Summary
Er wordt een protocol gepresenteerd voor de handige en high-throughput isolatie en verrijking van glandulaire capitate stalked en sessiele trichomen van Cannabis sativa. Het protocol is gebaseerd op een droge, niet-bufferextractie van trichomen met alleen vloeibare stikstof, droogijs en nylonzeven en is geschikt voor RNA-extractie en transcriptomische analyse.
Abstract
Dit artikel presenteert een protocol voor de handige en high-throughput isolatie en verrijking van glandulaire capitate stalked en sessiele trichomen van Cannabis sativa. De biosynthetische routes voor cannabinoïde en vluchtig terpeenmetabolisme zijn voornamelijk gelokaliseerd in de Cannabis trichomen, en geïsoleerde trichomen zijn gunstig voor transcriptoomanalyse. De bestaande protocollen voor het isoleren van glandulaire trichomen voor transcriptomische karakterisering zijn onhandig en leveren gecompromitteerde trichoomkoppen en een relatief lage hoeveelheid geïsoleerde trichomen. Bovendien vertrouwen ze op dure apparaten en isolatiemedia die eiwitremmers bevatten om RNA-afbraak te voorkomen. Het huidige protocol stelt voor om drie individuele modificaties te combineren om een grote hoeveelheid geïsoleerde glandulaire capitate stalked en sessiele trichomen te verkrijgen van respectievelijk C. sativa volwassen vrouwelijke bloeiwijzen en waaierbladeren. De eerste wijziging omvat het vervangen van vloeibare stikstof door het conventionele isolatiemedium om de doorgang van trichomen door de microzeven te vergemakkelijken. De tweede wijziging omvat het gebruik van droogijs om de trichomen los te maken van de plantenbron. De derde modificatie houdt in dat het plantmateriaal achtereenvolgens door vijf microzeven van afnemende poriegroottes wordt geleid. Microscopische beeldvorming toonde de effectiviteit van de isolatietechniek voor beide trichoomtypen. Bovendien was de kwaliteit van RNA geëxtraheerd uit de geïsoleerde trichomen geschikt voor downstream transcriptomische analyse.
Introduction
Glandulaire trichomen zijn haarachtige structuren die aanwezig zijn in planten die veel secundaire metabolietenbevatten 1 en een waardevolle bank van nieuwe biosynthetische genen en enzymen2 vertegenwoordigen. In cannabis is de biosynthese van de belangrijke secundaire metabolieten, cannabinoïden3 en terpenen4, gelokaliseerd in de trichomen. Gezien de rol van trichomen bij het bepalen van de kwaliteit van cannabis, zowel voor medicinaal als recreatief gebruik, is de studie van trichomengenexpressie van belang. Om de expressie van trichomenspecifieke genen te karakteriseren, moeten de trichomen van belang eerst worden geïsoleerd. Trichoomisolatieprotocollen werden voor het eerst beschreven in 19925, en hun nieuwste ontwikkelingen zijn onlangs beoordeeld2. Over het algemeen kunnen protocollen voor het extraheren van glandulaire trichomen voor transcriptomische karakterisering worden onderverdeeld in twee verschillende opeenvolgende stappen. De eerste stap omvat een grondige fysieke scheiding van de trichomen van het plantenweefsel. Deze stap kan worden uitgevoerd met droogijs5, glasparels met een commercieel apparaat6,7, het vermalen van het plantmateriaal tegen een gaaszeef8, of het vortexen van het plantenweefsel in een isolatiebuffer9. De tweede stap omvat een meer verfijnde scheiding van de trichomen van belang van de microscopische plantenresten en / of andere trichoomsoorten. Deze stap kan worden uitgevoerd met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie 8,10 of zeven van verschillende groottes 7,9. Vanwege de extreme gevoeligheid van RNA in bewerkte weefsels voor afbrekende middelen, worden deze twee opeenvolgende stappen meestal uitgevoerd in het ijskoude isolatiemedium, vaak in aanwezigheid van eiwitremmers4.
Conventionele trichoomisolatieprotocollen vereisen, naast de ijskoude temperaturen, grote hoeveelheden isolatiemedium om een efficiënte extractieprocedure te garanderen. De combinatie van deze componenten resulteert in een moeizaam, tijdrovend isolatieproces dat een hoge doorvoer belemmert. Het presenteren van een eenvoudig, gebruiksvriendelijk alternatief trichome-isolatieprotocol is daarom waarschijnlijk gunstig voor verschillende aspecten die verband houden met trichoomkarakterisering. Het huidige artikel heeft tot doel een alternatief protocol aan te bieden voor het isoleren van gestalkte en sessiele glandulaire capitate trichomen van Cannabis sativa door verschillende elementen uit de conventionele protocollen te combineren en te integreren. Deze elementen omvatten droogijs5, het passeren van de trichomen door verschillende microzeven met afnemende poriegroottes 7,9 en het vervangen van vloeibare stikstof (LN) voor het isolatiemedium8.
De nieuwigheid van het huidige trichomenisolatieprotocol, in vergelijking met conventionele protocollen, presenteert zich op een aantal manieren. Dit protocol is handig, omdat het geen gevaarlijke componenten vereist. De procedure kan in het laboratorium worden uitgevoerd met minimale voorzorgsmaatregelen en vergemakkelijkt een hoge doorvoer. Het vervangen van LN door het standaard vloeibare isolatiemedium zorgt voor de integriteit van de trichomen gedurende het hele isolatieproces, waardoor daaropvolgende transcriptomische analyse mogelijk is. Bij sublimatie van de LN en droogijs blijven de geïsoleerde trichomen vrij van schadelijke resten. Verder maakt de neiging van LN om te sublimeren bij kamertemperatuur het royale gebruik ervan in het hele protocol mogelijk. Het gebruik van grote hoeveelheden conventioneel isolatiemedium levert daarentegen praktische problemen op bij de hantering ervan. Ten slotte vermindert het protocol de scheiding van de schijfcel van de resterende fragiele hoofdstructuur van het glandulaire trichome, waardoor de inhoud van de hoofdruimte behouden blijft.
Dit protocol wordt gepresenteerd op een gedetailleerde stap-voor-stap manier ontworpen om de technische praktijk van het isoleren van C. sativa glandulaire capitate trichomen te ondersteunen. Het protocol biedt een beheersbare workflow die resulteert in geïsoleerde trichomen met een hoge concentratie en zuiverheid die geschikt zijn voor downstream moleculaire analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het plantaardige materiaal dat in deze studie werd gebruikt, bestond uit vier C. sativa ARO-Volcani-stammen (CS-11, CS-12, CS-13 en CS-14) die werden gekweekt in het Volcani Center, Israël, zoals elders beschreven11. Glandulaire capitate stengel trichomen werden geïsoleerd uit volwassen bloeiwijzen, en glandulaire capitate sessile trichomen werden geïsoleerd uit grote waaierbladeren van volwassen niet-bloeiende moederplanten. Al het plantmateriaal werd vers geplukt en direct opgeslagen bij −80 °C.
LET OP: Droogijs en LN worden in het hele protocol gebruikt. Deze stoffen zijn uiterst gevaarlijk. De geïsoleerde trichomen kunnen droogijsdeeltjes bevatten die gevaarlijke gasdruk kunnen veroorzaken wanneer ze in afgesloten buizen worden geplaatst; Daarom moeten alle doppen met een naald worden doorboord. Het gebruik van een beschermende bril, geschikte laboratoriumkleding en handschoenen voor hantering bij extreem lage temperaturen wordt ten zeerste aanbevolen.
1. Opstelling voor de eerste scheiding van trichomen van het plantmateriaal
- Verpletter een droogijsblok in kleine fijne vlokken met behulp van een hamer en een hard plat voorwerp in een plastic container van 5 L.
- Zeef de fijne droogijsvlokken (kleiner dan 5 mm) van het niet-gemalen droogijs met een grote zeef (via poriën kleiner dan 5 mm) in een andere plastic container van 5 L. Giet ongeveer 200 cm3 (200 ml merkteken) van de droogijsvlokken in een rechtopstaande glazen bekerglas van 1 L.
- Voeg tot 10 g bevroren C. sativa-bloeiwijzen (vanaf nu plantaardig materiaal genoemd) toe aan de eerste laag gemalen droogijs en dek af met een extra laag van 200 cm3 fijngemalen droogijs.
- Bedek de opening van het glazen bekerglas van 1 L met twee tot drie lagen klamboe van 1 mm hordeur en bevestig het met elastiekjes aan de buitenzijden van de glazen beker (figuur 1).
- Giet LN in een grote roestvrijstalen container met ronde bodem (zie materiaaltabel), waar de geïsoleerde trichomen worden verzameld.
- Steek een gaas van 350 μm in een zeef/zeefzeef om het zeefgaas van onderaf te bedekken (figuur 2). Als er een meelzeef met een afneembare plastic ring beschikbaar is, plaatst u het gaas van 350 μm zodat het onder het gaas van de meelzeef wordt bevestigd. Zo niet, bevestig dan het gaas van 350 μm met elastiekjes aan de omtrek van de meelzeef.
- Plaats de meelzeef boven de grote roestvrijstalen container met ronde bodem gevuld met LN (figuur 3). Zorg ervoor dat de breedte van de container groter is dan die van de meelzeef om het verlies van de gezeefde massa buiten de roestvrijstalen container met ronde bodem te minimaliseren.
2. Scheiding van trichomen van het plantmateriaal
- Schud het glas van 1 L met de opening naar beneden gericht in de richting van de bloemzeef alsof u een groot zoutvaatje gebruikt (figuur 4).
- Zet het glazen bekerglas van 1 L om de 2-3 minuten opzij om het gemalen droogijs en het plantaardige materiaal dat zich op de bloemzeef heeft opgehoopt, te kunnen zeven.
- Zeef de bloemzeef horizontaal om de doorgang van het plantmateriaal in de LN in de roestvrijstalen container met ronde bodem eronder te vergemakkelijken.
- Voeg LN toe aan de roestvrijstalen container en gemalen droogijs aan het glazen bekerglas van 1 L wanneer hun niveaus laag zijn. Vul het gebruikte plantmateriaal in het glazen bekerglas aan met nog eens 10 g vers plantmateriaal wanneer het plantmateriaal op de bloemzeef is uitgeput. De aanvulling hoeft meestal niet meer dan twee keer herhaald te worden.
- Herhaal stap 2.1-2.4 totdat een voldoende hoeveelheid verrijkte trichomen is verzameld in de roestvrijstalen container met ronde bodem. Over het algemeen is 20 g vers plantaardig materiaal voldoende voor RNA-extractie en transcriptoomanalyse.
- Controleer of er een witte poederachtige substantie (bestaande uit plantenresten, kliertrichomen en gemalen droogijs) op de bodem van de roestvrijstalen container onder water in de LN zit. Een microscopische observatie zal helpen om te bepalen of er voldoende trichomen zijn verzameld; Deze stap kan echter de stroom van het protocol belemmeren. Meestal volstaat 10-20 g initieel plantmateriaal voor de meeste isolaties; Er kunnen echter verschillen zijn in de trichoomdichtheid van de planten.
OPMERKING: Vanaf dit punt kan het experiment worden onderbroken en later opnieuw worden gestart. Indien kort gepauzeerd, moeten voldoende hoeveelheden LN worden toegevoegd, zodat de trichomen onder water blijven. Als alternatief kunnen de trichomen worden verzameld en bewaard bij −80 °C gedurende maximaal 3 maanden voor later gebruik, zoals beschreven in stap 5.
3. Scheiding van glandulaire capitate trichomen (gespreid en sessiel) van andere trichomentypen, zoals bolvormige en cystolithische trichomen en puin
- Voeg een kleine hoeveelheid LN toe aan een schone kleine roestvrijstalen container met ronde bodem.
- Vouw een microzeef van 40 cm x 40 cm met een maaswijdte van 150 μm tweemaal om een vouw van 20 cm x 20 cm te verkrijgen en open deze. Zorg ervoor dat het lijkt op een kegelachtige vorm (figuur 5).
- Bevestig de gaaskegel aan de rand van de roestvrijstalen container met ronde bodem met een of twee wasknijpers, zodat het geopende deel van de kegel rechtop staat en het puntige deel gedeeltelijk in de LN is ondergedompeld.
- Giet de LN en de witte poederachtige substantie uit stap 2.6 voorzichtig in de microzeefkegel.
- Breng voorzichtig een brede borstel aan om het resterende plantmateriaal van de eerste container te verzamelen en over te brengen in de 150 μm gaaskegel.
- Voeg meer LN toe aan de eerste container en herhaal de borstelbeweging totdat al het plantmateriaal is overgebracht naar de microzeefkegel.
- Maak de wasknijper voorzichtig los van het deksel van de container en open de microzeefkegel zodat de trichomen zich in het midden van de geopende microzeef bevinden. Houd alle vier de hoeken van de microzeef bij elkaar zodat het middelste deel met de trichomen ondergedompeld blijft in de LN (figuur 6).
- Terwijl u alle vier de hoeken van de microzeef vasthoudt, dompelt u de microzeef voorzichtig in de LN in de stalen container alsof u een theezakje inbrengt. Ga door met deze dompel-/schudbeweging (verticaal en horizontaal) gedurende 1 minuut. Er is een afweging tussen de isolatiekwaliteit en kwantiteit. Langere dompelbewegingen kunnen resulteren in grotere hoeveelheden trichomen, maar hun isolatiegraad kan slechter zijn. Over het algemeen wordt 1 minuut aanbevolen als voldoende voor zowel kwaliteit als kwantiteit.
OPMERKING: Deze zeefbeweging is het meest kritieke onderdeel van het protocol en moet dienovereenkomstig worden uitgevoerd. - Optioneel: Schep de niet-gezeefde plantenresten en grotere trichomen (nog steeds ondergedompeld in de LN) die in het midden van de microzeef zijn gewikkeld in een reageerbuis van 13 ml of 50 ml en bewaar bij −80 °C voor toekomstig gebruik.
LET OP: Om de ophoping van gas onder druk (van het droogijs en LN-residuen) te voorkomen, prikt u een gat in de dop van de reageerbuis met een gesteriliseerde naald. De dop kan worden vervangen zodra de druk is afgenomen, wat meestal na 24 uur is.
4. Trichomen door microzeven met afnemende poriegrootte
- Breng de gezeefde trichomen ondergedompeld in de LN op de bodem van de kleine roestvrijstalen container met ronde bodem achtereenvolgens over door microzeven met afnemende poriegroottes (105 μm, 80 μm, 65 μm en 50 μm), op dezelfde manier als gepresenteerd in stap 3.
5. Verzameling van de gewenste trichomen
- Verwijder de gewenste trichomen ondergedompeld in de LN en gewikkeld in de 50 μm microzeef met behulp van een voorgekoelde (in LN) lepel. Leg ze op een schoon bord.
OPMERKING: In deze laatste isolatiefase worden de gewenste trichomen uit de zeef verzameld. - Breng de poederachtige trichomen snel over in een gelabelde voorgekoelde buis van 1,5 ml via een voorgekoelde spatel of een scheplepel die in de buis wordt ingebracht (figuur 7). Bewaar de buisjes onmiddellijk bij −80 °C voor verder onderzoek.
OPMERKING: Een schematisch werkstroomdiagram met het hele isolatieprotocol wordt gegeven in figuur 8.
6. Observatie en analyse van de gezuiverde trichomen
- Plaats een kleine hoeveelheid (10 mg) geïsoleerde trichomen op een microscoopglaasje met behulp van een voorgekoelde (via LN) spatel. Voeg een druppel water toe en observeer direct op een lichtmicroscoop zonder vlekken. Evalueer de algehele isolatie- en besmettingsgraad met behulp van lage (10x) en hoge (40x) vergrotingen. De verrijking wordt visueel geschat aan de hand van de relatieve hoeveelheid trichomen ten opzichte van niet-trichoomweefsel, zoals weergegeven in figuur 9.
- Voer RNA-extractie en kwaliteitsanalyse uit van 50 mg geïsoleerde C. sativa glandulaire capitulaire capitate gesteelde en sessiele trichomen.
OPMERKING: Een commerciële extractiekit (zie tabel met materialen) met een poly-A-gebaseerde strategie van mRNA-zuivering werd gebruikt voor de RNA-extractie.- Resuspendeer 50 mg van de geïsoleerde trichomen in de lysisoplossing, vortex gedurende 30 s, soniceer in een ijskoude ultrasone reinigingseenheid bij 35 kHz gedurende 5 minuten en extraheer het mRNA uit de monsters volgens het protocol van de fabrikant (zie tabel met materialen).
- Om de integriteit van het RNA dat uit de trichomen wordt geëxtraheerd te schatten, bepaalt u de RNA-concentratie, de totale hoeveelheid en de RIN-waarden (RNA Integrity Number) met behulp van een lab-on-a-chip-systeem (zie Tabel met materialen).
- Voer RNAseq-analyse uit van de trichoomfracties (optioneel). RNAseq-analyse en bioinformatica-analyses van gesequencede reads kunnen worden uitgevoerd door standaard outsourcingdiensten
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De belangrijkste wijziging in dit protocol ten opzichte van conventionele trichoomisolatieprotocollen is het vervangen van het standaard isolatiemedium door LN. Het gebruik van LN als isolatiemedium maakt een ontspannen workflow mogelijk, want zolang de monsters worden ondergedompeld in LN, is metabole degradatie waarschijnlijk niet opgetreden. Bovendien, omdat het protocol de gevaarlijke componenten (d.w.z. aurintricarbonzuur en β-mercaptoethanol) vermijdt die worden gebruikt in traditioneel trichoomisolatiemedium, is het werk niet beperkt tot een chemische kap. Toch is het belangrijk om de nodige voorzorgsmaatregelen te nemen bij het hanteren van droogijs en LN.
Om de voordelen van dit protocol te beoordelen, werden de trichoomisolatieresultaten van het huidige protocol vergeleken met die verkregen met behulp van een conventionele trichoomisolatieprocedure (waarbij een waterige buffer, glasparels en een fijne zeef voor trichoomisolatie werden gebruikt)12, aanvankelijk met behulp van een lichtmicroscoop. Een vergelijking van de componenten uit verschillende isolatiefasen via lichtmicroscoopinspectie illustreert de toenemende trichoomisolatiegraad naarmate het isolatieproces vordert. In de beginfase van het isolatieproces (105-150 μm microzeef) overheersten stukjes bladweefsel in het geïsoleerde deel (figuur 9A), in tegenstelling tot het uiteindelijke isolatieproduct, dat bijna volledig uit geïsoleerde trichomen bestond (figuur 9C). Er moet voor worden gezorgd dat wordt gevalideerd dat de geïsoleerde monsters vrij zijn van verontreiniging (figuur 9B).
Hoewel de trichoomdichtheid in deze studie niet werd gekwantificeerd, kan de kwaliteit van de geïsoleerde glandulaire capitulaire capitate stalked en sessiele trichomen in de laatste isolatiestap worden waargenomen in figuur 10. De zuiverheid kan worden vergeleken met die verkregen met trichomenisolatie met behulp van een conventioneel protocol12 (figuur 10C). In het huidige protocol blijft de delicate gesteelde trichoomkopstructuur behouden en zijn de hele koppen van de geïsoleerde gesteelde trichoom zichtbaar (figuur 10D), terwijl bij het conventionele protocol de volledige trichoomkopstructuur ontbreekt en alleen de schijfcellen aanwezig zijn (figuur 10E). De opbrengst kan ook sterk worden verhoogd omdat het gebruik van droogijs en LN de limiet van plantaardig materiaal dat kan worden geëxtraheerd wegneemt. Een bijkomend voordeel van ons niet-waterige protocol is dat het alleen droogijs en LN gebruikt, en dat er dus geen restcomponenten van het isolatiemedium overblijven zodra ze verdampen. Het gebruik van LN voorkomt de afgifte van kleverige secundaire metabolieten die kunnen leiden tot de aggregatie van de trichomen13. In het huidige protocol werden de geïsoleerde trichomen in de laatste isolatiestap teruggevonden als een droog fijn poeder.
De extreem lage temperaturen die gedurende het hele huidige protocol worden gehandhaafd, zullen waarschijnlijk voldoende zijn om te voldoen aan de doelstellingen van conventionele buffermedia-preventie van RNA-afbraak (zolang de monsters onder water worden gehouden) en om downstream moleculaire toepassingen te vergemakkelijken. Om deze veronderstelling te valideren, hebben we RNA uit de geïsoleerde trichomen geëxtraheerd en de RNA-integriteit geschat met behulp van commercieel beschikbare kits. De verkregen hoge RIN-waarden (9,4 tot 10) en verschillende gelchromatografie (figuur 11) wijzen duidelijk op een hoge RNA-integriteit. De RNA-monsters werden verder geanalyseerd door RNAseq en >20 M hoogwaardige reads werden verkregen uit alle bibliotheken.
Om te valideren dat inderdaad het mRNA van de geïsoleerde trichomenfractie verrijkt is met trichome-tot expressie gebrachte genen, vergeleken we onze genexpressieresultaten voor de bloeiwijze en bijbehorende geïsoleerde gestalkte trichomen met eerdere resultaten gepresenteerd door Livingston et al.14, die de genexpressie van gezuiverde trichomen van cannabis kenmerkten (aangepast van hun aanvullende tabel 1 ). Hun protocol bestond uit het mengen in waterige buffer, filteren door zeven en, ten slotte, trichomenzuivering met behulp van een Percoll-gradiënt. Trichoom-tot expressie gebrachte genen werden gekarakteriseerd als de meest gecorreleerde genen (p > 0,95) met de genexpressie van cannabidiolzuursynthase (CBDAS), een trichoomspecifieke genmarker14. De vergelijking van genexpressie tussen de resultaten verkregen met het huidige protocol en die gepresenteerd in Livingston et al.14 laat zien dat de 12 meest verrijkte genen in onze trichoomfractie ook verrijkt waren in de Livingston et al. studie 14, inclusief het trichoommarkergen CBDAS (tabel 1). Met name werd een aanzienlijk hogere verrijkingsratio verkregen uit het huidige protocol. Deze resultaten bevestigen de geldigheid van het huidige protocol voor de studie van trichome-verrijkte genexpressie.
Daarnaast vergeleken we de expressiegegevens van vijf actinegenen van cannabis, aangezien actine vaak wordt gebruikt als referentiegen voor transcriptoomstudies (tabel 2). Onze resultaten voor zowel de geïsoleerde gesteelde als de sessiele trichomen waren vergelijkbaar met die gerapporteerd door de Livingston et al. studie14.
Ten slotte berekenden we de expressie- en trichoomverrijkingsgegevens voor de chlorofyl a-b-bindende eiwitfamiliegenen, die vermoedelijk niet trichoomverrijkt zijn (tabel 3). Inderdaad, de 12 leden van deze genfamilie vertoonden een trichoomverrijkingsfactor van <1, die diende als een negatieve controle voor trichoomverrijking. Deze gecombineerde resultaten geven de unieke expressiepatronen van de bloeiwijze en geïsoleerde trichoomfracties aan en ondersteunen de trichoomintegriteit en -kwaliteit van de geïsoleerde trichoomfractie.
Figuur 1: Opstelling voor het laden van het glazen bekerglas van 1 L. Het 1 mm hordeurgaas wordt met enkele elastiekjes (niet afgebeeld) aan de zijkanten van het glazen bekerglas bevestigd. Het glazen bekerglas van 1 L moet rechtop worden geladen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Opstelling van de meelzeef. De meelzeef is voorzien van een 350 μm microzeef via elastiekjes aan de onderkant (niet afgebeeld). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Instellen van de eerste stap van trichomenisolatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Opstelling van het glazen bekerglas. Het glazen bekerglas is voorzien van drie lagen 1 mm hordeur (muggen)gaas dat met elastiekjes aan de opening is vastgezet. De opening van het bekerglas wijst naar beneden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Opstelling van de microzeefkegelstructuur die wordt gebruikt voor trichomenisolatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Opstelling voor de dompel- en schudbeweging van de microzeef met geïsoleerde trichomen. De horizontale/verticale beweging moet lijken op een theezakjesinfusie. De opstelling is identiek voor elke gebruikte maaswijdte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Opstelling voor het overbrengen van de laatste geïsoleerde trichomen. De laatste geïsoleerde trichomen worden overgebracht naar een gelabelde buis van 1,5 ml. Alle gebruiksvoorwerpen moeten worden voorgekoeld met LN. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Stroomdiagram met het protocol. De isolatie van glandulaire capitate trichomen van C. Sativa omvat drie stappen: (1) de eerste loslating van de trichomen van de plantbron en passage via twee zeven (1 mm en 350 μm), (2) het passeren van het plantmateriaal via vijf microzeven met afnemende poriegroottes (150 μm, 105 μm, 80 μm, 65 μm en 50 μm), en (3) het verzamelen van de geïsoleerde trichomen in een voorgekoelde buis van 1,5 ml. Achtergebleven weefsel uit een van de microzeefstadia kan op dezelfde manier worden verzameld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Microscopiebeelden van de geïsoleerde trichomen met behulp van het huidige protocol. (A,B,C) Glandulaire capitate sessiele trichomen van C. sativa fan bladeren. (A) Mid-isolatie, van microzeven met poriegroottes variërend van 105 μm tot 150 μm. Let op het vasthouden van grote hoeveelheden groen, niet-trichoommateriaal. (B) Einde van de isolatie, van microzeven met poriegroottes variërend van 50 μm tot 65 μm, verontreinigd met plantaardige bron (rode pijl) en (C) vrij van verontreiniging. Schaalbalken = (A) 100 μm, (B,C) 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Microscopiebeelden van de geïsoleerde trichomen. (A,B) Glandulaire capitate trichomen van C. sativa: (A) gestalkt type, geïsoleerd met behulp van het huidige protocol, en (B) sessiel type, geïsoleerd met behulp van het huidige protocol. (C) Gesteelde trichomen geïsoleerd met behulp van een conventioneel protocol. De lage opbrengst en het ontbreken van compromisloze koppen van de trichomen zijn duidelijk. (D,E) Gesteelde glandulaire capitate trichomen geïsoleerd met behulp van (D) het huidige protocol en (E) het conventionele protocol. (F) Glandulaire trichoom geïsoleerd van 65 μm tot 105 μm microzeven (close-up). Let op de hoge isolatie van gesteelde trichomen, met losgemaakte koppen en stengeldelen. De rode pijlen geven cystolithische trichomen aan, de blauwe pijlen geven een paar stengeldelen aan van de glandulaire capitate stalked trichomen en de gele pijlen geven gescheiden schijfcellen aan. Schaalbalken = (A,C,D,E,F) 100 μm, (B) 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: Analyse van de integriteit van RNA geëxtraheerd uit de trichomen. Chromatografen en gels van geëxtraheerde RNA-monsters uit glandulaire capitaat-gestalkte en sessiele trichomen geïsoleerd met behulp van het huidige protocol. Resultaten voor het RNA van (A-D) de gesteelde trichomen van de vier cultivarlijnen die in deze studie werden gebruikt, respectievelijk CS-11, CS-12, CS-13 en CS-14, en (E-H) de sessiele trichomen, CS-11, CS-12, CS-13 en CS-14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Vergelijking van de met trichomen verrijkte genexpressie verkregen met RNAseq met behulp van het huidige protocol met de resultaten verkregen door Livingston et al.14. De 12 genen die de hoogste correlatie vertonen met cannabidiolic acid synthase (CBDAS) expressie door Livingston et al.14 (uit hun Supplemental Table Data S4, aangepast met toestemming van Wiley uitgevers), beschouwd als een trichome-specifieke genmarker, werden gekozen voor vergelijking. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Vergelijking van de genexpressie (FPKM) van vijf Cannabis actine genen van geïsoleerde gestalkte en sessiele trichomen uit het huidige protocol (onze genexpressiegegevens van Cannabis variëteit CS-11 11 (Var CS-11)) met eerder gepubliceerde resultaten aangepast van Livingston etal.14. De resultaten van Livingston et al.14 werden gepresenteerd op basis van het Finola FN-referentiegenoom en hun gegevens werden vertaald naar het CS10.2-referentiegenoom. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Genexpressie (FPKM) van Cannabis chlorofyl a-b bindgenen van hele bloeiwijzen en geïsoleerde gestalkte trichomen uit het huidige protocol (onze genexpressiegegevens van Var CS-11). Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ten opzichte van de momenteel beschikbare trichomenisolatieprotocollen worden in dit protocol twee belangrijke wijzigingen beschreven. Deze omvatten het losmaken van de trichomen van het plantmateriaal met behulp van droogijs in de eerste stap en het vervangen van LN door het veelgebruikte vloeibare buffermedium. De eerste modificatie voor C. sativa trichomenzuivering is gebaseerd op een eerder protocol dat het gebruik van gemalen droogijs introduceerde om de trichomen los te maken van geraniumpedicels5. Terwijl traditionele trichoomisolatieprotocollen over het algemeen een kleine (50 ml) reageerbuis gebruiken, werd in deze studie een glazen bekerglas van 1 l gebruikt met een royale hoeveelheid gemalen droogijs, waardoor een groter volume initieel plantmateriaal (tot 10 g) kan worden verwerkt. Bovendien werden in het huidige protocol twee extra passages van de trichomen door microzeven geïntroduceerd in de eerste isolatiestap. De eerste stap maakt gebruik van een verticale op-en-neer krachtige zoutvaaierachtige beweging en de tweede maakt gebruik van een horizontale zeefbeweging door de microzeef in de meelzeef. De gecombineerde horizontale en verticale zeefbewegingen worden voorgesteld om een verbeterde scheiding te bevorderen op basis van de grootte en vorm van de trichoom.
De tweede, belangrijkste wijziging heeft betrekking op het isolatiemedium waarin de passage door de microzeven wordt uitgevoerd. In het huidige protocol wordt het conventionele waterige isolatiemedium volledig vervangen door LN. Een eerder protocol8 gebruikte LN ook in de eerste stap voor trichomenisolatie, waarbij trichomen van het plantmateriaal werden gescheiden (door het bloemmateriaal tegen een gaaszeef te raspen), maar ging verder met een vloeistofbufferextractie en Percoll-dichtheidsscheiding. Het vervangen van LN in plaats van het conventionele isolatiemedium elimineert de noodzaak van speciale procedures in verband met de toxische componenten van het conventionele isolatiemedium, waardoor een ontspannen workflow en een hoge doorvoer mogelijk is.
Een belangrijk kenmerk van het huidige protocol is de neiging van droogijs en LN om snel te sublimeren bij kamertemperatuur. Deze functie maakt hun genereuze toepassing tijdens het isolatieproces mogelijk. Daarentegen zou het gebruik van een groot deel van de conventionele isolatiebuffer leiden tot technische complicaties bij het verwerken van de grote volumes.
Terwijl het isolatieproces in het huidige protocol het behoud van de fragiele hoofdstructuur van het glandulaire capitate gesteelde trichome bevordert, bevorderen de conventionele protocollen de scheiding van de schijfcellen van het resterende kliermateriaal, dat gemakkelijk wordt weggespoeld, waardoor alleen de schijfcellen overblijven. Dit fenomeen is duidelijk te zien in onze resultaten waarin we een conventioneel isolatieprotocol vergelijken met ons nieuwe protocol (figuur 10D, E). Naast de microscopische observatie geeft de kwaliteitsanalyse van het RNA geëxtraheerd uit de trichomen (geïsoleerd met behulp van dit protocol) duidelijk aan dat de RNA-integriteit behouden blijft tijdens het isolatieproces en dat het geschikt is voor transcriptomische analyse.
Bovendien geven de genexpressieresultaten van onze geïsoleerde trichoomfractie aan dat de fractie sterk verrijkt is met gevestigde trichoom-tot expressie gebrachte genen (tabel 1) en, omgekeerd, dat niet-trichoom-tot expressie gebrachte genen niet vertegenwoordigd zijn (tabel 3).
De belangrijkste beperking van het huidige protocol is de exclusieve geschiktheid voor het isoleren van trichomen volgens hun neiging om door microzeven te gaan. Hoewel het protocol niet direct kan worden toegepast op trichomenisolatie met behulp van een dichtheidsgradiënt, is het geschikt voor het isoleren van de trichomen voorafgaand aan de dichtheidsgradiëntstap, indien nodig. In deze studie ondergingen de trichomen die met behulp van dit protocol werden geïsoleerd geen proteomische karakterisering en hun geschiktheid voor een dergelijke toepassing moet worden geverifieerd. Aangezien de RNA-monsters die werden geëxtraheerd uit zowel gesteelde als sessiele trichomen echter geen degradatie vertoonden, zoals aangegeven door de chomatografen en hoge RIN-waarden, kan worden aangenomen dat de trichomen die met het huidige protocol zijn geïsoleerd, waarschijnlijk zullen voldoen aan de vereisten die nodig zijn voor proteomische analyse.
De isolatiegraad (van de oorspronkelijke plantenbron en andere soorten trichomen) van de glandulaire capitate sessiele trichomen van de waaierbladeren is erg hoog, omdat de waaierbladeren het glandulaire capitate stengels trichomen15,16 missen, en de cystolithische en bolvormige trichomen gemakkelijk worden geïsoleerd van de sessiele trichomen vanwege hun structurele en grootteverschillen. Met betrekking tot de isolatie van glandulaire capitate stengeltype trichomen, is het echter het beste om hun isolatiegraad als verrijking aan te pakken, omdat de plantenbron, de volwassen vrouwelijke bloeiwijze, alle vier de trichoomtypen bevat, naast het pre-stengeltype14. Het spreekt voor zich dat de meeste geïsoleerde glandulaire capitulaire trichomen van het gesteelde type zijn, omdat hun verhoogde positie (ten opzichte van de epidermale gebonden sessiele trichomen) de kans vergroot dat ze botsen met een droogijsdeeltje en loskomen van de plant. Bovendien wordt het kruispunt dat de kop- en stengeldelen van het gesteelde tricchoom verbindt, beschouwd als een zwak punt dat verband houdt met de abscisie van de klierkop17. Het zou dus juist zijn om naar het gesteelde trichoomgedeelte te verwijzen als een sterk verrijkte fractie met potentieel lage verontreiniging van het sessieltype. Er werd echter geen verdere analyse uitgevoerd om deze veronderstelling te valideren.
De geschiktheid van het huidige protocol om glandulaire trichomen uit andere plantensoorten te extraheren, moet nog worden bepaald. De hoge trichoomdichtheid in C. sativa draagt vermoedelijk bij aan het succes van het huidige protocol. Het lijkt echter onwaarschijnlijk dat dit de enige reden is, omdat een relatief grote plantaardige materiaalbron (tot 10 g per isolatiecyclus) effectief kan worden verwerkt. Andere studies hebben gedetailleerde protocollen gepresenteerd voor het isoleren van verschillende trichoomtypen van andere planten, bijvoorbeeld rozetbladtrichomen van Arabidopsis thaliana18,19. Hoewel de toepasbaarheid van het huidige protocol voor het isoleren van andere trichoomtypen in dit werk niet werd bestudeerd, zullen elementen die in dit werk worden gepresenteerd, met name de vervanging van LN voor de isolatiebuffer, waarschijnlijk het trichoomisolatieproces verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de financiële steun van CannabiVar Ltd. Al het plantmateriaal werd genereus verstrekt door professor Hinanit Koltai van het Volcani Center, Israël.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
