Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optogenetic Возмущение нейронной активности с лазерной подсветкой в ​​полу-нетронутыми Published: July 4, 2013 doi: 10.3791/50513
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Complexity Science and Engineering, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2Department of Physics, Graduate School of Science, The University of Tokyo

Summary

Здесь мы опишем протокол для optogenetic манипуляции мотонейронов деятельности, контролируя изменения в объемах производства двигателя (сокращение мышц) в полу-нетронутыми

Abstract

Дрозофилы личиночной передвижения является великолепной модели системы в развитии и физиологические неврологии, в силу генетической доступности основных компонентов нейронов в схемах 1-6. Применение Optogenetics 7,8 в личиночной нейронные цепи позволяет нам манипулировать нейронной активности в пространстве и во времени узорной способами 9-13. Как правило, образцы широко освещении ртутной лампы или светодиоды, так что специфичность нейронов-мишеней управляется двоичным экспрессии генов системы, такие как Gal4-UAS системы 14,15. В этой работе, чтобы улучшить пространственное разрешение, чтобы "к югу от генетических резолюцию», мы локально освещенных подмножество нейронов в вентральной нервной цепочки с использованием лазеров реализованы в обычной конфокальной микроскопии. Во время контроля движения тела стены полу-нетронутыми личинки, мы интерактивно активизируются или тормозятся нейронной активности с Channelrhodopsin 16,17 OR halorhodopsin 18-20, соответственно. По времени и пространстве ограниченного освещения нервной ткани, можно манипулировать активность специфических нейронов в цепи в определенной фазе поведение. Этот метод полезен для изучения связи между деятельностью местных нейронные сборки в брюшной нервной и пространственно-временную структуру мощность двигателя.

Introduction

Вперед перистальтическое передвижения у личинок дрозофилы происходит путем распространения мышечное сокращение от задней к передней сегментов. Это движение осуществляется путем последовательной активации моторных нейронов в брюшной нервной вдоль продольной оси тела. Чтобы изучить схемы за этой деятельностью распространяющегося с рисунком, локальное возмущение нейронной активности может быть информативным подходом. Хотя фармакологический тест может управлять конкретным веществом, таким как медиаторов, в нервной ткани, эффект фармакологических препаратов могут быть похожими между почти во всех сегментах, поскольку личиночной брюшной нервной повторяющийся структуру, состоящую из подобный neuromeres вдоль продольной оси. Альтернативно, можно выразить optogenetic или чувствительных к температуре молекул зонда в небольшом количестве сегментов. Однако такие конкретные gal4 линии очень трудно произвести. Здесь мы представляем метод для работы нейронов в нескольких сегментахния с помощью лазерного освещения. Воспользовавшись тем, что пространственно ограниченных освещение в конфокальной микроскопии, можно возмутить активность нейронов в локальной области. В сочетании с паттерном экспрессии зонде подмножества нейрон-специфической gal4 линии, этот метод лазерной подсветки значительно улучшает пространственное разрешение для возмущения. И так как этот метод требует только обычных конфокального микроскопа, приобретение дополнительного лабораторного оборудования, как правило, не требуется.

Используя эту технику, мы рассмотрели роль двигателя нейронной активности при распространении мощность двигателя 13. Блокируя деятельность моторные нейроны в течение нескольких сегментов во время перистальтики, мы смогли проверить, является ли активность моторных нейронов себя необходимой для распространения сигнала мощность двигателя. Местные и переходные блокады двигательных нейронов арестован распространения перистальтики. После блокады был удален, проpagation появились в сегменте, где волны были арестованы. Этот феномен предполагает, что без мотонейронов активации репродуктивный волны не может развиваться вдоль брюшной нервной дальше, и, таким образом активация двигательных нейронов является необходимым для перистальтического движения. Ранее мы уже сообщали подробные данные и дискуссии об этом явлении в Инада соавт. (2011) 13. Здесь мы описываем метод возмутить нейронной активности интерактивно в процессе мониторинга движения расчлененный личинок. Используя различные gal4 линии и серии пространственно-временной структуры для деятельности манипуляции, можно исследовать логическую схему через возмущения ответ свойств цепи двигателя.

Protocol

1. Личинки подготовка

  1. Поддерживать летать линии OK6-Gal4, UAS-ChR2 или OK6-Gal4, UAS-NpHR2 в пластиковых флаконах, содержащих стандартную еду лету.
  2. Распространение дрожжей паста, содержащая все-транс сетчатки (ATR) в соответствующих концентрациях (1 мМ для ChR2, 10 мм для NpHR2 ("NpHR" для краткости) на агар яблочный сок.
  3. Возьмите 2-го или 3-го возраста личинок из флаконов и положить их на ATR-содержащих пластины.
  4. Воспитывать их при 25 ° С в темноте в течение соответствующего периода времени (один день в течение ChR2, 2 дня NpHR).

2. Микроскоп установки

  1. Прикрепите ПЗС-камера (XCD-V60, Sony) с обычной конфокальной микроскопии (в нашем случае, FV1000, Olympus) с C-крепление для установки устройства (увеличение 0.35x).
  2. Если есть затвора вдоль пути света от объектива к ПЗС-камера, которая закрывается в процессе лазерного сканирования, удалить его тщательно. Поскольку это действие зависит от микроскопиисправиться установки, обратитесь к производителю микроскопом на техническую поддержку, если это необходимо.

3. Рассечение

  1. Промыть ATR кормили личинок с водой, чтобы удалить остатки пищи из тела.
  2. Поместите личинка на Sylgard покрытием чашке, спинной стороной вверх (спинной стороне имеет два трахеи трубы продольно, один обе стороны от средней линии спины). Толщина Sylgard составляет около 5 мм.
  3. Вставить насекомых штифт (контакты Аустерлицкой насекомых, Φ0.10mm, нержавеющая) в хвостовую между трахеи трубки с щипцы (# 5 Инокс, FST по Dumont, Швейцария). Булавки, около 10 мм длиной, должны быть согнуты или вырезать, чтобы быть достаточно коротким (~ 2 мм длиной), чтобы избежать удара и повреждения поверхности линзы объектива. Затем положите второй контакт насекомых в голову личинки близ устья крюк, черный коготь сооружение, похожее на переднем конце.
  4. Добавить Ca 2 +-Free физиологического раствора (NaCl 140 мм, 2 мМ KCl, MgCl 2 6 мМ HEPES-NaOH, 5 мм,Сахароза 36 мм (pH7.1)), чтобы сохранить личинки влажная.
  5. Сделайте небольшой надрез около хвоста с микро-ножницы (MB-50-7, Napox, Япония).
  6. От разреза, сделать продольный разрез по средней линии спины к голове. Будьте осторожны, чтобы не повредить брюшной нервной цепочки (VNC) и аксонов.
  7. Сделайте небольшой надрез во главе с боков.
  8. Поместите 4 контакта на каждом углу расчлененный bodywall. Стенки тела должны быть растянуты достаточно, чтобы визуализировать сегментарные структуры стенки тела, но не слишком много, чтобы помешать перистальтические движения.
  9. Снимите внутренние органы, за исключением мозга и VNC и промыть образца с Ca 2 +-Free нормального физиологического раствора.
  10. Отрегулируйте ориентацию брюшной нервной быть двусторонней симметричной, изменяя положение и ориентацию насекомых контакты на стенки тела. Чтобы исправить положение брюшной нервной, вставить штифт через ткань между мозгом и рот крюк вниз к Sylgard.
    11. <li> Замените буфер с 2 мМ Ca 2 + Рингера (130 мМ NaCl, KCl 5mm, MgCl 2 2мм, CaCl 2 2 мм HEPES-NaOH, 5 мм, 36 мм сахарозы (рН 7,3)).

4. Формирование изображений с помощью лазерного излучения

  1. Прикрепите 4x сухой объектив (UPlanSApo 4x, NA 0.16, Olympus, Япония) в конфокальной микроскопии и установите личинку подготовки на сцене.
  2. Получить передачи изображения расчлененных подготовки с помощью лазера красный (633 нм), чтобы найти брюшной нервной цепочки с помощью конфокальной микроскопии. Для этого сканирования, убедитесь, что не использовать 488nm или 559nm лазер, который вызывает нежелательную стимуляцию ChR2 или NpHR соответственно.
  3. Определение области интереса (ROI) на передачу изображения. Увеличенном режиме могут быть полезными для подробного определения рентабельности инвестиций.
  4. Изменить набор фильтров, микроскоп, чтобы осветить с 488nm или 559nm света.
  5. Осветить препарата с галогеновой лампы, чтобы визуализировать стенки тела. Thэлектронной препарат можно контролировать с ПЗС-камерой прикреплены к конфокальной микроскопии.
  6. Запись движения тела стены и переключатель лазерного луча и выключается во время контроля движения.

Representative Results

Местные и временную активацию мотонейронов с ChR2.

Мы выразили ChR2 в моторные нейроны. Аксоны двигательных нейронов выходят из каждого проекта сегмент VNC для соответствующего сегмента стенки тела. Когда мы стимулировали одного или двух сегментов VNC с синим лазером, мышцы в соответствующих сегментах выставлены сокращений (рис. 1).

Местные и переходные торможение моторных нейронов с NpHR.

Мы выразили NpHR в моторные нейроны. Когда мы стимулировали несколько (1 ~ 2) сегменты VNC с желтым во время лазерной перистальтические сокращения мышц, распространяющейся волны был арестован в соответствующих сегментах стенки тела (рис. 2). Тогда волновая повторяется с самого арестовали сегментов, когда мы выключили лазерной подсветки 13.

50513fig1.jpg "Alt =" Рисунок 1 "FO: Content-ширина =" 5.5in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg "/>
Рисунок 1. Локальная активация моторных нейронов с ChR2. А. Схема локальной активации филе подготовки. По синего света освещения нескольких сегментах брюшной нервной выразив ChR2 в моторные нейроны, мышцы в соответствующих сегментах по контракту (стрелки). B. Передача изображения расчлененных личинки. Местного освещения брюшной нервной цепочки (стрелки) индуцирует сегментарные сокращения мышц стенки тела (стрелки).

Рисунок 1
Рисунок 2. Местное ингибирование моторных нейронов с NpHR. А. Схема местного ингибирование филе подготовки. Желто-LIGHT освещения нескольких сегментах брюшной нервной выразив NpHR в моторные нейроны, мышцы во время сокращения спонтанно произошло перистальтические движения (стрелки в верхней части) находятся в расслабленном состоянии (стрелки в нижней.) B. Передача изображения расчлененных личинка . Местного освещения брюшной нервной цепочки (стрелки) расслабился спонтанно контракту стенки тела сегментов (стрелки).

Discussion

Временные и локальное возмущение нейронной активности является бесценным методику анализа динамики сеть нейронных цепей. В этом протоколе, мы представляем метод для манипулирования нейронной активности Optogenetics с помощью лазера. Высокая направленность лазерного позволяет более локализованным optogenetic возбуждения, чем широкое поле с помощью стимуляции ртуть или ксеноновая лампа. Хотя лазерные иллюминации уже была применена к Optogenetics в предыдущих исследованиях, специальные установки, такие как стекловолокно, микроманипулятор и лазерный источник, требуется в большинстве предыдущих исследований. В этом протоколе, мы используем обычные конфокальной микроскопии для местного освещения. Поскольку система конфокальной микроскопии широко используется этот метод откроет возможность применять более высокие Optogenetics разрешение во многих лабораториях.

Протокол имеет две критические точки: личиночной вскрытие и мощности лазера. Во-первых, если мозга, брюшной нервной или двигательный нерв поврежден Дуринг рассечение, личинки будет проявлять или никакие спонтанные перистальтики. Точность Поэтому крайне важно, особенно если сделать надрез на спинной стороне с пружинными ножницами и удаление внутренних органов щипцами. Подробнее о вскрытии были зарегистрированы ранее 21. Во-вторых, если достаточное возбуждение должно быть достигнуто, мощности лазера около 0,1 ~ 1 мВт / мм 2 для ChR2 или 1 ~ 10 мВт / мм 2 для NpHR не требуется. Мы оценили мощность лазера при общей мощности свет под объектив деленное на оценочную площадь освещения. Мы измерили общую мощность светового излучения с помощью измерителя мощности (mobiken, Sanwa MI Technos, Япония). Мы оценивали области освещения, как круговой постоянной на квадрат длины волны лазера, который дает примерно освещенной области в дифракционному пределу. Эффективная мощность подсветки на образец можно регулировать не только от мощности лазерного выход, но и путем изменения скорости сканирования и онемениеэ повторений. Мы просмотрели лазер с 20-100 мкс / пиксель для 63 раз. Кроме того, уровень экспрессии белка Optogenetics и количество ATR также имеют важное значение для стимулирования эффективности. Соответственно, если личинки не показали optogenetic ответ, следующие пункты должны быть проверены и исправлены: 1) мощность лазера (за счет оптимизации микроскопом системы), 2) уровень экспрессии белка Optogenetics (путем проверки генотипа и воспитания температура), и 3) количество ATR (путем регулирования концентрации АТР и период кормления). NpHR требует более высокой концентрации, чем ATR ChR2 делает по неизвестным причинам 13. ChR2 хорошо работает в личинки воспитанный в пищевые продукты, содержащие меньшее ATR (например, 0,1 мм), чем описано здесь (1 мм). Как кормление личинок до 1 мМ АТР, достаточных для оплаты ChR2 фотореактивными, мы рекомендуем эту концентрацию для первого судебного процесса в ChR2 экспериментов. Концентрация ATR впоследствии может быть титрованию вниз от 1 мМ. Что касается продолжительности воздействия для ATR, мы рекомендуемПродолжительность описанного здесь надежный контроль optogenetic. Мы часто не соблюдали optogenetic ответа при кормлении личинок ATR за короткий срок.

В этом протоколе, лазерное освещение и получения изображения находятся в ведении отдельного компьютера. Таким образом, ясно обнаружения пространственно-временной структуры лазерного освещения на ПЗС-камера имеет решающее значение для анализа данных. Если лазерное пятно или линия DIM ON изображения CCD, Вы должны оптимизировать мощность лампы галогенные и значение усиления ПЗС-камеры для визуализации лазерного освещения, сохраняя при этом стенки тела видны.

Пространственно-временные освещенности, приведенные в данном протоколе содержится информация о личиночной цепей двигателя, однако, метод имеет ряд ограничений. Что касается "пространственные" аспект, расположение освещения записывается малом увеличении CCD изображение, используемое для видеозаписи движения тела стены. Соответственно, область освещения могут быть назначены на уровне сегмента, но не на клеточном уровне. Что касается "Temporal "аспекте времени между включением лазерного сканирования с помощью конфокальной микроскопии и освещением лазерным зависит от конфокального микроскопа и системы сканирования состоянии. Следовательно, некоторые тестировании методом проб и ошибок требуется для регулировки освещения синхронизации. Поскольку времени освещения может определяется в ПЗС фильмы с помощью адекватного программного обеспечения, как ImageJ, решающим фактором временное разрешение частоту кадров CCD камера. Мы обычно устанавливают частоту кадров для 7,5-15 кадров в секунду.

Достижения в средствах optogenetic предоставить нам шанс изменить этот протокол. Мы использовали 3-го возраста личинки обладающих OK6-Gal4 и UAS-ChR2 [H134R] или UAS-NpHR2. Другие инструменты optogenetic вместо ChR2 [H134R] или NpHR2 таких как ChR2 [T159C/E123T], NpHR3 Arch или могут привести к росту эффективности деятельности управления 22. Кроме того, с помощью других линий или gal4 анализа в других стадиях развития может предоставить более подробную информацию о двигателе circuiTS.

В этом протоколе двигательной активности контролировали с помощью передачи изображений bodywall сжатие с ПЗС-камерой. Активности моторных нейронов с кальций-чувствительного флуоресценции молекулы (например GCaMP) также может быть непосредственно контролироваться при манипулировании нейронной активности с ChR2 или NpHR. В этом случае синий свет освещения в широкой области и высокочувствительных ПЗС-камера (например, EMCCD камеры) используют вместо галогенной лампы и нормальный ПЗС-камеры, описанного выше. Для улучшения пространственного разрешения в то время как стимуляция мониторинга bodywall движения, использования дополнительного объектива может быть более продвинутый метод: освещение брюшной нервной высоким увеличением объектива (например, 40x) сверху образца и мониторинга bodywall низким увеличением объектива (например, 4x) ниже образца. Эта двойная система линз может позволить нам стимулирования нервной системы в более высокое пространственное разрешение.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом-в-помощь для научных исследований в инновационных областях "Мезоскопическая Neurocircuitry» (№ 22115002) и "всеобъемлющей сети науки о мозге» (№ 221S0003) Министерства образования, культуры, спорта, науки, и технологии, Японии и субсидия для молодых ученых (B) (№ 21700344) Японии Общество содействия развитию науки (JSP) к HK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BX61WI Microscope Olympus Corporation BX61WI
Fluoview FV1000 confocal system Olympus Corporation FV1000
CCD camera Sony XCD-V60
all-trans retinal Sigma R2500-500MG 200 mM stock in 95% EtOH
Silpot184 Dow Corning Toray 3255981

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 48, 58-73 (2001).
  2. Fox, L. E., Soll, D. R., Wu, C. F. Coordination and modulation of locomotion pattern generators in Drosophila larvae: effects of altered biogenic amine levels by the tyramine beta hydroxlyase mutation. J. Neurosci. 26, 1486-1498 (2006).
  3. Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
  4. Gomez-Marin, A., Louis, M. Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than. Curr. Opin. Neurobiol. , (2011).
  5. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nat. Methods. , (2012).
  6. Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
  8. Miesenbock, G., Kevrekidis, I. G. Optical imaging and control of genetically designated neurons in functioning circuits. Annu. Rev. Neurosci. 28, 533-563 (2005).
  9. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
  10. Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
  11. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J. Neurophysiol. 101, 3075-3088 (2009).
  12. Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. Optogenetics in the teaching laboratory: using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in Drosophila. Adv. Physiol. Educ. 35, 82-91 (2011).
  13. Inada, K., Kohsaka, H., Takasu, E., Matsunaga, T., Nose, A. Optical dissection of neural circuits responsible for Drosophila larval locomotion with halorhodopsin. PLoS One. 6, e29019 (2011).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  15. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  16. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  17. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (1073).
  18. Hildebrand, E., Dencher, N. Two photosystems controlling behavioural responses of Halobacterium halobium. Nature. 257, 46-48 (1975).
  19. Takahashi, T., Mochizuki, Y., Kamo, N., Kobatake, Y. Evidence that the long-lifetime photointermediate of s-rhodopsin is a receptor for negative phototaxis in Halobacterium halobium. Biochem. Biophys. Res. Commun. 127, 99-105 (1985).
  20. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  21. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107 (2009).
  22. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).

Tags

Neuroscience выпуск 77 молекулярной биологии нейробиологии биологии развития биотехнологии клеточная биология двигательные нейроны нейронаук, Optogenetics Channelrhodopsin-2 Halorhodopsin лазер конфокальной микроскопии животной модели
Optogenetic Возмущение нейронной активности с лазерной подсветкой в ​​полу-нетронутыми<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки в движении
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matsunaga, T., Fushiki, A., Nose,… More

Matsunaga, T., Fushiki, A., Nose, A., Kohsaka, H. Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion. J. Vis. Exp. (77), e50513, doi:10.3791/50513 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter