Summary
ここ半無傷でモータ出力の変化（筋収縮）を監視しながら、我々は運動神経活動のoptogenetic操作のためのプロトコルを記述
Abstract
ショウジョウバエ幼虫の運動は、回路1-6基礎となる神経細胞の成分の遺伝アクセシビリティーのおかげで、発達と生理的神経科学の素晴らしいモデルシステムです。幼虫の神経回路における光遺伝学7,8の適用は、私たちが空間的かつ時間的にパターン化された方法は9-13に神経活動を操作することができます。典型的には、試験片を広く水銀ランプで照明またはLEDので、ターゲットニューロンの特異性は、例えばたGal4-UAS装置14,15などのバイナリ遺伝子発現系によって制御されている。本研究では、 "サブ遺伝解像度"に空間分解能を向上させるために、我々は、ローカルで、従来の共焦点顕微鏡で実装レーザーを使用して腹側神経索のニューロンのサブセットを点灯。半無傷の幼虫の体壁の動きを監視している間、私たちは、対話的にアクティブ化またはチャネルロドプシン16,17 Oと神経活動を抑制したそれぞれRハロロドプシン18-20、。神経組織の空間的かつ時間的に制限された照明により、我々は行動の特定の段階で回路内の特定の神経細胞の活動を操作することができます。この方法では、腹側神経索とモータ出力の時空間パターンにおける局所神経アセンブリの活動との関係を研究するために有用です。
Introduction
ショウジョウバエの幼虫でフォワード蠕動運動は、前のセグメントの後方から筋収縮の伝播によって生じる。この運動は、長手方向の体軸に沿って腹神経索内で運動ニューロンの逐次的活性化によって実現される。このパターン化された伝播の活動の背後にある回路を調べるには、神経活動の局所摂動は有益なアプローチである可能性があります。薬理アッセイは神経組織でこのような神経伝達物質などの特定物質を、制御することができますが、幼虫の腹側神経索が縦軸に沿って似neuromeres成る反復構造であるため、薬理薬の効果は、ほぼすべてのセグメントの中で同じようなことができます。あるいは、一つのセグメントの少数のoptogeneticまたは温度感受性プローブ分子を発現することができる。しかしながら、このような特定のGAL4線を生成することは非常に困難である。ここで我々はいくつかのセグメントにニューロンを操作するための方法を提示レーザ照明を用いメンツ。共焦点顕微鏡における空間的に閉じ込められた照明の利点生かし、1は、ローカルエリアのニューロンの活動を混乱させることができます。ニューロン特異GAL4行のサブセットによってプローブの発現パターンと組み合わせることで、このレーザー照射法が大幅に摂動のために空間分解能を向上させます。この方法は唯一、従来の共焦点顕微鏡を必要とするためと、追加の実験装置の購入は通常必要ありません。
この手法を用いて、モータ出力13の伝搬時のモータ神経活動の役割を調べた。蠕動運動中にいくつかのセグメント内の運動ニューロンの活動を遮断することによって、我々は、運動ニューロン自体の活性はモータ出力信号の伝播のために必要とされるかどうかをテストすることができた。運動ニューロンのローカルおよび過渡封鎖は蠕動運動の伝播を逮捕した。封鎖は、プロを除去した後pagationは波が逮捕されたセグメントに現れた。この現象は、モータニューロンの活性化せず、伝播波が腹神経索に沿ってそれ以上進行しないことを示唆し、従って、運動ニューロンの活性化は、蠕動運動が必要である。我々は以前稲田ら （2011）13に詳細なデータと、この現象についての議論を報告している。ここでは、解剖幼虫の動きを監視しながら、インタラクティブに神経活動を混乱させる方法について説明します。さまざまなGAL4ラインと活動操作のための時空間パターンのシリーズを使用して、1つはモータ回路の摂動応答特性を通して回路ロジックを調べることができます。
Protocol
1。幼虫の準備
- 標準のフライ食品を含むプラスチックバイアル中UAS-NpHR2、UAS-ChR2をまたはOK6-Gal4の、OK6-Gal4ののフライラインを維持する。
- 適切な濃度で含まれている全トランスレチナールスプレッド酵母ペースト（ATR）（ChR2を、1 mMの、リンゴジュース寒天プレート上NpHR2ための10ミリメートル（略して "NpHR"）。
- バイアルからの第 2または第 3齢幼虫をピックアップし、ATR含有プレート上に置く。
- 25でそれらをリア適切な期間のために暗闇の中で℃（NpHRためにChR2を、2日間、1日。）
2。顕微鏡のセットアップ
- Cマウントアタッチメント（倍率0.35x）と、従来の共焦点顕微鏡（我々の場合、FV1000、オリンパス）とCCDカメラ（XCD-V60、ソニー）を取り付けます。
- 対物レンズからのレーザスキャン中に閉じCCDカメラへの光路に沿ってシャッターがある場合は、慎重にそれを削除します。このステップではミクロスに依存する必要に応じてセットアップ対応、技術サポートのために顕微鏡の製造元にお問い合わせください。
3。解剖
- 身体から残留食物を除去するために水でATR-飼育幼虫をすすぐ。
- SYLGARDコーティングディッシュ、背側を上（背側には、背側正中線の両側に1を縦方向に実行している2つの気管チューブを持っています）に幼虫を置く。 SYLGARDの厚さが5mm程度である。
- 鉗子（＃5イノックス、デュモンによってFST、スイス）と気管チューブの間に尻尾に虫ピン（アウステルリッツの昆虫ピン、Φ0.10mm、ステンレス製）を挿入します。ピンは、10mmの長さ約、曲がったり、対物レンズの表面を打撃し、損傷を避けるために（〜2ミリメートルの長さ）十分に短くなるようにカットする必要があります。その後、口フック、前端に黒い爪のような構造の近くに幼虫の頭の中に第二虫ピンを置く。
- のCa 2 +を含まない生理食塩水を（NaClを140mMの、塩化カリウム2mMの、MgCl 2を 6 mMの、HEPES-NaOHを5mMの追加、幼虫は湿った保つためにショ糖36 MM（pH7.1））。
- マイクロはさみ（MB-50-7、Napox、日本）と尾の近くに小さな切開を行います。
- 切開から、頭に向かって背側正中線に沿って縦方向のカットをする。腹側神経索（VNC）と軸索を損傷しないように注意してください。
- 横方向に頭に小さな切開を加えます。
- 解剖bodywallの各コーナーに4つのピンを配置します。体壁は、体壁の分節パターンを視覚化するのに十分な伸びが、蠕動運動を妨げないようにあまりにも多くする必要がある。
- 脳やVNCを除き内臓を外し、+フリー生理食塩水のCa 2でサンプルをすすいでください。
- 体壁に虫ピンの位置および向きを変化させることによって左右対称に腹神経索の向きを調整する。腹側神経索の位置を修正するには、SYLGARDまでフック脳と口の間の組織を通してピンを挿入します。 <李は> 2 mMのCa 2 +のリンゲル液（130mMのNaClを、KClを5mmのMgCl 2を 2mmのCaCl 2を 2 mMの、HEPES-NaOHを5mMの、ショ糖36 MM（pH7.3））でバッファを交換してください。
4。レーザー照明とイメージング
- 共焦点顕微鏡の4倍乾燥系対物レンズ（UPlanSApo 4倍、NA 0.16、オリンパス、日本）を取り付け、ステージ上の幼虫の準備を設定します。
- 共焦点顕微鏡によって腹側神経索を見つけるために赤色レーザー（633nmの）で解剖準備の透過画像を得る。このスキャンでは、それぞれ、ChR2をまたはNpHRの不要な刺激を誘発するか、または488nmの559nmレーザーを使用しないようにしてください。
- 透過像に関心領域（ROI）を定義します。ズームモードでは、ROIの詳細を決定するために有用である可能性があります。
- 488nmのまたは559nmの光を照射するために顕微鏡のフィルタセットを変更します。
- 体壁を可視化するためにハロゲンランプと準備を照らす。木曜日電子製剤は、共焦点顕微鏡に取り付けられたCCDカメラで監視することができる。
- 体壁の動きを記録し、動きを監視しながらオン·オフレーザビームを切り替える。
Representative Results
ChR2をと運動ニューロンのローカルおよび過渡活性化。
私たちは、運動ニューロンにChR2をを表明した。各VNCセグメントプロジェクトから体壁の対応するセグメントに新たな運動ニューロンの軸索。我々は、青色レーザVNCの1つまたは2つのセグメントを刺 激すると、対応するセグメント内の筋肉が収縮（ 図1）を示した。
NpHRと運動ニューロンのローカルおよび過渡抑制。
私たちは、運動ニューロンにおけるNpHRを表明した。我々は蠕動筋肉の収縮時に黄色のレーザーでVNCの少数（1〜2）セグメントを刺 激した場合には、伝搬波は、体壁の対応するセグメント（ 図2）で逮捕された。我々は、レーザー照射13を切ったときに、その後波が逮捕されたセグメントから再開。
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図1。フィレット準備の地元活性化のChR2を。A.スキームと運動ニューロンの局所活性化 。運動ニューロンにChR2をを表現する腹側神経索のいくつかのセグメントの青色光照射により、対応するセグメントの筋肉が（矢頭）と契約されています。解剖幼虫のB.伝送イメージは。腹神経索のローカル調光（矢印の頭）は、体壁の筋肉（矢印）の分節収縮を誘発する。
図2。フィレット準備のローカル阻害NpHR。A.スキームと運動ニューロンの局所阻害 。黄色Lで運動ニューロン、自発的に発生して蠕動運動（上の矢印頭）の間の筋肉の収縮緩和さでNpHRを表現腹神経索のいくつかのセグメントのightの照明解剖幼虫の（下の矢印頭。）B.透過画像 。腹側神経索の局所照明（矢頭）自発的に契約体壁セグメント（矢印）をリラックス。
Discussion
神経活動の時間的局所摂動は、神経回路網のダイナミクスを分析するための貴重なテクニックです。このプロトコルでは、レーザーを用いて光遺伝学によって神経活動を操作する手法を提案する。レーザーの高い方向性は水銀やキセノンランプを用いた広視野刺激よりもローカライズoptogenetic刺激を可能にします。レーザ照明が既に以前の研究で光遺伝学に適用されてきたが、ガラス繊維、マイクロマニピュレーター、レーザ光源などの特殊な設定は、ほとんどの先行研究で必要とされる。このプロトコルでは、我々は地元の照明のために、従来の共焦点顕微鏡を使用しています。共焦点顕微鏡システムが広く使用されているので、この方法は、多くのラボで高解像度の光遺伝学を適用する機会を開く。
幼虫の解剖とレーザーパワー：プロトコルは、2つの重要なポイントがあります。まず、脳、腹側神経索や運動神経はドゥリが破損している場合ngの解剖、幼虫は以下またはnone自発蠕動運動を示すであろう。精密スプリングはさみで背側に切り込みを作り、鉗子で内臓を取り外す場合は特に、不可欠です。解剖の詳細は以前に報告されている21。第二に、もし十分な刺激は、約0.1のレーザパワー〜ChR2をNpHR又は1〜10mWのための/ mm 2でが要求されるための1 mWの/ mm 2で達成されるべきである。我々は、照明のおおよその面積で割った対物レンズ下の総光パワーのレーザパワーを評価した。我々は、パワー·メータ（mobiken、三和MIテクノス、日本）を用いてトータル光パワーを測定した。私たちは、円形の定数倍とほぼ回折限界の照明領域を与えるレーザーの波長の2乗を照明の面積を推定した。試料上の有効な照明の電力は、走査速度およびしびれを変化させることにより、レーザの出力パワーによるものだけを調整することができるが、繰り返しのER。我々は63回20-100μ秒/ピクセルでレーザーをスキャンしました。また、光遺伝学蛋白質及びATRの量の発現レベルはまた、刺激効率のために重要である。従って、幼虫はないoptogenetic応答を示さなかった場合は、以下の点をチェックし、修正すべき：1）レーザパワー（顕微鏡システムを最適化することにより）、2）光遺伝学タンパク質の発現レベル（遺伝子型および飼育温度をチェックすることにより）、及び3）量ATR（ATR、供給期間の濃度を調整することにより）。 NpHR 13未知の理由により、ChR2を行いよりATRの高い濃度を必要とします。 ChR2をここで説明するよりも低いATR（ 例えば 0.1 mm）を（1 mM）を含む食品で飼育幼虫でうまく動作します。 1ミリメートルATRに幼生を供給すると、ChR2を光反応を行うために十分であるとして、我々はChR2を実験で最初の裁判のため、この濃度をお勧めします。 ATRの濃度は、その後、1 mMのから降りて滴定することができます。 ATRの露光期間と同様に、私たちはお勧め期間は堅牢optogenetic制御のため、ここで説明。私たちはしばしば、短い期間ATRに幼生を供給する際にoptogenetic応答を観察することができませんでした。
このプロトコルでは、レーザ照明および画像取得が別のコンピュータによって操作される。したがって、CCDカメラによるレーザ照射の時空間パターンを明確に検出、データ解析のために重要である。レーザスポット又はラインはCCDイメージに暗い場合には、ハロゲンランプと体壁を可視保ちながらレーザー照射を視覚化するCCDカメラのゲイン値のパワーを最適化する必要があります。
このプロトコルで示さ時空照明が幼虫のモーター回路に関する情報を提供しますが、方法はいくつかの制限があります。 "空間"の態様としては、照明の位置は、体壁の動きをビデオテープに録画に使用される低倍率のCCDイメージによって記録される。これにより、照射領域は、セグメント·レベルではなく、細胞レベルで割り当てることができる。 "tまでのようにemporal "の態様では、レーザーによる共焦点顕微鏡照明によりレーザ走査スイッチオン時間差は、共焦点顕微鏡システムとスキャン条件に依存するので、試行錯誤によっていくつかのテストは、照明タイミングを調整する必要がある。照射のタイミングにできるので、 ImageJのような適切なソフトウェアを使用してCCDイメージムービーで決定することが、時間分解能の重要な要因は、CCDカメラ画像のフレームレートです。我々は通常、毎秒7.5から15フレームのフレームレートを設定します。
optogeneticツールの進歩は、私たちは、このプロトコルを修正する機会を提供します。我々は第 3齢幼虫OK6-Gal4のを有するとUAS-ChR2を[H134R]またはUAS-NpHR2を使用していました。その他optogeneticツールの代わりにChR2を[H134R]またはNpHR2などChR2を[T159C/E123T]、NpHR3またはアーチがアクティビティコントロール22の効率を高めることができますように。加えて、他のGAL4線を使用したり、他の発達段階に分析することで、モータcircuiに関する詳細情報を提供することができるTS。
このプロトコルでは、運動活性をCCDカメラでbodywall収縮の透過画像でモニターした。 ChR2をまたはNpHRで神経活動を操作しながら、カルシウム感受性蛍光分子（ 例えば GCaMP）と運動ニューロンの活性を直接監視することができます。この場合には、広域かつ高感度CCDカメラ（ 例えば、カメラEMCCD）で青色光照明はハロゲンランプの代わりに用い、通常のCCDカメラが以前に本明細書に記載されている。低倍率の対物レンズによる試料と監視bodywall上方から高倍率の対物レンズ（40倍など ）による腹神経索の照明：追加の対物レンズを用いて、bodywallの動きを監視しながら、刺激の空間分解能を向上させるためには、より高度な方法とすることができる（ 例えば 4倍）サンプルの下。この二重レンズ系は、私たちは、より高い空間分解能で神経系を刺激することを可能にする。
Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Acknowledgments
この作品は、革新的な領域研究費補助金によってサポートされていました "メゾスコピックNeurocircuitry"（番号22115002）と文部科学省の "総合的な脳科学のネットワーク"（第221S0003）技術、日本と補助金日本学術振興会の若手研究（B）（番号21700344）（日本学術振興会）にHK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX61WI Microscope | Olympus Corporation | BX61WI | |
| Fluoview FV1000 confocal system | Olympus Corporation | FV1000 | |
| CCD camera | Sony | XCD-V60 | |
| all-trans retinal | Sigma | R2500-500MG | 200 mM stock in 95% EtOH |
| Silpot184 | Dow Corning Toray | 3255981 |
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