Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optogenetic Perturbation van neurale activiteit met Laser Verlichting in Semi-intacte Published: July 4, 2013 doi: 10.3791/50513
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Complexity Science and Engineering, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2Department of Physics, Graduate School of Science, The University of Tokyo

Summary

Hier een protocol beschrijven we voor optogenetic manipulatie van motoneuronal activiteit, terwijl het volgen van veranderingen in motorvermogen (spiercontractie) in semi-intacte

Abstract

Drosophila larven locomotie een prachtig modelsysteem ontwikkeling en fysiologische neurologie, vanwege de genetische toegankelijkheid van de onderliggende neuronale elementen in de circuits 1-6. Toepassing van optogenetics 7,8 in het larvale neurale circuit stelt ons in staat om neuronale activiteit te manipuleren in ruimtelijk en temporeel patroon manieren 9-13. Typisch worden specimens algemeen verlicht met een kwiklamp of LED, zo specificiteit van de doelneuronen bestuurd door binaire genexpressiesystemen zoals de Gal4-UAS systeem 14,15. In dit werk, de ruimtelijke resolutie "sub-resolutie genetische verbeteren", we lokaal verlicht een subset van neuronen in de buikzenuwkoord met lasers toegepast in een gebruikelijke confocale microscoop. De monitoring de beweging van de lichaamswand van de semi-intacte larven, we interactief geactiveerd of geremd neurale activiteit channelrhodopsin 16,17 or halorhodopsin 18-20, respectievelijk. Door ruimte en tijd beperkte verlichting van het zenuwweefsel, kunnen we de activiteit van specifieke neuronen in het circuit op een bepaalde fase gedrag manipuleren. Deze methode is handig voor het bestuderen van de relatie tussen de activiteiten van een lokale neurale assemblage in het ventrale zenuw snoer en de spatiotemporele patroon van motorische output.

Introduction

Forward peristaltische beweging in Drosophila larven gebeurt door de propagatie van spiercontracties van posterior naar anterior segmenten. Deze beweging wordt gerealiseerd door opeenvolgende activering van motorische neuronen in het ventrale zenuw snoer langs de lengte-as van het lichaam. Om de circuits achter dit patroon voortplantende activiteit te onderzoeken, kon de lokale verstoring van de neurale activiteit een informatieve benadering. Hoewel de farmacologische test kan specifieke inhoud, zoals neurotransmitters, in zenuwweefsel regelen, kan het effect van farmacologische middelen gelijksoortig zijn van de bijna alle segmenten omdat de larven buikzenuwkoord is herhalende structuur bestaan ​​uit homologe neuromeres langs de lengteas. Als alternatief zou een optogenetic of temperatuurgevoelige probe moleculen in een klein aantal segmenten drukken. Dergelijke specifieke gal4 lijnen zijn moeilijk te genereren. Hier presenteren we een methode voor het manipuleren van neuronen in een paar segmenten met behulp van laser verlichting. Gebruikmakend van de plaatsgebonden verlichting in confocale microscopie, kan men de activiteit van neuronen in een lokaal gebied verstoren. Gecombineerd met het expressiepatroon van de probe door subsets van neuron-specifieke gal4 lijnen, deze laser verlichting methode verbetert ruimtelijke resolutie voor verstoring. En omdat deze methode vereist slechts een gebruikelijke confocale microscoop, de aanschaf van extra laboratoriumapparatuur is gewoonlijk niet nodig.

Met deze techniek, onderzochten we de rol van motorneuronen activiteit tijdens de voortplanting van motorvermogen 13. Door het blokkeren van de activiteiten van motorneuronen in alle segmenten tijdens peristaltische beweging, konden we testen of de activiteit van motorneuronen zelf vereist voor de vermeerdering van de motor uitgangssignaal. Lokale en tijdelijke blokkade van motorische neuronen arresteerde de voortplanting van peristaltische beweging. Nadat de blokkade werd verwijderd, propagation verscheen in het segment waar de golf was gearresteerd. Dit fenomeen suggereert dat zonder motor neuronale, de propagatieve golf kan niet langs de buikzenuwkoord verdere vooruitgang, en dus de activering van motorneuronen noodzakelijk peristaltische beweging. We hebben eerder gedetailleerde gegevens en discussies over dit fenomeen gerapporteerd in Inada et al.. (2011) 13. Hier beschrijven we de methode om neurale activiteit interactief verstoren, terwijl het toezicht op de beweging van de ontleed larven. Met behulp van verschillende gal4 lijnen en reeks van spatio-temporele patronen voor activiteit manipulatie, kan men schakelingen logica te onderzoeken door middel van verstoring respons eigenschappen van het motorcircuit.

Protocol

1. Larven Voorbereiding

  1. Handhaaf vliegen lijnen van OK6-Gal4, UAS-ChR2 of OK6-Gal4, UAS-NpHR2 in plastic flacons met standaard vlieg voedsel.
  2. Spread gist plakken met all-trans retinal (ATR) in geschikte concentraties (1 mM voor ChR2, 10 mM voor NpHR2 ("NpHR" in het kort) op een appelsap agar plaat.
  3. Pick-up 2 e of 3 e instar larven van de flesjes en zet ze op de ATR-bevattende plaat.
  4. Hen groot bij 25 ° C in het donker voor een passende periode (1 dag voor ChR2, 2 dagen voor NpHR.)

2. Microscoop Setup

  1. Bevestig een CCD-camera (XCD-V60, Sony) met een conventionele confocale microscoop (in ons geval, FV1000, Olympus) met een C-mount bevestiging (vergroting 0.35x).
  2. Als er een sluiter langs de lichtweg van de objectieflens van de CCD camera, die in laser scanning sluit, verwijder zorgvuldig. Aangezien deze stap hangt af van de microsomgaan setup, contact opnemen met de fabrikant microscoop voor technische ondersteuning, indien nodig.

3. Ontleding

  1. Spoel de ATR-gevoede larven met water om de resterende voedsel uit het lichaam te verwijderen.
  2. Zet de larve op een Sylgard gecoate schaal, dorsale zijde (met de dorsale zijde heeft twee tracheale buizen die longitudinaal, een aan elke kant van de middellijn). De dikte van de Sylgard is ongeveer 5 mm.
  3. Plaats een insect pin (Austerlitz Insect pinnen, Φ0.10mm, roestvrij) in de staart tussen de tracheale buizen met een pincet (# 5 Inox, FST door Dumont, Zwitserland). De pennen, ongeveer 10 mm lang, worden gebogen of gesneden kort genoeg is (~ 2 mm lang) te ontwijken en beschadiging van het oppervlak van de objectieflens. Zet dan de tweede insect pin in de kop van de larve in de buurt van de mond haak, zwarte klauw-achtige structuur aan het voorste uiteinde.
  4. Voeg Ca 2 +-vrije normale zoutoplossing (NaCl 140 mM, KCl 2 mM, MgCl2 6 mM HEPES-NaOH 5 mM,Sucrose 36 mM (pH 7,1)) naar de larve vochtig.
  5. Maak een kleine incisie in de buurt van de staart met micro schaar (MB-50-7, Napox, Japan).
  6. Uit de incisie, maak een longitudinale snede langs de dorsale middellijn naar het hoofd. Wees voorzichtig dat u de buikzenuwkoord (VNC) en axonen beschadigen.
  7. Maak een kleine incisie aan het hoofd zijwaarts.
  8. Plaats 4 pinnen op elke hoek van de ontleed bodywall. Het lichaam muur moet voldoende zijn om een ​​segmentale patroon van het lichaam muur visualiseren worden opgerekt, maar niet te veel om peristaltische beweging belemmeren.
  9. Verwijder de interne organen behalve de hersenen en VNC en spoel het monster met Ca2 +-vrije zoutoplossing.
  10. Stel de oriëntatie van de buikzenuwkoord bilateraal symmetrisch te zijn door de positie en oriëntatie van insecten kunnen op lichaamswand. Om de positie van de buikzenuwkoord vast, steek een pen door het weefsel tussen de hersenen en de mond haak naar de Sylgard.
    11. <li> Vervang de buffer met 2 mM Ca2 + Ringer-oplossing (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, CaCl2 2 mM, HEPES-NaOH 5 mM, 36 mM sucrose (pH 7,3)).

4. Beeldvorming met Laser Verlichting

  1. Bevestig een 4x droge objectief (UPlanSApo 4x, NA 0.16, Olympus, Japan) in de confocale microscoop en stel de larve voorbereiding op het podium.
  2. Verkrijgen van een transmissie beeld van de ontleed voorbereiding met een rode laser (633 nm) om de buikzenuwkoord vinden confocale microscoop. Hiervoor scannen, zeker niet naar een 488nm of 559nm laser, die ongewenste stimulatie van ChR2 of NpHR induceert, respectievelijk gebruiken.
  3. Definieer de regio van belang (ROI) op de afbeelding van de transmissie. Ingezoomd modus kan nuttig zijn voor een gedetailleerde bepaling van de ROI.
  4. Wijzig het filter set van de microscoop te verlichten met 488nm of 559nm licht.
  5. Verlicht het preparaat met een halogeenlamp op de lichaamswand visualiseren. The preparaat kan worden bewaakt met een CCD camera aan de confocale microscoop.
  6. Noteer de beweging van het lichaam muur en schakel de laserstraal op en af, terwijl het toezicht op de beweging.

Representative Results

Lokale en voorbijgaande activering van motorische neuronen met ChR2.

We uitgedrukt ChR2 in motorische neuronen. De axonen van de motorische neuronen die uit elk segment VNC-project tot een overeenkomstige segment van het lichaam muur. Als we gestimuleerde een of twee segmenten van het VNC met een blauwe laser, spieren in de overeenkomstige segmenten vertoonden contracties (figuur 1).

Lokale en voorbijgaande remming van de motorische neuronen met NpHR.

We uitgedrukt NpHR in motorische neuronen. Als we gestimuleerde enkele (1 ~ 2) segmenten van de VNC een gele laser tijdens de peristaltische spiersamentrekkingen werd voortplantende golf gearresteerd op de overeenkomstige segmenten van de lichaamswand (figuur 2). Vervolgens herstart de golf van de gearresteerde segmenten als we uitgeschakeld de laser verlichting 13.

50513fig1.jpg "alt =" Figuur 1 "fo: content-width =" 5.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg "/>
Figuur 1. Lokale activering van motorische neuronen met ChR2. A. Schema van de lokale activering van gefileerd voorbereiding. Door blauw-licht verlichting van enkele segmenten van de buikzenuwkoord uiten ChR2 in motorische neuronen, zijn spieren in de overeenkomstige segmenten gecontracteerd (pijlpunt). B. Transmissie beelden van een ontleed larve. Lokale verlichting van de buikzenuwkoord (pijlpunten) induceert segmentale samentrekking van het lichaam muur spieren (pijlen).

Figuur 1
Figuur 2. Lokale remming van motorische neuronen met NpHR. A. Schema van de lokale remming van gefileerd voorbereiding. Door gele-lechts verlichting van enkele segmenten van de buikzenuwkoord uiten NpHR in motorische neuronen, spieren samentrekken tijdens spontaan-voorgedaan peristaltische beweging (pijlpunt in de top) worden versoepeld (pijlpunt in de bodem.) B. Transmissie beelden van een ontleed larve . Lokale verlichting van de buikzenuwkoord (pijlpunten) ontspannen de spontaan-gecontracteerde body wandsegmenten (pijlen).

Discussion

Temporele en lokale verstoring van neurale activiteit is een waardevolle techniek voor het analyseren van het netwerk dynamiek van neurale circuits. In dit protocol presenteren we een methode om neurale activiteit manipuleren optogenetics met behulp van een laser. De laser hoge gerichtheid maakt meer gelokaliseerd optogenetic stimulatie dan breed veld stimulatie met behulp van kwik of Xenon lamp. Hoewel laser verlichting reeds toegepast optogenetics in eerdere studies, worden speciale opstellingen zoals glasvezel, micromanipulator en laserbron, vereist in de meeste eerdere studies. In dit protocol, maken we gebruik van een conventionele confocale microscopie voor lokale verlichting. Aangezien de confocale microscoop wordt veel gebruikt, zal deze werkwijze de mogelijkheid om hogere resolutie optogenetics in vele laboratoria openen.

Het protocol heeft twee kritieke punten: larvale dissectie en laservermogen. Ten eerste, als de hersenen, het ventrale zenuw snoer of een motorische zenuw beschadigd is During dissectie, zullen de larven minder vertonen of geen spontane peristaltische beweging. Precisie is daarom van essentieel belang, met name bij het maken van een incisie aan de rugzijde met veer schaar en het verwijderen van interne organen met een pincet. Details over de dissectie eerder 21 vermeld. Ten tweede, als er voldoende stimulatie te bereiken, een laservermogen van 0,1 ~ 1 mW / mm 2 voor ChR2 of 1 ~ 10 mW / mm 2 voor NpHR vereist. We evalueerden het laservermogen als totale lichtkracht hieronder een objectief lens gedeeld door een geschatte oppervlakte van verlichting. We meten het totale licht macht met behulp van een power meter (mobiken, Sanwa MI Technos, Japan). We schatten het gebied van verlichting als cirkelvormige constante maal het kwadraat van de golflengte van de laser, die ruwweg geeft verlicht gebied diffractielimiet. Effectieve lichtsterkte op het monster kan worden aangepast niet alleen door de kracht van de laser output, maar ook door het veranderen van de scansnelheid en gevoellooser herhalingen. We afgetast laser met 20-100 psec / pixel voor 63 keer. Bovendien, het expressieniveau van optogenetics eiwit en de hoeveelheid ATR ook kritiek voor stimulatie efficiency. Dienovereenkomstig, als larven toonde geen optogenetic respons, de volgende punten worden gecontroleerd en gecorrigeerd: 1) laservermogen (door het optimaliseren van microscoop-systeem), 2) expressie niveau van optogenetics eiwit (door te controleren genotype en opfok temperatuur), en 3) hoeveelheid ATR (door aanpassing van de concentratie van ATR en het voeden van de periode). NpHR vereist een hogere concentratie van ATR dan ChR2 doet door onbekende redenen 13. ChR2 werkt goed in larven opgekweekt in levensmiddelen die mindere ATR (bv. 0,1 mM) dan hier beschreven (1 mM). Zoals voeden de larven tot 1 mM ATR is voldoende voor het maken van ChR2 foto-reactief, adviseren wij deze concentratie voor de eerste proef in ChR2 experimenten. De concentratie van ATR kan vervolgens getitreerd neer van 1 mM. Met betrekking tot de blootstellingsduur voor ATR, raden wijde duur hier beschreven voor robuuste optogenetic controle. We vaak niet aan optogenetic reactie te observeren bij het voeren van larven te ATR voor kortere duur.

In dit protocol zijn laser-verlichting en beeldopname bediend door een aparte computer. Dus, duidelijke detectie van spatiotemporele patroon van laser verlichting door CCD-camera is van cruciaal belang voor data-analyse. Als laser spot of lijn is zwak op de afbeelding CCD, moet je de kracht van de halogeenlamp en de gain-waarde van de CCD-camera om de laser verlichting visualiseren terwijl lichaam muur zichtbaar te optimaliseren.

Spatiotemporele lichtinvalshoeken in dit protocol geeft informatie over larvale motorische circuits, maar de methode heeft een aantal beperkingen. Met betrekking tot de "ruimtelijke" aspect, de locatie van de verlichting wordt opgenomen beeld lage vergroting CCD gebruikt voor video-opnamen van het lichaam muur bewegingen door. Dienovereenkomstig, kan verlichting gebied worden toegewezen op segment niveau, maar niet op cellulair niveau. Wat de "temporal "aspect, tijd tussen het inschakelen van de laser scan door confocale microscoop en verlichting door laser hangt af van de confocale microscoop systeem aftasttoestand. Bijgevolg is wat testen proefondervindelijk moeten verlichting timing passen. Aangezien de timing van verlichting kunnen worden bepaald in CCD films met behulp van adequate software zoals ImageJ, de kritische factor in temporele resolutie is framesnelheid van CCD-camera beeldvorming. We zetten meestal de framesnelheid voor 7,5-15 frames per seconde.

Vooruitgang in optogenetic tools bieden ons een kans om dit protocol te wijzigen. We gebruikten 3 e instar larven bezitten OK6-Gal4 en UAS-ChR2 [H134R] of UAS-NpHR2. Andere optogenetic instrumenten in plaats van ChR2 [H134R] of NpHR2 zoals ChR2 [T159C/E123T], NpHR3 of Arch kan de efficiëntie van de activiteit controle 22 te verhogen. Bovendien, met behulp van andere gal4 lijnen of analyseren in andere ontwikkelingsstadia kan meer informatie over de motor circui biedents.

In dit protocol werd motoriek gevolgd door overdracht van de beelden bodywall contractie met een CCD camera. De activiteit van motorische neuronen met calcium-gevoelige fluorescentie-moleculen (bijv. GCaMP) kunnen ook rechtstreeks worden bewaakt terwijl manipuleren neurale activiteit ChR2 of NpHR. In dit geval worden blauw licht verlichting in een breed gebied en een zeer gevoelige CCD-camera (bijv. EMCCD camera) gebruikt in plaats van een halogeenlamp en de normale CCD camera eerder hierin beschreven. Ter verbetering van de ruimtelijke resolutie van de stimulatie tijdens controle bodywall beweging, met behulp van een extra objectief een meer geavanceerde methode kan zijn: verlichting van het ventrale zenuw snoer bij een hoge vergrotingsfactor objectief (bijv. 40x) uit boven het monster en controle bodywall door lage vergroting lens (bijvoorbeeld 4x) in het monster. Deze dual lens-systeem kan ons toelaten om het zenuwstelsel in een hogere ruimtelijke resolutie te stimuleren.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek inzake innovatieve Areas "Mesoscopic neurocircuitry" (nr. 22115002) en "Comprehensive Brain Science Network" (nr. 221S0003) van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap, en technologie, Japan naar AN en Grant-in-Aid for Young Scientists (B) (nr. 21700344) van Japan Vereniging voor de Bevordering van de Wetenschap (JSPS) naar HK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BX61WI Microscope Olympus Corporation BX61WI
Fluoview FV1000 confocal system Olympus Corporation FV1000
CCD camera Sony XCD-V60
all-trans retinal Sigma R2500-500MG 200 mM stock in 95% EtOH
Silpot184 Dow Corning Toray 3255981

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 48, 58-73 (2001).
  2. Fox, L. E., Soll, D. R., Wu, C. F. Coordination and modulation of locomotion pattern generators in Drosophila larvae: effects of altered biogenic amine levels by the tyramine beta hydroxlyase mutation. J. Neurosci. 26, 1486-1498 (2006).
  3. Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
  4. Gomez-Marin, A., Louis, M. Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than. Curr. Opin. Neurobiol. , (2011).
  5. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nat. Methods. , (2012).
  6. Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
  8. Miesenbock, G., Kevrekidis, I. G. Optical imaging and control of genetically designated neurons in functioning circuits. Annu. Rev. Neurosci. 28, 533-563 (2005).
  9. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
  10. Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
  11. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J. Neurophysiol. 101, 3075-3088 (2009).
  12. Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. Optogenetics in the teaching laboratory: using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in Drosophila. Adv. Physiol. Educ. 35, 82-91 (2011).
  13. Inada, K., Kohsaka, H., Takasu, E., Matsunaga, T., Nose, A. Optical dissection of neural circuits responsible for Drosophila larval locomotion with halorhodopsin. PLoS One. 6, e29019 (2011).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  15. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  16. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  17. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (1073).
  18. Hildebrand, E., Dencher, N. Two photosystems controlling behavioural responses of Halobacterium halobium. Nature. 257, 46-48 (1975).
  19. Takahashi, T., Mochizuki, Y., Kamo, N., Kobatake, Y. Evidence that the long-lifetime photointermediate of s-rhodopsin is a receptor for negative phototaxis in Halobacterium halobium. Biochem. Biophys. Res. Commun. 127, 99-105 (1985).
  20. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  21. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107 (2009).
  22. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).

Tags

Neurowetenschappen Moleculaire Biologie Neurobiologie Developmental Biology Biotechniek Cellular Biology Motor Neuronen Neurowetenschappen, Optogenetics Channelrhodopsin-2 Halorhodopsin laser confocale microscopie diermodel
Optogenetic Perturbation van neurale activiteit met Laser Verlichting in Semi-intacte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Motion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matsunaga, T., Fushiki, A., Nose,… More

Matsunaga, T., Fushiki, A., Nose, A., Kohsaka, H. Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion. J. Vis. Exp. (77), e50513, doi:10.3791/50513 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter