Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optogenetic störning av neural aktivitet med laserbelysning i Semi-intakt Published: July 4, 2013 doi: 10.3791/50513
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Complexity Science and Engineering, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2Department of Physics, Graduate School of Science, The University of Tokyo

Summary

Här beskriver vi ett protokoll för optogenetic manipulation av motoneuronal aktivitet samtidigt övervaka förändringar i motoreffekt (muskelkontraktion) i semi-intakt

Abstract

Drosophila larver locomotion är ett utmärkt modellsystem i utvecklingsmässiga och fysiologiska Neuroscience, på grund av den genetiska tillgängligheten av de underliggande neuronala komponenter i kretsarna 1-6. Tillämpning av optogenetics 7,8 i larver neurala kretsen tillåter oss att manipulera neuronal aktivitet i rumsligt och tidsmässigt mönstrade vägar 9-13. Typiskt exemplar i stort sett lyser med en kvicksilverlampa eller LED, är så specificitet målet nervceller styrs av binära genexpressionssystem såsom Gal4-UAS-system 14,15. I detta arbete, för att förbättra den rumsliga upplösningen till "sub-genetisk upplösning", upplyst vi lokalt en delmängd av nervceller i den ventrala nerv sladd med laser genomförs i ett konventionellt konfokalmikroskop. Under övervakning av rörelsen av kroppen väggen i semi-intakt larver, aktiverade vi interaktivt eller hämmas neural aktivitet med channelrhodopsin 16,17 Or halorhodopsin 18-20, respektive. Genom rumsligt och tidsmässigt begränsad belysning av nervvävnad, kan vi manipulera aktiviteten av specifika nervceller i kretsen vid en viss fas av beteende. Denna metod är användbar för att studera sambandet mellan verksamheten i en lokal neural församling i ventrala nerv sladd och spatiotemporal mönster av motoreffekten.

Introduction

Framåt peristaltiska locomotion i Drosophila larver sker genom förökning av muskelsammandragning från bakre till främre segment. Denna rörelse åstadkommes genom sekventiell aktivering av motoriska nervceller i den ventrala nerv sladd längs den längsgående kroppen axeln. För att undersöka kretsen bakom denna mönstrade propagerande aktivitet, kan lokal störning av neural aktivitet vara en informativ strategi. Även farmakologisk analys kan styra specifikt ämne, såsom neurotransmittorer, i nervvävnad, kan effekten av farmakologiska droger vara lika i de nästan alla segment eftersom larver ventrala nerv sladd är repetitiv struktur som består av liknande neuromeres längs den längsgående axeln. Alternativt kan man uttrycka optogenetic eller temperaturkänsliga molekyler sond i ett litet antal segment. Men sådana specifika Gal4 linjer är mycket svår att generera. Här presenterar vi en metod för att manipulera nervceller i några segningar som använder laser belysning. Med utnyttjande av rumsligt begränsad belysning i konfokalmikroskopi, kan man störa aktiviteten av nervceller i ett lokalt område. Kombinerat med uttrycksmönstret av sonden genom delmängder av neuron-specifika Gal4 linjer, förbättrar denna laserbelysning metod kraftigt rumsliga upplösningen för perturbation. Och eftersom den här metoden kräver endast en vanlig konfokalmikroskop, är inköp av ytterligare laboratorieutrustning normalt inte nödvändigt.

Med denna teknik har vi granskat rollen av motorisk neuronal aktivitet under förökning av motoreffekten 13. Genom att blockera verksamheten i motoriska nervceller inom några segment under peristaltiska rörelse, kunde vi testa om aktiviteten av motoriska nervceller själva krävs för förökning av motorns utsignalen. Lokalt och övergående blockad av motoriska nervceller greps spridning av peristaltiska rörelse. Efter blockaden avlägsnades, propagation visades på segment där vågen hade arresterats. Detta fenomen antyder att utan motor neuronal aktivering, kan den propagative vågen inte fortsätta längs den ventrala nerv sladd ytterligare, och sålunda aktiveringen av motoriska nervceller är nödvändig för peristaltisk rörelse. Vi har tidigare rapporterat detaljerade uppgifter och diskussioner om detta fenomen i Inada et al. (2011) 13. Här beskriver vi den metod för att störa neural aktivitet interaktivt under övervakning av rörelse dissekerade larver. Använda olika Gal4 linjer och serier av Spatiotemporal mönster för aktivitet manipulation, kan man undersöka kretsar logik genom egenskaper störningsmetoder respons av motorkrets.

Protocol

Ett. Larver Framställning

  1. Behåll flyga linjer OK6-Gal4, UAS-ChR2 eller OK6-Gal4, UAS-NpHR2 i plastflaskor som innehåller vanlig fluga mat.
  2. Spread jäst klistra innehållande all-trans-retinal (ATR) vid lämpliga koncentrationer (1 mM för ChR2, 10 mM för NpHR2 ("NpHR" för kort) på en äppeljuice agarplatta.
  3. Plocka upp 2: a eller 3: e INSTAR larver från flaskorna och sätta dem på ATR-innehållande plattan.
  4. Uppfostra dem vid 25 ° C i mörker under en lämplig tidsperiod (1 dag för ChR2, 2 dagar för NpHR.)

2. Mikroskop Setup

  1. Bifoga en CCD-kamera (XCD-V60, Sony) till en vanlig konfokalmikroskop (i vårt fall, FV1000, Olympus) med en C-mount fäste (förstoring 0,35 x).
  2. Om det finns en slutare längs ljusets väg från objektivet till CCD-kameran, som stänger vid laserscanning, ta det försiktigt. Eftersom detta steg beror på microsklara installationen, kontakta mikroskop tillverkaren för teknisk support om det behövs.

Tre. Dissektion

  1. Skölj ATR-fed larver med vatten för att avlägsna kvarvarande mat från kroppen.
  2. Sätt larv på en sylgard belagd maträtt, ryggsidan uppåt (ryggsidan har två Trakealtuber kör längdriktningen, en vardera sidan av ryggens mittlinje). Tjockleken på sylgard är ca 5mm.
  3. Sätt en insekt stift (Austerlitz Insect stift, Φ0.10mm, rostfritt) i svansen mellan de trakeala rör med pincett (# 5 Inox, FST av Dumont, Schweiz). Stiften, ca 10mm lång, bör böjas eller skäras vara tillräckligt kort (~ 2mm långa) för att undvika att träffa och skada ytan av objektiv. Lägg sedan den andra insekten stiftet i huvudet av larven nära munnen krok, svart klo-liknande struktur i framändan.
  4. Lägg Ca 2 +-fri normal saltlösning (NaCl 140 mM, KCl 2 mM, MgCl2 6 mM, HEPES-NaOH 5 mM,Sackaros 36 mM (pH 7,1)) för att hålla larven fuktig.
  5. Gör ett litet snitt nära svansen med mikro sax (MB-50-7 Napox, Japan).
  6. Från snittet, gör ett längsgående snitt längs ryggens mittlinje mot huvudet. Var försiktig så att du inte skadar den ventrala nerv sladd (VNC) och axoner.
  7. Gör ett litet snitt på huvudet i sidled.
  8. Placera 4 stift i varje hörn av den dissekerade stomvägg. Kroppen väggen ska sträckas tillräckligt för att visualisera en segmentell mönster av kroppen väggen, men inte för mycket för att hindra peristaltiska rörelse.
  9. Ta bort de inre organen med undantag för hjärnan och VNC och skölj provet med Ca 2 +-fri vanlig saltlösning.
  10. Justera orienteringen av den ventrala nerv sladd vara bilateralt symmetrisk genom att ändra position och orientering av insekter stift på kroppen väggen. För att fastställa positionen för den ventrala nerv sladd, in en nål genom vävnad mellan hjärnan och munnen haka ner till sylgard.
    11. <li> Byt bufferten med 2 mM Ca 2 + Ringer-lösning (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 2 mM, HEPES-NaOH 5 mM, sackaros 36 mM (pH 7,3)).

4. Imaging med laserbelysning

  1. Bifoga en 4x torr objektiv (UPlanSApo 4x, NA 0,16, Olympus, Japan) i konfokalmikroskop och ställa larven preparatet på scenen.
  2. Skaffa en sändning bild av dissekerade preparatet med en röd laser (633 nm) för att lokalisera den ventrala nerv sladd med konfokalmikroskop. För denna scanning, tänk på att inte använda en 488nm eller 559nm laser, vilket inducerar oönskad stimulering av ChR2 eller NpHR, respektive.
  3. Definiera regionen av intresse (ROI) överföring bilden. Zoomad läge skulle kunna vara användbara för detaljerad bestämning av ROI.
  4. Byt filtret uppsättning av mikroskop för att lysa med 488nm eller 559nm ljus.
  5. Belys preparatet med en halogenlampa för att visualisera kroppens vägg. The preparatet kan övervakas med en CCD-kamera ansluten till konfokalmikroskop.
  6. Anteckna rörelsen hos kroppsväggen och växla laserstrålen till och från medan övervakning av rörelse.

Representative Results

Lokalt och övergående aktivering av motoriska nervceller med ChR2.

Vi uttryckte ChR2 i motoriska neuroner. Axoner av motoriska nervceller som kommer från varje VNC segment projekt till ett motsvarande segment av kroppen väggen. När vi stimulerade en eller två segment av VNC med en blå laser, uppvisade musklerna i motsvarande segment sammandragningar (Figur 1).

Lokalt och övergående hämning av motoriska nervceller med NpHR.

Vi uttryckte NpHR i motoriska neuroner. När vi stimulerade några (1 ~ 2) segment av VNC med en gul laser under de peristaltiska muskelsammandragningar, var utbredningsvågen arrested hos motsvarande segment av kroppen vägg (Figur 2). Då vågen startas från de arresterade segmenten när vi släckt laserbelysning 13.

50513fig1.jpg "alt =" Bild 1 "fo: innehåll-width =" 5.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Lokal aktivering av motoriska nervceller med ChR2. A. Schema för lokal aktivering av filead förberedelser. Med blå-ljus belysning av några segment av den ventrala nerv sladd uttrycker ChR2 i motoriska nervceller, är musklerna i motsvarande segment kontrakterade (pilspets). B. Transmission bilder av en dissekeras larv. Lokala belysning av den ventrala nerv sladd (pilspetsar) inducerar segmentell sammandragning av muskler kroppen väggen (pilar).

Figur 1
Figur 2. Lokal hämning av motoriska nervceller med NpHR. A. Scheme av lokala hämning av filead förberedelser. Med gul-light belysning av ett par segment av den ventrala nerv sladd uttryckande NpHR i motoriska neuroner, muskler kontraktion under spontant inträffade-peristaltisk rörelse (pilspets i toppen) relaxeras (pilspets i botten.) B. Transmission bilder av ett dissekeras larv . Lokala belysning av den ventrala nerv sladd (pilspetsar) luckras de spontant-kontrakterade segmenten kroppen väggen (pilar).

Discussion

Temporal och lokal störning av neural aktivitet är en ovärderlig teknik för analys av nätverkets dynamik neurala kretsar. I detta protokoll, presenterar vi en metod för att manipulera neural aktivitet genom optogenetics hjälp av en laser. Laserns höga riktverkan ger mer lokaliserad optogenetic stimulans än bred fältstimulering använder kvicksilver eller Xenon lampa. Även laser belysningar har redan tillämpats på optogenetics i tidigare studier, är speciella uppställningar såsom glasfiber, mikromanipulator, och laser källa, krävs i de flesta tidigare studier. I detta protokoll använder vi en vanlig konfokalmikroskopi för lokal belysning. Eftersom konfokalmikroskop systemet används i stor utsträckning, kommer denna metod att öppna möjligheten att tillämpa högre upplösning optogenetics i många laboratorier.

Protokollet har två kritiska punkter: larver dissekering och laser makt. Första, om hjärnan, den ventrala nerv sladd eller en motorisk nerv skadas During dissektion kommer larver uppvisar mindre eller ingen spontan peristaltiska rörelse. Precision är därför mycket viktigt, speciellt när man gör ett snitt på ryggsidan med våren sax och ta bort inre organ med pincett. Detaljer om dissektion har rapporterats tidigare 21. Det andra är om tillräcklig stimulans som skall uppnås, en lasereffekt av ca 0,1 ~ 1 mW / mm 2 för ChR2 eller en ~ 10 mW / mm 2 för NpHR krävs. Vi utvärderade laser makt som total ljuseffekt under ett objektiv divideras med en beräknad yta på belysning. Vi mätte den totala ljuseffekten med en kraftmätare (mobiken, Sanwa MI Technos, Japan). Vi beräknade området för belysning som cirkulära konstanta gånger kvadraten av våglängden hos lasern, vilket ungefär ger belysta området i diffraktionsgränsen. Effektiv belysning effekt på provet kan justeras inte bara i kraft av laserutsignalen, men också genom att ändra avsökningshastigheten och steler of repetitioner. Vi skannade laser med 20-100 xsek / pixel för 63 gånger. Dessutom expressionsnivån av optogenetics protein och mängden av ATR är också kritiska för stimulering effektivitet. Följaktligen, om larver visade inget optogenetic svar, bör följande punkter kontrolleras och korrigeras: 1) laser makt (genom att optimera mikroskop systemet), 2) uttryck nivå optogenetics protein (genom att kontrollera genotyp och uppfödning temperatur), och 3) belopp ATR (genom att justera koncentrationen av ATR och utfodring period). NpHR kräver högre koncentration av ATR än ChR2 gör av okända skäl 13. ChR2 fungerar bra i larver uppfödda i livsmedel som innehåller mindre ATR (t.ex. 0,1 mM) än vad som beskrivs här (1 mM). Som mata larver till 1 mM ATR är tillräcklig för att göra ChR2 foto-reaktiva, rekommenderar vi denna koncentration för den första rättegången i ChR2 experiment. Koncentrationen av ATR kan därefter titreras ned från 1 mM. Som att exponeringstiden för ATR, rekommenderar vivaraktigheten beskrivs här för robust optogenetic kontroll. Vi misslyckades ofta att observera optogenetic respons när du matar larverna till ATR för kortare tid.

I detta protokoll är laserbelysning och bildtagning drivs av en separat dator. Så, är tydlig detektion av spatiotemporal mönster av laserbelysning med CCD kamera kritisk för dataanalys. Om laserfläcken eller linje är mörk på CCD-bild, bör du optimera kraften i halogenlampan och få värdet av CCD-kamera för att visualisera laserbelysning samtidigt hålla kroppen väggen syns.

Spatiotemporal belysning visas i detta protokoll ger information om larver motorkretsarna, men har metoden har vissa begränsningar. När det gäller "spatial" aspekten, placering av belysningen registreras av låg förstoring CCD används för videotaping kroppsrörelser vägg. Följaktligen kan belysningen område tilldelas på segment nivå, men inte på cellnivå. När det gäller "temporal "aspekt, fördröjning mellan byte på laserscanning av konfokalmikroskop och belysning med laser beror på konfokalmikroskop systemet och scanning skick. Följaktligen är några tester genom trial and error som krävs för att justera belysningen timing. Eftersom tidpunkten för belysningen kan bestämmas i CCD filmer med adekvat programvara såsom ImageJ, är den kritiska faktorn i tidsupplösning bildhastighet av CCD-kamera avbildning. Vi brukar ställa in bildhastigheten för 7.5-15 bildrutor per sekund.

Framsteg inom optogenetic verktyg ger oss en chans att ändra detta protokoll. Vi använde 3: e INSTAR larver som har OK6-Gal4 och UAS-ChR2 [H134R] eller UAS-NpHR2. Andra optogenetic verktyg i stället för ChR2 [H134R] eller NpHR2 såsom ChR2 [T159C/E123T], NpHR3 eller Arch kan öka effektiviteten i verksamheten kontrollen 22. Dessutom kan användning av andra gal4 rader eller analys i andra utvecklingsstadier ge mer information om motorn circuits.

I detta protokoll, var motorisk aktivitet övervakas av överförings bilder av stomvägg kontraktion med en CCD-kamera. Aktiviteten av motoriska nervceller med kalcium-känsliga fluorescerande molekyler (t.ex. GCaMP) kan också direkt övervakas samtidigt manipulera neural aktivitet med ChR2 eller NpHR. I detta fall är blå ljus belysning inom ett brett område och en högkänslig CCD-kamera (t.ex. EMCCD kamera) används i stället för en halogenlampa och den normala CCD-kameran tidigare beskrivits häri. Att förbättra rumsliga upplösningen av stimulering medan övervakning stomvägg rörelse, med ett extra objektiv kan vara en mer avancerad metod: belysning av den ventrala nerv sladd med en hög förstoring objektiv (t.ex. 40x) från ovanför provet och övervakning stomvägg med låg förstoring lins (t.ex. 4x) under provet. Detta dubbla linssystem kan tillåta oss att stimulera nervsystemet i högre spatial upplösning.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett Grant-i-Stöd för vetenskaplig forskning om innovativa områden "Mesoskopisk neurocircuitry" (nr 22.115.002) och "Comprehensive Brain Science Network" (nr 221S0003) vid ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap, and Technology, Japan till AN och Grant-i-Stöd för unga forskare (B) (nr 21.700.344) av Japan Society för främjande av Science (JSPS) till HK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BX61WI Microscope Olympus Corporation BX61WI
Fluoview FV1000 confocal system Olympus Corporation FV1000
CCD camera Sony XCD-V60
all-trans retinal Sigma R2500-500MG 200 mM stock in 95% EtOH
Silpot184 Dow Corning Toray 3255981

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 48, 58-73 (2001).
  2. Fox, L. E., Soll, D. R., Wu, C. F. Coordination and modulation of locomotion pattern generators in Drosophila larvae: effects of altered biogenic amine levels by the tyramine beta hydroxlyase mutation. J. Neurosci. 26, 1486-1498 (2006).
  3. Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
  4. Gomez-Marin, A., Louis, M. Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than. Curr. Opin. Neurobiol. , (2011).
  5. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nat. Methods. , (2012).
  6. Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
  8. Miesenbock, G., Kevrekidis, I. G. Optical imaging and control of genetically designated neurons in functioning circuits. Annu. Rev. Neurosci. 28, 533-563 (2005).
  9. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
  10. Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
  11. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J. Neurophysiol. 101, 3075-3088 (2009).
  12. Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. Optogenetics in the teaching laboratory: using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in Drosophila. Adv. Physiol. Educ. 35, 82-91 (2011).
  13. Inada, K., Kohsaka, H., Takasu, E., Matsunaga, T., Nose, A. Optical dissection of neural circuits responsible for Drosophila larval locomotion with halorhodopsin. PLoS One. 6, e29019 (2011).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  15. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  16. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  17. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (1073).
  18. Hildebrand, E., Dencher, N. Two photosystems controlling behavioural responses of Halobacterium halobium. Nature. 257, 46-48 (1975).
  19. Takahashi, T., Mochizuki, Y., Kamo, N., Kobatake, Y. Evidence that the long-lifetime photointermediate of s-rhodopsin is a receptor for negative phototaxis in Halobacterium halobium. Biochem. Biophys. Res. Commun. 127, 99-105 (1985).
  20. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  21. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107 (2009).
  22. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).

Tags

Neurovetenskap molekylärbiologi neurobiologi utvecklingsbiologi bioteknik cellbiologi motoriska nervceller neurovetenskap, Optogenetics channelrhodopsin-2 Halorhodopsin laser konfokalmikroskopi djurmodell
Optogenetic störning av neural aktivitet med laserbelysning i Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver in Motion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matsunaga, T., Fushiki, A., Nose,… More

Matsunaga, T., Fushiki, A., Nose, A., Kohsaka, H. Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion. J. Vis. Exp. (77), e50513, doi:10.3791/50513 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter