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Neuroscience

세미 그대로의 레이저 조명과 신경 활동의 Optogenetic 섭동 Published: July 4, 2013 doi: 10.3791/50513
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Complexity Science and Engineering, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2Department of Physics, Graduate School of Science, The University of Tokyo

Summary

준 그대로의 모터 출력의 변화 (근육 수축) 모니터링하면서 여기에 우리가 motoneuronal 활동 optogenetic 조작에 대한 프로토콜을 설명

Abstract

초파리 유충의 운동력이 1-6 회로의 기본 연결을 구성 요소의 유전 접근의 미덕에 의해 개발 및 생리적 신경 과학의 훌륭한 모델 시스템입니다. 애벌레 신경 회로의 optogenetics 7,8의 응용 프로그램은 우리가 공간적 패턴 방법 9-13에 신경 활동을 조작 할 수 있습니다. 일반적으로 표본을 광범위 수은 램프 조명 LED를하는 경우, 대상 뉴런 너무 특이성 등 GAL4-UAS 시스템 14,15 같은 이진 유전자 발현 시스템에 의해 제어됩니다. 이 작품에서 "하위 유전 해결 방법"에 대한 공간 분해능을 향상시키기 위해, 우리는 로컬로 기존의 공 초점 현미경에 구현 된 레이저를 사용하여 복부 신경 코드의 뉴런의 하위 집합을 조명. 반 그대로 유충의 몸을 벽의 움직임을 모니터링하면서, 우리는 대화 형으로 활성화 또는 channelrhodopsin 16,17 O와 신경 활동을 억제각각 R halorhodopsin 18-20. 신경 조직의 공간적 및 시간적으로 제한된 조명함으로써, 우리는 행동의 특정 단계에서 회로의 특정 뉴런의 활동을 조작 할 수 있습니다. 이 방법은 복부 신경 코드를 로컬 신경 조립 및 모터 출력의 시공간적 패턴의 활동 사이의 관계를 연구하는 데 유용합니다.

Introduction

초파리 유충에서 앞으로 연동 운동은 전방 세그먼트 후방에서 근육 수축의 전파에 의해 발생합니다. 이 운동은 세로 몸 축을 따라 복부 신경 코드 내에서 모터 뉴런의 연속 활성화에 의해 실현됩니다. 이 패턴 전파 활동 뒤에 회로를 검사하려면, 신경 활동 지역의 섭동은 정보 접근 방법이 될 수 있습니다. 약물 분석은 신경 조직에서 신경 전달 물질과 같은 특정 물질을 제어 할 수 있지만 유충의 복부 신경 코드가 세로 축을 따라 유사한 neuromeres로 구성된 반복적 인 구조이므로, 약물 약물의 효과는 거의 모든 세그먼트 사이에서 유사 할 수 있습니다. 또한, 하나의 세그먼트 소수 optogenetic 또는 온도에 민감한 프로브 분자를 표현할 수 있습니다. 그러나, 특정 GAL4 라인을 생성하기가 매우 어렵습니다. 여기에서 우리는 몇 가지 세그먼트에서 뉴런을 조작하기위한 방법을 제시레이저 조명을 사용하여 사항. 공 초점 현미경 공간적으로 국한 조명의 장점 복용 한 지역에서 뉴런의 활동을 교란 할 수 있습니다. 뉴런 특정 GAL4 라인의 하위 집합으로 프로브의 발현 패턴과 결합,이 레이저 조명 방식은 크게 교란에 대한 공간 해상도를 향상시킵니다. 이 방법은 기존의 공 초점 현미경을 필요로하기 때문에, 추가 실험실 장비의 구입은 일반적으로 필요하지 않습니다.

이 기술을 사용하여, 우리는 모터 출력 13 전파하는 동안 모터 신경 세포 활동의 역할을 하였다. 연동 운동하는 동안 몇 가지 부분에서 모터 뉴런의 활동을 차단하여, 우리는 모터 신경 자체의 활동이 모터 출력 신호의 전파해야하는지 여부를 테스트 할 수 있었다. 모터 뉴런의 지역 및 과도 봉쇄 연동 운동의 전파를 체포. 봉쇄가 제거 된 후, 프로pagation는 파도가 체포되었다 세그먼트에 나타났다. 이 현상은 모터 신경 세포의 활성화없이 propagative 파가 더 복부 신경 코드를 따라 진행 할 수없는 제안, 따라서 모터 뉴런의 활성화는 연동 운동이 필요합니다. 우리는 이전이나 다 등. (2011) 13 자세한 데이터와이 현상에 대해 토론을보고했다. 여기, 우리는 해부 애벌레의 움직임을 모니터링하면서 대화식으로 신경 활동을 교란하는 방법을 설명합니다. 다양한 GAL4 라인과 활동 조작을위한 시공간 패턴의 시리즈를 사용, 하나는 모터 회로의 교란 응답 속성을 통해 회로 논리를 조사 할 수 있습니다.

Protocol

1. 애벌레 준비

  1. 표준 비행 음식을 포함하는 플라스틱 병에 UAS-ChR2 또는 OK6-GAL4, UAS - NpHR2, OK6-GAL4 라인 비행을 유지합니다.
  2. 확산 효모 적절한 농도 (ChR2 1 밀리미터, 사과 주스 한천 플레이트에 NpHR2 (줄여서 "NpHR")에 대한 10 MM에서 (ATR) 모든 트랜스 망막을 포함한 붙여 넣습니다.
  3. 유리 병에서 2 차 또는 3 차 instar의 유충을 선택하고 ATR 함유 접시에 넣어.
  4. 25 키우는 적절한 시간 동안 어둠 속에서 ° C (NpHR에 대한 ChR2 2 일 1 하루입니다.)

2. 현미경 설정

  1. C-마운트 부착 (배율 0.35x)와 기존의 공 초점 현미경 (우리의 경우, FV1000 올림푸스)에 CCD 카메라 (XCD-V60, 소니)를 연결합니다.
  2. 대물 렌즈의 레이저 스캔 중에 닫 CCD 카메라에 빛의 경로를 따라 셔터가 있으면 조심스럽게 제거합니다. 이 단계는 마이크로에 달려필요한 경우 설치에 대응, 기술 지원 현미경 제조업체에 문의하십시오.

3. 해부

  1. 몸에서 남아있는 음식을 제거하기 위해 물 ATR 자란 유충을 씻어.
  2. 실 가드 코팅 접시, 등쪽까지 (지느러미 쪽, 등쪽 정중선의 양쪽을 세로 방향으로 실행하는 두 기관 튜브가)에 유충을 넣어. 실 가드의 두께는 5mm 정도이다.
  3. 집게 (5 이녹스, 뒤몽 FST, 스위스)와 기관 튜브 사이의 꼬리에 곤충 핀 (리츠 곤충 핀, Φ0.10mm, 스테인리스)를 삽입합니다. 핀, 10mm 길이에 대해, 굽거나 대물 렌즈의 표면을 타격하고 손상을 방지하기 위해 (~ 2mm 길이)만큼 짧게 절단해야합니다. 그런 다음 입으로 훅, 앞쪽 끝에 검은 발톱 같은 구조 근처 유충의 머리에 두 번째 곤충 핀을 넣어.
  4. 칼슘 2 + 무료 생리 식염수 (염화나트륨 140 mm의, KCl을 2 개 mm, MgCl 2 6 mm의 HEPES-NaOH를 5 mM의 추가유충은 촉촉한 유지하는 자당 36 MM (pH7.1)).
  5. 마이크로 가위 (MB-50-7 Napox, 일본)와 꼬리 근처에 작은 절개를합니다.
  6. 절개에서 머리로 등쪽 정중선을 따라 길이 방향 절단을합니다. 복부 신경 코드 (VNC) 및 축삭 손상되지 않도록주의해야합니다.
  7. 옆 머리에 작은 절개를합니다.
  8. 해부 bodywall의 각 모서리에 4 개의 핀을 놓습니다. 몸 벽은 신체 벽의 분절 패턴을 시각화 할 수있을만큼 뻗어 있지만, 연동 운동을 방해하지 너무 많이해야합니다.
  9. 뇌와 VNC를 제외하고 내부 장기를 제거하고 + 무료 생리 식염수 칼슘과 샘플을 씻어.
  10. 몸을 벽에 곤충 핀의 위치와 방향을 변경하여 양측 대칭으로 복부 신경 코드의 방향을 조정합니다. 복부 신경 코드의 위치를​​ 수정하려면, 실 가드 아래로 연결 뇌와 입 사이의 조직을 통해 핀을 삽입합니다.
    11. <리> 2 mm 인 버퍼를 교체 칼슘 2 + 링거 용액 (NaCl을 130 MM의 KCl을 5MM, MgCl 2 2mm의 염화칼슘 2 MM의 HEPES-NaOH를 5 개 mm, 자당 36 MM (pH7.3)).

4. 레이저 조명과 영상

  1. 공 초점 현미경 배 건조 대물 렌즈 (UPlanSApo 배, NA 0.16, 올림푸스, 일본) 연결하고 무대에 유충 준비를 설정합니다.
  2. 공 초점 현미경 복부 신경 코드를 찾습니다 빨간 레이저 (633nm 인)를 해부 준비의 전송 이미지를 얻을 수 있습니다. 이 스캔 각각 ChR2 또는 NpHR의 불필요한 자극을 유도하는 488nm 또는 559nm 레이저를 사용하지 않도록합니다.
  3. 전송 된 이미지에 대한이자 (ROI)의 영역을 정의합니다. 확대 모드는 ROI의 자세한 결정에 유용 할 수 있습니다.
  4. 488nm 또는 559nm 빛으로 조명하는 현미경의 필터 설정을 변경합니다.
  5. 몸을 벽을 시각화 할로겐 램프의 준비를 조명. 목전자 준비는 공 촛점 현미경에 부착 된 CCD 카메라로 모니터링 할 수 있습니다.
  6. 몸을 벽의 움직임을 기록하고 움직임을 모니터링 상태에서 레이저 빔을 전환 끄십​​시오.

Representative Results

ChR2와 모터 뉴런의 지역 및 과도 활성화.

우리는 모터 뉴런에 ChR2을 표명했다. 각 VNC 세그먼트 프로젝트에서 몸을 벽의 해당 세그먼트에 새로운 모터 뉴런의 축삭. 우리는 블루 레이저로 VNC 중 하나 또는 두 개의 세그먼트를 자극하면 해당 세그먼트의 근육이 수축 (그림 1) 전시.

NpHR와 모터 뉴런의 지역 및 과도 억제.

우리는 모터 뉴런 NpHR을 표명했다. 우리는 연동 근육의 수축하는 동안 노란색 레이저 VNC의 몇 가지 (1 ~ 2) 세그먼트를 자극 할 때, 전파 전파은 신체 벽의 해당 부분 (그림 2)에서 체포되었다. 우리는 레이저 조명 13 꺼질 때 다음 파도가 체포 세그먼트에서 다시 시작됩니다.

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그림 1. ChR2와 모터 뉴런의 지역의 활성화. 필렛 준비의 지역 활성화 A. 체계. 모터 뉴런에 ChR2을 표현 복부 신경 코드의 몇 부분의 푸른 빛 조명으로, 해당 분야에서 근육 (화살표 머리) 계약을 체결하고 있습니다. 해부 유충의 B. 전송 이미지. 복부 신경 코드 지역의 조명 (화살표 머리) 체벽의 근육 (화살표)의 분절 수축을 유도합니다.

그림 1
그림 2. 필렛 준비의 로컬 억제 NpHR. A. 제도와 모터 뉴런의 지방 억제. 노랑 L 님모터 뉴런, 자발적-발생한 연동 운동 (상단에 화살표 머리) 동안 근육 수축 완화에 NpHR을 표현 복부 신경 코드의 몇 가지 세그먼트의 광명 조명 해부 유충 (바닥에 화살표 머리). B. 변속기 이미지 . 복부 신경 코드 (화살표 머리) 지역의 조명 자발적으로 계약 한 몸 벽 세그먼트 (화살표) 완화.

Discussion

신경 활동의 시간적, 지역 섭동은 신경 회로의 네트워크 역학 분석을위한 귀중한 기술이다. 이 프로토콜에서는, 우리는 레이저를 이용하여 optogenetics하여 신경 활동을 조작하는 방법을 제시한다. 레이저의 높은 방향성 수은 또는 크세논 램프를 사용하여 넓은 시야의 자극보다 더 지역화 optogenetic 자극 할 수 있습니다. 레이저 조명은 이미 이전의 연구에서 optogenetics에 적용되어 있지만, 같은 유리 섬유, micromanipulator에, 레이저 소스와 같은 특별한 설정은 대부분의 이전 연구에 필요합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 지역의 조명에 종래의 공 촛점 현미경을 사용합니다. 공 촛점 현미경 시스템이 널리 사용되기 때문에,이 방법은 많은 실험실에서보다 높은 해상도 optogenetics을 적용 할 수있는 기회가 열립니다.

유충의 해부 및 레이저 힘 : 프로토콜은 두 가지 중요한 포인트가 있습니다. 첫째, 뇌, 복부 신경 코드 또는 운동 신경 운영 시간에만 손상을 입히는 경우NG 해부, 유충이 덜 전시 또는 없음 자연스러운 연동 운동합니다. 정밀 스프링 가위 등의 측면에 절개를 만들고 집게와 내부 장기를 제거 할 때 특히 필수적이다. 해부에 대한 자세한 정보는 이전에 21보고되었습니다. 둘째, 만약 충분한 자극에 대한 0.1의 레이저 파워 ~ ChR2 또는 1 NpHR을위한 ~ 10 mW의 / mm 2가 필요합니다 1 mW의 / mm 2 달성 할 수있다. 우리는 조명의 예상 면적으로 나눈 대물 렌즈 아래에 총 빛의 힘으로 레이저 파워를 평가했다. 우리는 파워 미터 (mobiken, 산와 MI 테크노스, 일본)를 사용하여 전체 광 전력을 측정했다. 우리는 원형 일정한 시간 약 회절 한계에 조명 영역을 제공하는 레이저의 파장의 제곱 조명의 영역을 추정 하였다. 샘플에 효과적인 조명 전력은 스캔 속도와 감각을 변경하여도 레이저 출력의 힘에 의해뿐만 아니라 조정 할 수 있지만,반복 어. 우리는 63 시간을위한 20 ~ 100 마이크로 초 / 픽셀로 레이저를 검색합니다. 또한, optogenetics 단백질과 ATR의 양의 발현 수준은 자극 효율성을 위해 중요하다. 레이저 파워 (현미경 시스템을 최적화하여), 2) optogenetics 단백질의 발현 수준 (유전자형과 양육 온도를 확인하여), 3) 금액은 1) : 유충이 더 optogenetic 반응을 보였다 없을 경우 따라서, 다음 사항을 점검하고 수정해야합니다 ATR (ATR의 농도를 조정하고 기간을 공급하여). NpHR 13 알 수없는 이유에 의하여 ChR2보다 ATR의 높은 농도를 필요로합니다. ChR2는 여기에 설명 된 것보다 낮은 ATR (예를 들어 0.1 MM) (1 ㎜)를 포함하는 음식을 사육 유충에서 잘 작동합니다. 1 ㎜의 ATR에 유충을 먹이는 ChR2 사진 반응을 만들기위한 충분로서, 우리는 ChR2 실험의 첫 번째 재판이 농도를 권장합니다. ATR의 농도는 이후 1 ㎜에서 아래로 적정 할 수 있습니다. ATR에 대한 노출 기간에 관해서는, 우리는 추천기간은 강력한 optogenetic 제어를 위해 여기에 설명. 우리는 종종 짧은 기간 동안 ATR에 유충을 먹이 때 optogenetic 반응을 관찰하는 데 실패했습니다.

이 프로토콜에서는, 레이저 조명 및 이미지 수집은 별도의 컴퓨터에 의해 운영됩니다. 그래서, CCD 카메라로 레이저 조명의 시공간적 패턴의 명확한 탐지 데이터 분석을위한 중요합니다. 레이저 반점이나 줄이 CCD 이미지의 희미한 경우, 할로겐 램프 및 신체 벽에 볼을 유지하면서 레이저 조명을 시각화하는 CCD 카메라의 게인 값의 파워를 최적화합니다.

이 프로토콜에서와 같이 시공간 조명 애벌레 모터 회로에 대한 정보를 제공하지만, 방법은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 에 관해서는 "공간"부분, 조명의 위치는 몸을 벽의 움직임을 비디오 테이프에 사용되는 낮은 배율 CCD 이미지가 기록됩니다. 따라서, 조명 영역은 세포 수준에서 세그먼트 레벨에서 할당하지만 할 수 있습니다. "T에 관해서레이저로 공 초점 현미경 조명에 의해 레이저 스캔에 전환 사이 emporal "측면, 시간 지연은 공 촛점 현미경 시스템 및 스캔 상태에 따라 달라집니다. 따라서, 시행 착오에 의해 약간의 테스트가 조명 시간을 조절해야합니다. 조명의 타이밍이 할 수 있기 때문에, ImageJ에 같은 적절한 소프트웨어를 사용하여 CCD 이미지 영화에서 결정, 시간적 해상도에서 중요한 요소는 CCD 카메라 영상의 프레임 속도입니다. 우리는 일반적으로 초당 7.5-15 프레임에 대한 프레임 속도를 설정합니다.

optogenetic 도구의 발전은 우리에게이 프로토콜을 수정할 수있는 기회를 제공합니다. 우리는 제 3 령기 OK6-GAL4을 가진 애벌레와 UAS-ChR2 [H134R] 또는 UAS-NpHR2를 사용했습니다. 대신 ChR2의 다른 optogenetic 도구 [H134R] 또는 NpHR2 같은 ChR2로 [T159C/E123T] NpHR3 또는 아치 활동 제어 (22)의 효율을 높일 수 있습니다. 또한, 다른 GAL4 라인을 사용하거나 다른 발달 단계에서 분석하면 모터 circui에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다TS.

이 프로토콜에서는, 모터 활동은 CCD 카메라로 bodywall 수축의 전송 이미지에 의해 측정 하였다. ChR2 또는 NpHR과 신경 활동을 조작하면서 칼슘에 민감한 형광 분자 (예를 들면 GCaMP)와 모터 뉴런의 활동을 직접 모니터 할 수 있습니다. 이 경우, 광범위한 지역과 고감도 CCD 카메라 (예 : EMCCD 카메라)의 푸른 빛 조명은 할로겐 램프 대신에 사용하고 일반 CCD 카메라는 이전에 여기에 설명되어 있습니다. 낮은 배율 렌즈 샘플 및 모니터링 bodywall 위의 높은 배율의 대물 렌즈 (예를 들면 40 배)에 의해 복부 신경 코드의 조명 : 추가 대물 렌즈를 사용하여 모니터링 bodywall 운동은 더 진보 된 방법이 될 수 있지만 자극의 공간 분해능을 향상시키기 위해 (예 : 4 개) 샘플 아래에. 이 듀얼 렌즈 시스템은 우리가 높은 공간 해상도 신경계를 자극 할 수 있습니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

본 연구는 혁신 분야에서 과학 연구 보조금에 의해 지원되었다 "중시 Neurocircuitry"(제 22115002) 교육, 문화, 스포츠, 과학 기술부의 "포괄적 인 뇌 과학 네트워크"(제 221S0003) 기술에 일본과 그랜트 - 원조 일본 학술 진흥회의 젊은 과학자 (B) (제 21700344) (JSPS)로 HK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BX61WI Microscope Olympus Corporation BX61WI
Fluoview FV1000 confocal system Olympus Corporation FV1000
CCD camera Sony XCD-V60
all-trans retinal Sigma R2500-500MG 200 mM stock in 95% EtOH
Silpot184 Dow Corning Toray 3255981

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References

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Matsunaga, T., Fushiki, A., Nose, A., Kohsaka, H. Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion. J. Vis. Exp. (77), e50513, doi:10.3791/50513 (2013).

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