di solito, 10-20 g di materiale vegetale iniziale sono sufficienti per la maggior parte degli isolamenti; Tuttavia, ci possono essere differenze nella densità dei tricomi delle piante.
NOTA: da questo punto, l'esperimento può essere sospeso e riavviato in seguito. In caso di pausa per un breve periodo, è necessario aggiungere quantità adeguate di LN in modo che i tricomi rimangano sommersi. In alternativa, i tricomi possono essere raccolti e conservati a -80 °C per un massimo di 3 mesi per un uso successivo, come descritto nella fase 5.
3. Separazione dei tricomi capitati ghiandolari (peduncoli e sessili) da altri tipi di tricomi, come tricomi bulbosi e cistolitici e detriti
- Aggiungere una piccola quantità di LN in un piccolo contenitore pulito in acciaio inossidabile a fondo rotondo.
- Piegare due volte un microsetaccio da 40 cm x 40 cm con maglie da 150 μm per ottenere una piega di 20 cm x 20 cm e aprirlo. Assicurati che assomigli a una forma a cono (Figura 5).
- Fissare il cono di rete al bordo del contenitore in acciaio inossidabile a fondo rotondo con una o due mollette in modo che la parte aperta del cono sia in posizione verticale e la sua parte appuntita sia parzialmente immersa nel LN.
- Versare delicatamente il LN e la sostanza bianca simile alla polvere dal punto 2.6 nel cono micro-setaccio.
- Applicare delicatamente un pennello largo per raccogliere e trasferire il materiale vegetale rimanente dal primo contenitore nel cono a maglie da 150 μm.
- Aggiungere altro LN al primo contenitore e ripetere il movimento di spazzolatura fino a quando tutto il materiale vegetale viene trasferito al cono micro-setaccio.
- Staccare con attenzione la molletta dal coperchio del contenitore e aprire il cono di micro-setaccio in modo che i tricomi si trovino nel mezzo del micro-setaccio aperto. Tenere insieme tutti e quattro gli angoli del microsetaccio in modo che la parte centrale contenente i tricomi rimanga immersa nel LN (Figura 6).
- Mentre si tengono tutti e quattro gli angoli del micro-setaccio, immergere delicatamente e agitare il micro-setaccio nel LN nel contenitore di acciaio come se si stesse infondendo una bustina di tè. Continuare questo movimento di immersione/agitazione (verticale e orizzontale) per 1 minuto. C'è un compromesso tra la qualità e la quantità dell'isolamento. Movimenti di immersione più lunghi possono comportare maggiori quantità di tricomi, ma il loro grado di isolamento può essere più scarso. Nel complesso, 1 min è raccomandato come adeguato sia per la qualità che per la quantità.
NOTA: questo movimento di setacciatura è la parte più critica del protocollo e deve essere eseguito di conseguenza. - Facoltativo: raccogliere i detriti vegetali non setacciati e i tricomi più grandi (ancora immersi nel LN) che sono avvolti al centro del microsetaccio in una provetta da 13 ml o 50 ml e conservare a -80 ° C per un uso futuro.
ATTENZIONE: Per evitare l'accumulo di gas sotto pressione (dal ghiaccio secco e dai residui di LN), forare un foro nel cappuccio della provetta con un ago sterilizzato. Il tappo può essere sostituito una volta che la pressione si è ridotta, che di solito è dopo 24 h.
4. Passaggio di tricomi attraverso micro-setacci di dimensione dei pori decrescente
- Trasferire sequenzialmente i tricomi setacciati immersi nel LN sul fondo del piccolo contenitore in acciaio inossidabile a fondo tondo attraverso microsetacci con dimensioni dei pori decrescenti (105 μm, 80 μm, 65 μm e 50 μm), nello stesso modo presentato nella fase 3.
5. Raccolta dei tricomi desiderati
- Rimuovere i tricomi desiderati immersi nel LN e avvolti nel microsetaccio da 50 μm utilizzando un cucchiaio pre-refrigerato (in LN). Mettili su un piatto pulito.
NOTA: In questa fase finale di isolamento, i tricomi desiderati vengono raccolti dal setaccio. - Trasferire rapidamente i tricomi simili a polvere in un tubo marcato pre-raffreddato da 1,5 mL tramite una spatola pre-refrigerata o una scoopula inserita nel tubo (Figura 7). Conservare immediatamente le provette a -80 °C per ulteriori studi.
NOTA: nella Figura 8 viene fornito un grafico schematico del flusso di lavoro che illustra l'intero protocollo di isolamento.
6. Osservazione e analisi dei tricomi purificati
- Posizionare una piccola quantità (10 mg) di tricomi isolati su un vetrino da microscopio usando una spatola pre-raffreddata (tramite LN). Aggiungi una goccia d'acqua e osserva direttamente su un microscopio ottico senza macchiare. Valutare il grado complessivo di isolamento e contaminazione utilizzando ingrandimenti bassi (10x) e alti (40x). L'arricchimento è stimato visivamente dalla quantità relativa di tricomi rispetto al tessuto non tricomico, come mostrato nella Figura 9.
- Eseguire l'estrazione dell'RNA e l'analisi della qualità da 50 mg di tricomi isolati ghiandolari capitati e sessili isolati di C. sativa.
NOTA: Per l'estrazione dell'RNA è stato utilizzato un kit di estrazione commerciale (vedi Tabella dei materiali) che impiega una strategia basata su poli-A di purificazione dell'mRNA.- Risospendere 50 mg dei tricomi isolati nella soluzione di lisi, vortice per 30 s, sonicare in un'unità di pulizia ad ultrasuoni ghiacciata a 35 kHz per 5 minuti ed estrarre l'mRNA dai campioni secondo il protocollo del produttore (vedi Tabella dei materiali).
- Per stimare l'integrità dell'RNA estratto dai tricomi, determinare la concentrazione di RNA, la quantità totale e i valori del numero di integrità dell'RNA (RIN) utilizzando un sistema lab-on-a-chip (vedi Tabella dei materiali).
- Eseguire l'analisi RNAseq delle frazioni di tricomi (opzionale). L'analisi RNAseq e le analisi bioinformatiche delle letture sequenziate possono essere eseguite da servizi di outsourcing standard
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Representative Results
La principale modifica inclusa in questo protocollo rispetto ai protocolli convenzionali di isolamento tricomico è la sostituzione del mezzo di isolamento standard con LN. L'utilizzo di LN come mezzo di isolamento consente un flusso di lavoro rilassato, perché finché i campioni sono immersi in LN, è improbabile che si verifichi degradazione metabolica. Inoltre, poiché il protocollo evita i componenti pericolosi (cioè acido aurintricarbossilico e β-mercaptoetanolo) utilizzati nel tradizionale mezzo di isolamento dei tricomi, il lavoro non è limitato a una cappa chimica. Tuttavia, è importante prendere le precauzioni necessarie durante la manipolazione di ghiaccio secco e LN.
Per valutare i vantaggi del presente protocollo, i risultati dell'isolamento dei tricomi del presente protocollo sono stati confrontati con quelli ottenuti utilizzando una procedura convenzionale di isolamento tricomico (che utilizzava un tampone acquoso, perle di vetro e un setaccio fine per l'isolamento dei tricomi)12, inizialmente utilizzando un microscopio ottico. Un confronto dei componenti delle diverse fasi di isolamento tramite ispezione al microscopio ottico illustra l'aumento del grado di isolamento dei tricomi man mano che il processo di isolamento progredisce. Nella fase iniziale del processo di isolamento (micro-setaccio da 105-150 μm), pezzi di tessuto fogliare erano predominanti nella porzione isolata (Figura 9A), in contrasto con il prodotto di isolamento finale, che era composto quasi interamente da tricomi isolati (Figura 9C). Si deve prestare attenzione per convalidare che i campioni isolati siano privi di contaminazione (Figura 9B).
Sebbene la densità dei tricomi non sia stata quantificata in questo studio, la qualità dei tricomi ghiandolari e sessili isolati nella fase finale di isolamento può essere osservata nella Figura 10. La purezza può essere paragonata a quella ottenuta con l'isolamento tricomico utilizzando un protocollo convenzionale12 (Figura 10C). Nel presente protocollo, la delicata struttura della testa del tricomo peduncolato viene mantenuta e sono visibili tutte le teste del tricomo a peduncolo isolato (Figura 10D), mentre usando il protocollo convenzionale, manca la struttura completa della testa del tricomo e sono presenti solo le celle del disco (Figura 10E). La resa può anche essere notevolmente aumentata poiché l'uso di ghiaccio secco e LN ovvia al limite di materiale vegetale che può essere estratto. Un ulteriore vantaggio del nostro protocollo non acquoso è che utilizza solo ghiaccio secco e LN e, pertanto, non rimangono componenti residui del mezzo di isolamento una volta evaporati. L'uso di LN impedisce il rilascio di metaboliti secondari appiccicosi che possono portare all'aggregazione dei tricomi13. Nel presente protocollo, i tricomi isolati nella fase finale di isolamento sono stati recuperati come polvere fine secca.
Le temperature estremamente basse mantenute durante il presente protocollo sono probabilmente sufficienti per raggiungere gli obiettivi dei mezzi tampone convenzionali che prevengono la degradazione dell'RNA (purché i campioni siano tenuti sommersi) e facilitano le applicazioni molecolari a valle. Per convalidare questa ipotesi, abbiamo estratto l'RNA dai tricomi isolati e stimato l'integrità dell'RNA utilizzando kit disponibili in commercio. Gli elevati valori RIN ottenuti (da 9,4 a 10) e la cromatografia su gel distinta (Figura 11) indicano chiaramente un'elevata integrità dell'RNA. I campioni di RNA sono stati ulteriormente analizzati da RNAseq e sono state ottenute letture di alta qualità di >20 M da tutte le librerie.
Al fine di convalidare che, effettivamente, l'mRNA dalla frazione di tricomi isolati è arricchito in geni espressi dai tricomi, abbiamo confrontato i nostri risultati di espressione genica per l'infiorescenza e i corrispondenti tricomi a peduncolo isolati con i precedenti risultati presentati da Livingston et al.14, che caratterizzavano l'espressione genica dei tricomi purificati della cannabis (adattati dalla loro Tabella supplementare 1 ). Il loro protocollo consisteva nella miscelazione in tampone acquoso, filtraggio attraverso setacci e, infine, purificazione dei tricomi utilizzando un gradiente di Percoll. I geni espressi dai tricomi sono stati caratterizzati come quelli più altamente correlati (p > 0,95) con l'espressione genica della cannabidiolica sintasi (CBDAS), un marcatore genico14 specifico del tricomi. Il confronto dell'espressione genica tra i risultati ottenuti con il presente protocollo e quelli presentati in Livingston et al.14 mostra che i 12 geni più altamente arricchiti nella nostra frazione di tricomi sono stati arricchiti anche nello studio 14 di Livingston et al., incluso il gene marcatore tricomo CBDAS (Tabella 1). In particolare, dal presente protocollo è stato ottenuto un rapporto di arricchimento significativamente più elevato. Questi risultati confermano la validità del presente protocollo per lo studio dell'espressione genica arricchita di tricomi.
Inoltre, abbiamo confrontato i dati di espressione di cinque geni di actina della cannabis, poiché l'actina è spesso usata come gene di riferimento per gli studi sul trascrittoma (Tabella 2). I nostri risultati sia per i tricomi isolati peduncolati che per quelli sessili erano paragonabili a quelli riportati dallo studio Livingston et al.14.
Infine, abbiamo calcolato i dati di espressione e arricchimento dei tricomi per i geni della famiglia delle proteine leganti la clorofilla a-b, che presumibilmente non sono arricchiti con tricomi (Tabella 3). Infatti, i 12 membri di questa famiglia di geni hanno mostrato un fattore di arricchimento dei tricomi di <1, che funge da controllo negativo per l'arricchimento dei tricomi. Questi risultati combinati indicano i modelli di espressione unici dell'infiorescenza e delle frazioni isolate di tricomi e supportano l'integrità e la qualità del tricomi isolato.
Figura 1: Configurazione per il caricamento del becher di vetro da 1 L. La rete dello schermo da 1 mm è fissata ai lati del becher di vetro tramite alcuni elastici (non mostrati). Il becher di vetro da 1 L deve essere caricato in posizione verticale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Messa a punto del setaccio della farina. Il setaccio della farina è dotato di un microsetaccio da 350 μm tramite elastici nella parte inferiore (non mostrato). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Impostazione della prima fase dell'isolamento dei tricomi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Configurazione del becher di vetro. Il bicchiere di vetro dotato di tre strati di rete schermo-porta (zanzara) da 1 mm fissati tramite elastici all'apertura. L'apertura del becher è rivolta verso il basso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Messa a punto della struttura a cono a microsetaccio utilizzata per l'isolamento dei tricomi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Impostazione per il movimento di immersione e agitazione del microsetaccio contenente tricomi isolati. Il movimento orizzontale / verticale dovrebbe assomigliare a un infuso di bustine di tè. La configurazione è identica per ogni dimensione di maglia utilizzata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Impostazione per il trasferimento dei tricomi isolati finali. I tricomi isolati finali vengono trasferiti in un tubo marcato da 1,5 ml. Tutti gli utensili devono essere pre-refrigerati con LN. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Diagramma di flusso che illustra il protocollo. L'isolamento dei tricomi capitati ghiandolari da C. La sativa prevede tre fasi: (1) il distacco iniziale dei tricomi dalla fonte vegetale e il passaggio attraverso due setacci (1 mm e 350 μm), (2) il passaggio del materiale vegetale attraverso cinque micro-setacci di dimensioni dei pori decrescenti (150 μm, 105 μm, 80 μm, 65 μm e 50 μm) e (3) la raccolta dei tricomi isolati in un tubo pre-refrigerato da 1,5 ml. Allo stesso modo può essere raccolto tessuto trattenuto da uno qualsiasi degli stadi di micro-setaccio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9: Immagini al microscopio dei tricomi isolati utilizzando il protocollo corrente. (A,B,C) Tricomi ghiandolari capitati sessili da foglie a ventaglio di C. sativa. (A) Isolamento intermedio, da microsetacci con dimensioni dei pori comprese tra 105 μm e 150 μm. Si noti la ritenzione di grandi quantità di materiale verde non tricomico. (B) Fine dell'isolamento, da microsetacci con dimensioni dei pori comprese tra 50 μm e 65 μm, contaminati da fonte vegetale (freccia rossa) e (C) esenti da contaminazione. Barre della scala = (A) 100 μm, (B,C) 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 10: Immagini al microscopio dei tricomi isolati. (A,B) Tricomi capitati ghiandolari da C. sativa: (A) tipo peduncolo, isolato utilizzando il protocollo corrente, e (B) tipo sessili, isolato utilizzando il protocollo corrente. (C) Tricomi peduncolati isolati con un protocollo convenzionale. La bassa resa e la mancanza di teste senza compromessi dei tricomi sono evidenti. (D,E) Tricomi ghiandolari capitati peduncolari isolati usando (D) il presente protocollo e (E) il protocollo convenzionale. (F) Tricomi ghiandolari isolati da 65 μm a 105 μm microsetacci (primo piano). Si noti l'elevato isolamento dei tricomi peduncolati, con teste staccate e parti del gambo. Le frecce rosse indicano i tricomi cistolitici, le frecce blu indicano alcune parti del gambo dei tricomi ghiandolari capitati e le frecce gialle indicano celle del disco separate. Barre della scala = (A,C,D,E,F) 100 μm, (B) 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 11: Analisi dell'integrità dell'RNA estratto dai tricomi. Cromatografi e gel di campioni di RNA estratti da tricomi ghiandolari e sessili isolati utilizzando il presente protocollo. Risultati per l'RNA da (A-D) i tricomi peduncolati delle quattro linee di cultivar utilizzate in questo studio, CS-11, CS-12, CS-13 e CS-14, rispettivamente, e (E-H) i tricomi sessili, CS-11, CS-12, CS-13 e CS-14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Confronto dell'espressione genica arricchita di tricomi ottenuta con RNAseq utilizzando il presente protocollo con i risultati ottenuti da Livingston et al.14. I 12 geni che mostrano la più alta correlazione con l'espressione di acido cannabidiolico sintasi (CBDAS) da Livingston et al.14 (dal loro Supplemental Table Data S4, adattato con il permesso degli editori Wiley), considerati un marcatore genetico specifico del tricomi, sono stati scelti per il confronto. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Confronto dell'espressione genica (FPKM) di cinque geni di actina di cannabis di tricomi isolati peduncolati e sessili dal presente protocollo (i nostri dati di espressione genica dalla varietà di cannabis CS-11 11 (Var CS-11)) con i risultati precedentemente pubblicati adattati da Livingston etal.14. I risultati di Livingston et al.14 sono stati presentati sulla base del genoma di riferimento di Finola FN e i loro dati sono stati tradotti nel genoma di riferimento CS10.2. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: Espressione genica (FPKM) dei geni leganti la clorofilla a-b della cannabis di intere infiorescenze e tricomi peduncolati isolati dal presente protocollo (i nostri dati di espressione genica da Var CS-11). Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Rispetto ai protocolli di isolamento tricomico attualmente disponibili, due modifiche principali sono descritte nel presente protocollo. Questi includono il distacco dei tricomi dal materiale vegetale utilizzando ghiaccio secco nella fase iniziale e la sostituzione di LN per il mezzo tampone liquido comunemente usato. La prima modifica per la purificazione dei tricomi di C. sativa si basa su un protocollo precedente che ha introdotto l'uso di ghiaccio secco tritato per staccare i tricomi dai pedicelli di geranio5. Mentre i tradizionali protocolli di isolamento dei tricomi utilizzano generalmente una provetta piccola (50 ml), in questo studio è stato utilizzato un becher di vetro da 1 litro con una generosa quantità di ghiaccio secco frantumato, consentendo di elaborare un volume maggiore di materiale vegetale iniziale (fino a 10 g). Inoltre, nel presente protocollo, sono stati introdotti due passaggi aggiuntivi dei tricomi attraverso micro-setacci nella prima fase di isolamento. Il primo passo impiega un movimento verticale su e giù vigoroso simile a una saliera, e il secondo impiega un movimento di setacciatura orizzontale attraverso il micro setaccio nel setaccio della farina. I movimenti combinati di setacciatura orizzontale e verticale sono suggeriti per promuovere una maggiore separazione in base alle dimensioni e alla forma del tricomi.
La seconda modifica, la più significativa, riguarda il mezzo di isolamento in cui viene condotto il passaggio attraverso i microsetacci. Nel presente protocollo, il mezzo di isolamento acquoso convenzionale è completamente sostituito da LN. Un precedente protocollo8 utilizzava anche LN nella prima fase per l'isolamento dei tricomi, separando i tricomi dal materiale vegetale (grattugiando il materiale floreale contro un setaccio a rete), ma continuava con un'estrazione tampone liquido e la separazione della densità Percoll. La sostituzione di LN al posto del mezzo di isolamento convenzionale elimina la necessità di procedure speciali associate ai componenti tossici del mezzo di isolamento convenzionale, consentendo un flusso di lavoro rilassato e un'elevata produttività.
Una caratteristica fondamentale del presente protocollo si basa sulla propensione del ghiaccio secco e del LN a sublimare rapidamente a temperatura ambiente. Questa caratteristica consente la loro generosa applicazione durante tutto il processo di isolamento. Al contrario, l'utilizzo di una grande quantità del buffer di isolamento convenzionale porterebbe a complicazioni tecniche relative alla gestione dei suoi grandi volumi.
Mentre il processo di isolamento nel presente protocollo promuove la conservazione della fragile struttura della testa del tricoma ghiandolare capitato, i protocolli convenzionali promuovono la separazione delle cellule del disco dal materiale ghiandolare rimanente, che viene facilmente lavato via, lasciando solo le cellule del disco. Questo fenomeno può essere chiaramente visto nei nostri risultati confrontando un protocollo di isolamento convenzionale con il nostro nuovo protocollo (Figura 10D, E). Oltre all'osservazione microscopica, l'analisi di qualità dell'RNA estratto dai tricomi (isolato usando questo protocollo) indica chiaramente che l'integrità dell'RNA viene mantenuta durante il processo di isolamento e che è adatto per l'analisi trascrittomica.
Inoltre, l'espressione genica risultante dalla nostra frazione tricomica isolata indica che la frazione è altamente arricchita in geni espressi dai tricomi stabiliti (Tabella 1) e, reciprocamente, che i geni non espressi dai tricomi non sono rappresentati (Tabella 3).
Il principale limite del presente protocollo è la sua esclusiva idoneità ad isolare i tricomi in base alla loro propensione al passaggio attraverso micro-setacci. Mentre il protocollo non può essere applicato direttamente all'isolamento dei tricomi utilizzando un gradiente di densità, è adatto per isolare i tricomi prima della fase del gradiente di densità, se necessario. In questo studio, i tricomi isolati utilizzando questo protocollo non hanno subito una caratterizzazione proteomica e la loro idoneità per tale applicazione deve essere verificata. Tuttavia, poiché i campioni di RNA estratti sia dai tricomi peduncolati che da quelli sessili non hanno mostrato degradazione, come indicato dai comatografi e dagli alti valori di RIN, si può presumere che i tricomi isolati con il presente protocollo soddisfino i requisiti necessari per l'analisi proteomica.
Il grado di isolamento (dalla fonte vegetale iniziale e da altri tipi di tricomi) dei tricomi sessili capitati ghiandolari dalle foglie a ventaglio è molto alto, poiché le foglie a ventaglio mancano del tricomo ghiandolare capitato a peduncolo tipo15,16, e i tricomi cistolitici e bulbosi sono facilmente isolati dai tricomi sessili a causa delle loro differenze strutturali e dimensionali. Tuttavia, per quanto riguarda l'isolamento dei tricomi ghiandolari capitati di tipo peduncolo, è meglio affrontare il loro grado di isolamento come arricchimento, poiché la fonte vegetale, l'infiorescenza femminile matura, contiene tutti e quattro i tipi di tricomi, oltre al tipo pre-gambo14. È ovvio che la maggior parte dei tricomi capitati ghiandolari isolati sono di tipo peduncolare, poiché la loro posizione elevata (in relazione ai tricomi sessili legati all'epidermia) aumenta la probabilità che si scontrino con una particella di ghiaccio secco e si stacchino dalla pianta. Inoltre, la giuntura che collega la testa e le parti del gambo del tricomo peduncolato è considerata un punto di debolezza associato all'abscissione della testa della ghiandola17. Pertanto, sarebbe corretto riferirsi alla porzione di tricomi peduncolata come una frazione altamente arricchita con contaminazione potenzialmente bassa del tipo sessili. Tuttavia, non sono state condotte ulteriori analisi per convalidare questa ipotesi.
L'idoneità del presente protocollo per estrarre tricomi ghiandolari da altre specie vegetali deve ancora essere determinata. L'alta densità di tricomi in C. sativa presumibilmente contribuisce al successo del presente protocollo. Tuttavia, sembra improbabile che questa sia l'unica ragione, poiché una fonte di materiale vegetale relativamente grande (fino a 10 g per ciclo di isolamento) può essere efficacemente elaborata. Altri studi hanno presentato protocolli dettagliati per isolare diversi tipi di tricomi da altre piante, ad esempio i tricomi a foglia di rosetta da Arabidopsis thaliana18,19. Mentre l'applicabilità del presente protocollo per l'isolamento di altri tipi di tricomi non è stata studiata in questo lavoro, gli elementi presentati in questo lavoro, in particolare la sostituzione di LN per il tampone di isolamento, probabilmente miglioreranno il processo di isolamento dei tricomi.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il sostegno finanziario di CannabiVar Ltd. Tutto il materiale vegetale è stato generosamente fornito dal professor Hinanit Koltai del Volcani Center, Israele.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
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