Summary
Nous décrivons ici un protocole de manipulation optogenetic d'activité des motoneurones, tout en surveillant les changements dans la production automobile (contraction musculaire) en semi-intactes
Abstract
Drosophila larves de locomotion est un système modèle splendide de développement et physiologique neurosciences, en vertu de l'accessibilité génétique des composants neuronaux sous-jacents dans les circuits 1-6. Demande de optogenetics 7,8 dans le circuit neuronal larvaire nous permet de manipuler l'activité neuronale de manière spatialement et temporellement motifs 9-13. En règle générale, les spécimens sont largement éclairés par une lampe à mercure ou LED, donc la spécificité des neurones cibles est contrôlée par des systèmes d'expression de gènes binaires tels que le système Gal4-UAS 14,15. Dans ce travail, afin d'améliorer la résolution spatiale de «résolution sub-génétique», nous illuminés localement un sous-ensemble de neurones dans la moelle épinière ventrale utilisant des lasers mis en œuvre dans un microscope confocal classique. Tout en surveillant le mouvement de la paroi du corps des larves semi-intact, nous interactive activés ou inhibés activité neuronale avec channelrhodopsin 16,17 or halorhodopsine 18-20, respectivement. Par éclairage spatialement et temporellement limitée du tissu neural, on peut manipuler l'activité des neurones spécifiques dans le circuit lors d'une phase spécifique de comportement. Cette méthode est utile pour l'étude de la relation entre les activités d'un ensemble de neurones locale dans la moelle épinière ventrale et le modèle spatio-temporelle de la production automobile.
Introduction
Locomotion avant péristaltique larves de drosophile se produit par la propagation de la contraction musculaire postérieure à partir de segments antérieurs. Ce mouvement est réalisé par l'activation séquentielle des neurones moteurs au sein de la chaîne nerveuse ventrale le long de l'axe longitudinal du corps. Pour examiner le circuit derrière cette activité de propagation motifs, perturbation locale de l'activité neuronale pourrait être une approche informative. Bien test pharmacologique peut contrôler substance spécifique, comme neurotransmetteurs, dans le tissu neuronal, l'effet des médicaments pharmacologiques peuvent être similaires entre les segments presque tous parce que le cordon nerveux ventral larvaire est structure répétitive composée de neuromères similaires le long de l'axe longitudinal. Sinon, on pourrait exprimer optogenetic ou des molécules sondes sensibles à la température dans un petit nombre de segments. Toutefois, ces GAL4 lignes spécifiques sont très difficiles à générer. Nous présentons ici une méthode pour manipuler les neurones dans quelques segmentsments utilisant illumination laser. Profitant de l'éclairage dans l'espace confiné en microscopie confocale, on peut perturber l'activité des neurones dans une région. Combiné avec le profil d'expression de la sonde par sous-ensembles de GAL4 lignes spécifiques des neurones, cette méthode d'illumination laser améliore considérablement la résolution spatiale de perturbation. Et parce que cette méthode ne nécessite qu'un microscope confocal classique, l'achat de matériel de laboratoire supplémentaire n'est généralement pas nécessaire.
Grâce à cette technique, nous avons examiné le rôle de l'activité neuronale moteur lors de la propagation de sortie du moteur 13. En bloquant l'activité des neurones moteurs dans quelques segments pendant le mouvement péristaltique, nous avons pu tester si l'activité des neurones moteurs eux-mêmes est nécessaire pour la propagation du signal de sortie du moteur. Blocus locale et transitoire des neurones moteurs arrêté la propagation du mouvement péristaltique. Après le blocus a été enlevé, propagation est apparu sur le segment où la vague avait été arrêté. Ce phénomène suggère que, sans activation neuronale motrice, l'onde de multiplication ne peut progresser le long de la chaîne nerveuse ventrale plus loin, et ainsi l'activation des neurones moteurs est nécessaire pour le mouvement péristaltique. Nous avons précédemment rapporté des données détaillées et des discussions sur ce phénomène dans 13 Inada et al. (2011). Ici, nous décrivons la méthode de perturber l'activité neuronale interactive tout en surveillant le mouvement des larves disséquées. En utilisant diverses GAL4 lignes et des séries de motifs spatio-temporels pour la manipulation de l'activité, on peut enquêter sur un circuit logique à travers des propriétés de réponse de perturbation du circuit automobile.
Protocol
1. Les larves Préparation
- Maintenir voler lignes de OK6-Gal4, UAS-ChR2 ou OK6-Gal4, UAS-NpHR2 dans des flacons en plastique contenant de la nourriture à la mouche standard.
- Étendre la pâte levure contenant tout-trans rétinal (ATR) à des concentrations appropriées (1 mm pour ChR2, 10 mm pour NpHR2 ("NPHR" pour faire court) sur une plaque de gélose au jus de pomme.
- Ramassez 2 e ou 3 e stade larvaire des flacons et les mettre sur la plaque ATR contenant.
- Les élever à 25 ° C dans l'obscurité pendant une période de temps appropriée (1 jour pour ChR2, 2 jours pour NPHR.)
2. Configuration de microscope
- Joindre une caméra CCD (XCD-V60, Sony) à un microscope confocal classique (dans notre cas, FV1000, Olympus) avec une pièce jointe C-mount (grossissement 0,35 x).
- S'il ya un volet long de la trajectoire de la lumière de l'objectif de la caméra CCD, qui ferme pendant le balayage laser, retirez-le soigneusement. Comme cette étape dépend de la microsface configuration, contactez le fabricant de microscope pour le support technique, si nécessaire.
3. Dissection
- Rincer les larves ATR alimenté avec de l'eau pour enlever la nourriture résiduelle du corps.
- Mettre la chenille sur un plat revêtu Sylgard, côté dorsal vers le haut (du côté dorsal possède deux tubes trachéaux s'étendant longitudinalement, une de chaque côté de la ligne médiane dorsale). L'épaisseur de la Sylgard est d'environ 5mm.
- Insérez une broche insecte (broches d'insectes Austerlitz, Φ0.10mm, acier) dans la queue entre les trachées avec une pince (n ° 5 Inox, FST par Dumont, Suisse). Les Pins, à environ 10 mm de long, doivent être pliés ou découpés à être assez court (~ 2 mm de long) pour éviter de heurter et endommager la surface de l'objectif. Ensuite, mettre le deuxième axe d'insectes dans la tête de la larve à proximité de l'hameçon de la bouche, structure noire en forme de griffe à l'extrémité antérieure.
- Ajouter Ca 2 + solution saline normale sans (NaCl 140 mM, KCl 2 mM, MgCl2 6 mM, HEPES-NaOH 5 mM,Saccharose 36 mM (pH 7,1)) pour maintenir la larve humide.
- Faire une petite incision près de la queue avec micro ciseaux (MB-50-7, Napox, Japon).
- De l'incision, faire une coupe longitudinale le long de la ligne médiane dorsale vers la tête. Veillez à ne pas endommager le cordon nerveux ventral (VNC) et les axones.
- Faire une petite incision à la tête latéralement.
- Placez 4 broches à chaque coin de la paroi de corps disséqué. La paroi du corps doit être étiré assez de visualiser un modèle segmentaire de la paroi du corps, mais pas trop pour entraver le mouvement péristaltique.
- Retirez les organes internes, sauf pour le cerveau et le VNC et rincer l'échantillon avec Ca2 + sérum physiologique libres.
- Réglez l'orientation de la moelle épinière ventrale être bilatéralement symétriques en changeant la position et l'orientation des axes d'insectes sur la paroi du corps. Pour fixer la position de la corde nerveuse ventrale, insérer une aiguille à travers le tissu entre le cerveau et la bouche crochet vers le bas à la Sylgard. <li> Remplacer le tampon avec 2 mM de Ca 2 + solution Ringer (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 2 mM, HEPES-NaOH 5 mM, saccharose 36 mM (pH 7,3)).
4. Imaging avec éclairage laser
- Fixer un objectif sec 4x (UPlanSApo 4x, NA 0,16, Olympus, Japon) dans le microscope confocal et mettre la préparation de larve sur la scène.
- Obtenir une image de transmission de la préparation disséqué avec un laser rouge (633 nm) pour localiser la chaîne nerveuse ventrale par microscopie confocale. Pour cette analyse, assurez-vous de ne pas utiliser un laser 488nm ou 559nm, ce qui induit une stimulation indésirable de ChR2 ou NPHR, respectivement.
- Définir la région d'intérêt (ROI) sur l'image de transmission. Mode zoom pourrait être utile pour la détermination détaillée du retour sur investissement.
- Changez le jeu de filtres du microscope pour éclairer avec une lumière 488nm ou 559nm.
- Éclairer la préparation d'une lampe à halogène de visualiser la paroi du corps. Thpréparation de l'e peut être surveillé par une caméra CCD attaché au microscope confocal.
- Enregistrer le mouvement de la paroi du corps et de passer le faisceau laser sur et en dehors tout en surveillant le mouvement.
Representative Results
Activation locale et transitoire des neurones moteurs avec ChR2.
Nous avons exprimé ChR2 dans les neurones moteurs. Les axones des neurones moteurs émergeant de chaque projet de segment VNC à un segment correspondant de la paroi du corps. Lorsque nous avons stimulé un ou deux segments de la VNC avec un laser bleu, les muscles dans les segments correspondants exposés contractions (Figure 1).
Inhibition locale et transitoire des neurones moteurs avec NPHR.
Nous avons exprimé NPHR dans les neurones moteurs. Lorsque nous avons stimulé quelques (1 ~ 2) segments de la VNC avec un laser jaune pendant les contractions musculaires péristaltiques, l'onde se propageant a été arrêté sur les segments correspondants de la paroi du corps (figure 2). Puis la vague redémarré à partir des segments arrêtés lorsque nous avons éteint l'éclairage de laser 13.
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Figure 1. Activation locale des neurones moteurs avec ChR2. A. Schéma de l'activation locale de préparation filets. Par éclairage bleu-lumière de quelques segments de la moelle épinière ventrale exprimant ChR2 dans les neurones moteurs, les muscles dans les segments correspondants sont contractés (tête de flèche). B. images de transmission d'une larve disséqué. Illumination locale de la corde nerveuse ventrale (flèche têtes) induit la contraction segmentaire des muscles de la paroi du corps (flèches).
Figure 2. Inhibition locale des neurones moteurs avec NPHR. A. Schéma de l'inhibition locale de préparation filets. Par jaune-léclairage ight de quelques segments de la moelle épinière ventrale exprimant NPHR dans les neurones moteurs, la contraction des muscles pendant spontanément survenue mouvement péristaltique (tête de flèche en haut) sont détendus (tête de flèche dans le fond.) B. images de transmission d'une larve disséqué . Éclairage local de la moelle épinière ventrale (pointes de flèches) a assoupli les segments de la paroi du corps spontanément sous contrat (flèches).
Discussion
Perturbation temporelle et locale de l'activité neuronale est une technique précieuse pour analyser la dynamique du réseau de circuits neuronaux. Dans ce protocole, nous présentons une méthode pour manipuler l'activité neuronale par optogenetics l'aide d'un laser. Directivité élevée du laser permet une stimulation de optogenetic plus localisée que la stimulation de champ large utilisation du mercure ou une lampe au xénon. Bien illuminations laser ont déjà été appliquées à optogenetics dans les études précédentes, les configurations spéciales comme la fibre de verre, micromanipulateur, et source laser, sont nécessaires dans la plupart des études précédentes. Dans ce protocole, nous utilisons une microscopie confocale classique pour l'éclairage local. Puisque le système de microscope confocal est largement utilisée, cette méthode ouvre la possibilité d'appliquer optogenetics haute résolution dans de nombreux laboratoires.
Le protocole a deux points essentiels: la dissection des larves et la puissance du laser. Tout d'abord, si le cerveau, la moelle épinière ventrale ou un nerf moteur est endommagé Duridissection ng, les larves présentent moins ou pas du mouvement péristaltique spontanée. La précision est donc essentiel, surtout quand faire une incision sur la face dorsale avec des ciseaux à ressort et enlever les organes internes avec une pince. Les détails concernant la dissection ont été rapportés précédemment 21. En second lieu, si la stimulation est suffisante à atteindre, une puissance laser d'environ 0,1 à 1 mW / mm 2 pour CHR2 ou 1 ~ 10 mW / mm 2 pour NPHR est nécessaire. Nous avons évalué la puissance du laser en tant que puissance totale de lumière ci-dessous un objectif divisé par une surface estimée de l'illumination. Nous avons mesuré la puissance totale de la lumière à l'aide d'un wattmètre (mobiken, Sanwa MI Technos, Japon). Nous avons estimé de la zone d'illumination en tant que constante multipliée par la circulaire de carrés de la longueur d'onde du laser, ce qui donne plus ou moins la zone éclairée dans la limite de diffraction. Puissance efficace d'illumination de l'échantillon peut être réglée non seulement par la puissance de la sortie du laser, mais aussi en changeant la vitesse de balayage et engourdier de répétitions. Nous avons scanné au laser avec 20-100 ps / pixel pour 63 fois. En outre, le niveau d'expression de la protéine optogenetics et la quantité d'ATR sont également essentiels pour l'efficacité de la stimulation. Par conséquent, si les larves n'a montré aucune réponse optogenetic, les points suivants doivent être vérifiés et corrigés: 1) la puissance du laser (en optimisant le système de microscope), 2) le niveau d'expression de la protéine optogenetics (en cochant génotype et la température d'élevage), et 3) le montant de ATR (en ajustant la concentration d'ATR et la période d'alimentation). NPHR nécessite une concentration élevée d'ATR de ChR2 fait par des raisons inconnues 13. ChR2 fonctionne bien dans les larves élevées dans des aliments contenant moins ATR (par exemple 0,1 mm) que décrit ici (1 mM). Comme l'alimentation des larves de 1 mM ATR est suffisante pour faire ChR2 photo-réactif, nous vous recommandons cette concentration pour le premier procès en ChR2 expériences. La concentration des ATR peut ensuite être ajustée en baisse de 1 mM. Quant à la durée d'exposition pour ATR, nous recommandonsla durée décrite ici pour le contrôle de optogenetic robuste. Nous avons souvent échoué à observer la réponse optogenetic lors de l'alimentation des larves d'ATR pour une durée plus courte.
Dans ce protocole, illumination laser et d'acquisition d'image sont commandés par un ordinateur séparé. Ainsi, la détection précise de modèle spatio-temporel de l'illumination laser par la caméra CCD est essentiel pour l'analyse des données. Si spot laser ou la ligne est faible sur l'image CCD, vous devez optimiser la puissance de la lampe halogène et la valeur du gain de la caméra CCD pour visualiser l'illumination laser tout en gardant la paroi du corps visible.
Éclairage spatio-temporel indiqué dans ce protocole fournit des informations sur les circuits automobiles larvaires, mais la méthode a des limites. Quant à l'aspect «spatiale», l'emplacement de l'éclairage est enregistrée par l'image à faible grossissement CCD utilisé pour filmer les mouvements de la paroi du corps. En conséquence, la zone d'éclairement peut être affecté au niveau des segments, mais pas au niveau cellulaire. Quant à la "tTEMPORELLES "aspect, décalage dans le temps entre la mise sur le balayage laser par microscope confocal et l'éclairage par laser dépend du système de microscope confocal et l'état de numérisation. Par conséquent, des essais par tâtonnement est nécessaire d'ajuster le calendrier d'éclairage. Depuis le moment de l'illumination peut être déterminée dans les films d'image CCD en utilisant un logiciel adéquat comme ImageJ, le facteur critique dans la résolution temporelle est cadence de l'imagerie caméra CCD. Typiquement, nous fixons le taux de trame pour 7,5-15 images par seconde.
Les progrès dans les outils optogénétiques nous donnent une chance de modifier le présent protocole. Nous avons utilisé 3 e stade larvaire possédant OK6-Gal4 et UAS-ChR2 [H134R] ou UAS-NpHR2. D'autres outils de optogénétiques au lieu de ChR2 [H134R] ou NpHR2 comme ChR2 [T159C/E123T], NpHR3 ou Arc peuvent augmenter l'efficacité du contrôle de l'activité 22. En outre, l'utilisation d'autres GAL4 lignes ou de l'analyse à d'autres stades de développement peuvent fournir plus d'informations sur le moteur circuits.
Dans ce protocole, l'activité motrice a été contrôlé par des images de transmission de la contraction de la paroi de corps avec une caméra CCD. L'activité des neurones moteurs avec des molécules de fluorescence sensibles au calcium (par exemple GCaMP) peut également être directement contrôlée tout en manipulant l'activité neuronale avec ChR2 ou NPHR. Dans ce cas, l'éclairage lumière bleue dans un vaste domaine et d'une caméra CCD haute sensibilité (par exemple caméra EMCCD) sont utilisés au lieu d'une lampe halogène et la caméra CCD normale précédemment décrits. Pour améliorer la résolution spatiale de la stimulation tout en surveillant le mouvement de la paroi corporelle, en utilisant une lentille d'objectif supplémentaire peut être une méthode plus avancée: éclairement de la chaîne nerveuse ventrale par une lentille d'objectif à grossissement élevé (par exemple, 40x) à partir de dessus de l'échantillon et de contrôle de paroi corporelle par l'objectif à faible grossissement (par exemple, 4 x) au-dessous de l'échantillon. Ce système à double lentille peut nous permettre de stimuler le système nerveux en plus haute résolution spatiale.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de l'aide pour la recherche scientifique sur des domaines innovants "Mesoscopic circuits neuronaux» (n ° 22115002) et "Réseau de la science du cerveau global" (n ° 221S0003) du ministère de l'Education, Culture, Sports, Science, et de la technologie, du Japon à AN et Grant-in-Aid pour jeunes scientifiques (B) (n ° 21700344) de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) à Hong Kong
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX61WI Microscope | Olympus Corporation | BX61WI | |
| Fluoview FV1000 confocal system | Olympus Corporation | FV1000 | |
| CCD camera | Sony | XCD-V60 | |
| all-trans retinal | Sigma | R2500-500MG | 200 mM stock in 95% EtOH |
| Silpot184 | Dow Corning Toray | 3255981 |
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