Neuroscience

अर्ध अक्षुण्ण में लेजर रोशनी के साथ तंत्रिका गतिविधि के optogenetic गड़बड़ी Published: July 4, 2013 doi: 10.3791/50513

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Teruyuki Matsunaga¹, Akira Fushiki¹, Akinao Nose^1,2, Hiroshi Kohsaka¹

¹Department of Complexity Science and Engineering, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, ²Department of Physics, Graduate School of Science, The University of Tokyo

Summary

अर्द्ध अक्षुण्ण में मोटर उत्पादन में परिवर्तन (मांसपेशी संकुचन) निगरानी रखते हुए यहाँ हम motoneuronal गतिविधि का optogenetic हेरफेर के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन

Abstract

ड्रोसोफिला लार्वा हरकत ^1-6 सर्किट में अंतर्निहित neuronal घटकों के आनुवंशिक पहुंच के आधार पर विकास और शारीरिक तंत्रिका विज्ञान में एक शानदार मॉडल प्रणाली है. लार्वा तंत्रिका सर्किट में optogenetics ^7,8 के अनुप्रयोग हमें spatially और अस्थायी नमूनों तरीके ^9-13 में neuronal गतिविधि में हेरफेर करने की अनुमति देता है. आमतौर पर, नमूनों को मोटे तौर पर एक पारा दीपक के साथ प्रकाशित या एलईडी हैं, लक्ष्य न्यूरॉन्स की इतनी विशिष्टता ऐसे Gal4-यूएएस प्रणाली ^14,15 रूप में द्विआधारी जीन अभिव्यक्ति सिस्टम के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. इस काम में, "उप आनुवंशिक संकल्प" के लिए स्थानिक संकल्प में सुधार करने के लिए, हम स्थानीय स्तर पर एक पारंपरिक confocal खुर्दबीन में लागू लेसरों का उपयोग उदर तंत्रिका की हड्डी में न्यूरॉन्स की एक सबसेट प्रबुद्ध. अर्द्ध बरकरार लार्वा के शरीर दीवार की गति की निगरानी करते हैं, हम सहभागी रूप सक्रिय या channelrhodopsin ^16,17 ओ के साथ तंत्रिका गतिविधि हिचकतेक्रमश: आर halorhodopsin ^18-20,. तंत्रिका ऊतक के स्थानिक और अस्थायी प्रतिबंधित रोशनी से, हम व्यवहार की एक विशिष्ट चरण में सर्किट में विशिष्ट न्यूरॉन्स की गतिविधियों में हेरफेर कर सकते हैं. इस विधि उदर तंत्रिका कॉर्ड में एक स्थानीय तंत्रिका विधानसभा और मोटर उत्पादन के spatiotemporal पैटर्न की गतिविधियों के बीच संबंधों के अध्ययन के लिए उपयोगी है.

Introduction

ड्रोसोफिला लार्वा में फॉरवर्ड क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला हरकत पूर्वकाल क्षेत्रों के लिए पीछे से मांसपेशियों में संकुचन के प्रसार के द्वारा होता है. इस प्रस्ताव अनुदैर्ध्य शरीर धुरी के साथ उदर तंत्रिका कॉर्ड के भीतर मोटर न्यूरॉन्स की अनुक्रमिक सक्रियण द्वारा एहसास है. इस नमूनों प्रचार गतिविधि के पीछे circuitry की जांच करने के लिए, तंत्रिका गतिविधि के स्थानीय गड़बड़ी एक जानकारीपूर्ण दृष्टिकोण हो सकता है. औषधीय परख तंत्रिका ऊतक में इस तरह के न्यूरोट्रांसमीटर के रूप में विशिष्ट पदार्थ, नियंत्रित कर सकते हैं हालांकि लार्वा उदर तंत्रिका कॉर्ड अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ समान neuromeres से बना दोहराए संरचना है, क्योंकि औषधीय दवाओं का असर लगभग सभी वर्गों के बीच समान हो सकता है. वैकल्पिक रूप से, एक के क्षेत्रों की एक छोटी संख्या में optogenetic या तापमान के प्रति संवेदनशील जांच के अणुओं को व्यक्त कर सकता है. हालांकि, इस तरह के विशिष्ट gal4 लाइनों उत्पन्न करने के लिए बहुत मुश्किल है. यहाँ हम कुछ seg में न्यूरॉन्स जोड़ तोड़ के लिए एक विधि प्रस्तुतलेजर रोशनी का उपयोग कर बयान. Confocal माइक्रोस्कोपी में स्थानिक सीमित रोशनी का लाभ उठाते हुए, एक एक स्थानीय क्षेत्र में न्यूरॉन्स की गतिविधियों उपद्रव कर सकते हैं. न्यूरॉन विशेष gal4 लाइनों के सबसेट द्वारा जांच की अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ संयुक्त, यह लेजर रोशनी विधि बहुत गड़बड़ी के लिए स्थानिक संकल्प में सुधार. इस पद्धति केवल एक पारंपरिक confocal सूक्ष्मदर्शी की आवश्यकता है और, क्योंकि अतिरिक्त प्रयोगशाला उपकरणों की खरीद आम तौर पर आवश्यक नहीं है.

इस तकनीक का उपयोग करना, हम मोटर उत्पादन ¹³ के प्रचार के दौरान मोटर neuronal गतिविधि की भूमिका की जांच की. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला प्रस्ताव के दौरान कुछ खंडों के भीतर मोटर न्यूरॉन्स की गतिविधियों को अवरुद्ध करके, हम मोटर न्यूरॉन्स को खुद की गतिविधि मोटर उत्पादन में संकेत के प्रसार के लिए आवश्यक है कि क्या परीक्षण करने में सक्षम थे. मोटर न्यूरॉन्स की स्थानीय और क्षणिक नाकाबंदी क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला प्रस्ताव के प्रसार को गिरफ्तार कर लिया. नाकाबंदी हटा दिया गया था, के बाद समर्थकpagation लहर गिरफ्तार किया गया था जहां खंड में दिखाई दिया. इस घटना मोटर neuronal सक्रियण के बिना, प्रसारात्मक लहर किसी भी आगे उदर तंत्रिका की हड्डी के साथ प्रगति नहीं कर सकते हैं कि पता चलता है, और इस प्रकार मोटर न्यूरॉन्स की सक्रियता क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला प्रस्ताव के लिए आवश्यक है. हम पहले से Inada एट अल. (2011) ¹³ में विस्तृत डेटा और इस घटना के बारे में विचार विमर्श की सूचना दी है. यहाँ, हम विच्छेदित लार्वा की गति की निगरानी करते हुए सहभागी रूप तंत्रिका गतिविधि उपद्रव करने के लिए विधि का वर्णन है. विभिन्न gal4 लाइनों और गतिविधि में गड़बड़ी के लिए spatiotemporal पैटर्न की श्रृंखला का उपयोग करना, एक मोटर सर्किट की गड़बड़ी प्रतिक्रिया गुणों के माध्यम से circuitry के तर्क की जांच कर सकते हैं.

Protocol

1. लार्वा तैयारी

मानक मक्खी भोजन युक्त प्लास्टिक की शीशियों में यूएएस ChR2 या OK6-Gal4, यूएएस NpHR2, OK6-Gal4 की तर्ज उड़ बनाए रखें.
बिखरा खमीर उचित सांद्रता (ChR2 के लिए 1 मिमी, एक सेब का रस अगर प्लेट पर NpHR2 (छोटे के लिए "NpHR") के लिए 10 मिमी पर (एटीआर) सब पार रेटिना युक्त पेस्ट.
शीशियों से ² या ³ instar लार्वा उठाओ और एटीआर युक्त थाली पर डाल दिया.
25 में उन्हें पीछे के समय का एक उचित अवधि के लिए अंधेरे में डिग्री सेल्सियस (NpHR लिए ChR2, 2 दिनों के लिए 1 दिन.)

2. माइक्रोस्कोप सेटअप

एक C-माउंट लगाव (बढ़ाई 0.35x) के साथ एक पारंपरिक confocal सूक्ष्मदर्शी (हमारे मामले में, FV1000, ओलिंप) के लिए एक सीसीडी कैमरा (XCD-V60, सोनी) संलग्न.
उद्देश्य लेंस से लेजर स्कैनिंग के दौरान बंद कर देता है जो सीसीडी कैमरा, के लिए प्रकाश मार्ग के किनारे एक शटर नहीं है, तो इसे ध्यान से हटा दें. इस चरण माइक्रो पर निर्भर करता हैयदि आवश्यक हो तो सेटअप सामना, तकनीकी सहायता के लिए माइक्रोस्कोप निर्माता से संपर्क करें.

3. विच्छेदन

शरीर से अवशिष्ट भोजन को दूर करने के लिए पानी के साथ एटीआर से सिंचित लार्वा कुल्ला.
एक Sylgard लेपित पकवान, पृष्ठीय पक्ष (पृष्ठीय पक्ष, पृष्ठीय midline के दोनों ओर एक अनुलंबीय चल रहे दो सांस की नली ट्यूब है) पर लार्वा रखो. Sylgard की मोटाई के बारे में 5 मिमी है.
संदंश (# 5 आईनॉक्स, Dumont द्वारा एफ एस टी, स्विट्जरलैंड) के साथ सांस की नली ट्यूब के बीच पूंछ में एक कीट पिन (Austerlitz कीट पिन, Φ0.10mm, स्टेनलेस) डालें. पिन, 10mm लंबे समय के बारे में, तुला या उद्देश्य लेंस की सतह से टकराने और हानिकारक से बचने के लिए (~ 2mm लंबे) काफी कम होने की कटौती की जानी चाहिए. फिर मुंह हुक, पूर्वकाल अंत में काले पंजों की तरह संरचना के पास लार्वा के सिर में दूसरे कीट पिन डाल दिया.
सीए ^{2 +} मुक्त सामान्य नमक (NaCl 140 मिमी, KCl 2 मिमी, ₂ MgCl 6 मिमी, HEPES-NaOH के 5 मिमी, जोड़ेंलार्वा नम रखने के लिए सुक्रोज 36 मिमी (pH7.1)).
सूक्ष्म कैंची (MB-50-7, Napox, जापान) के साथ पूंछ के पास एक छोटा सा चीरा.
चीरा से, सिर की ओर पृष्ठीय midline के साथ एक अनुदैर्ध्य काट कर. उदर तंत्रिका कॉर्ड (VNC) और axons नुकसान नहीं सावधान रहो.
पार्श्वतः सिर पर एक छोटा सा चीरा.
विच्छेदित bodywall के प्रत्येक कोने में 4 पिन रखें. शरीर दीवार शरीर दीवार की एक कमानी पैटर्न कल्पना करने के लिए काफी बढ़ाया, लेकिन क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला गति में बाधा के लिए बहुत ज्यादा नहीं होना चाहिए.
मस्तिष्क और VNC के लिए छोड़कर आंतरिक अंगों निकालें और ⁺ मुक्त सामान्य नमक ² सीए के साथ नमूना कुल्ला.
शरीर दीवार पर कीट पिन की स्थिति और अभिविन्यास बदलकर द्विपक्षीय सममित होना उदर तंत्रिका कॉर्ड के उन्मुखीकरण को समायोजित करें. उदर तंत्रिका कॉर्ड की स्थिति को ठीक करने के लिए, Sylgard करने के लिए नीचे हुक मस्तिष्क और मुंह के बीच ऊतक के माध्यम से एक पिन डालने.

^{2 +}

₂

4. लेजर रोशनी के साथ इमेजिंग

Confocal खुर्दबीन में एक 4x शुष्क उद्देश्य लेंस (UPlanSApo 4x, एनए 0.16, ओलिंप, जापान) देते हैं और मंच पर लार्वा तैयारी सेट.
Confocal खुर्दबीन द्वारा उदर तंत्रिका कॉर्ड पता लगाने के लिए एक लाल लेजर (633nm) के साथ विच्छेदित तैयारी की एक संचरण छवि प्राप्त करते हैं. इस स्कैनिंग के लिए, क्रमशः, ChR2 या NpHR के अवांछित उत्तेजना को प्रेरित करता है जो एक 488nm या 559nm लेजर, का उपयोग नहीं करना सुनिश्चित करें.
संचरण छवि पर ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र को परिभाषित करें. तेजी से बढ़ी मोड रॉय की विस्तृत निर्धारण के लिए उपयोगी हो सकता है.
488nm या 559nm प्रकाश से रोशन करने के लिए माइक्रोस्कोप की फिल्टर सेट बदलें.
शरीर दीवार कल्पना करने के लिए एक हलोजन दीपक के साथ तैयारी रोशन. गुई तैयारी confocal खुर्दबीन से जुड़ी एक सीसीडी कैमरे से नजर रखी जा सकती है.
शरीर दीवार की गति रिकार्ड और गति की निगरानी करते हुए पर लेजर बीम स्विच और बंद.

Representative Results

ChR2 साथ मोटर न्यूरॉन्स की स्थानीय और क्षणिक सक्रियण.

हम मोटर न्यूरॉन्स में ChR2 व्यक्त की. प्रत्येक वीएनसी खंड परियोजना से शरीर दीवार के इसी क्षेत्र के लिए उभरती मोटर न्यूरॉन्स के axons. हम एक नीले लेजर के साथ वीएनसी में से एक या दो क्षेत्रों को प्रेरित करते हैं, इसी सेगमेंट की मांसपेशियों में संकुचन (चित्रा 1) का प्रदर्शन किया.

NpHR साथ मोटर न्यूरॉन्स की स्थानीय और क्षणिक अवरोध.

हम मोटर न्यूरॉन्स में NpHR व्यक्त की. हम क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला मांसपेशियों के संकुचन के दौरान एक पीले रंग की लेजर के साथ VNC के कुछ (1 ~ 2) क्षेत्रों को प्रेरित करते हैं, प्रचार लहर शरीर दीवार के इसी खंड (चित्रा 2) में गिरफ्तार किया गया था. हम लेजर रोशनी ¹³ बंद फिर जब लहर गिरफ्तार क्षेत्रों से पुनः आरंभ.

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चित्रा 1. ChR2 साथ मोटर न्यूरॉन्स की स्थानीय सक्रियण. Filleted तैयारी की स्थानीय सक्रियण के ए स्कीम. मोटर न्यूरॉन्स में ChR2 व्यक्त उदर तंत्रिका कॉर्ड के कुछ क्षेत्रों की नीली बत्ती रोशनी से, इसी सेगमेंट में मांसपेशियों (तीर सिर) के लिए अनुबंधित किया जाता है. विच्छेदित लार्वा के बी ट्रांसमिशन छवियों. उदर तंत्रिका कॉर्ड के स्थानीय रोशनी (तीर सिर) शरीर दीवार मांसपेशियों (तीर) के कमानी संकुचन लाती है.

चित्रा 1
चित्रा 2. Filleted तैयारी की स्थानीय निषेध की NpHR. ए स्कीम के साथ मोटर न्यूरॉन्स की स्थानीय निषेध. पीले एल द्वारामोटर न्यूरॉन्स, अनायास-हुआ क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला गति (शीर्ष में तीर सिर) के दौरान मांसपेशियों में संकुचन आराम कर रहे हैं में NpHR व्यक्त उदर तंत्रिका कॉर्ड के कुछ क्षेत्रों की ight रोशनी एक विच्छेदित लार्वा की (नीचे में तीर सिर.) बी ट्रांसमिशन छवियों . उदर तंत्रिका कॉर्ड (तीर सिर) की स्थानीय रोशनी अनायास अनुबंधित शरीर दीवार क्षेत्रों (तीर) आराम.

Discussion

तंत्रिका गतिविधि के अस्थायी और स्थानीय गड़बड़ी तंत्रिका सर्किट के नेटवर्क गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक अमूल्य तकनीक है. इस प्रोटोकॉल में, हम एक लेजर का उपयोग optogenetics द्वारा तंत्रिका गतिविधि में हेरफेर करने के लिए एक तरीका मौजूद है. लेजर के उच्च दिशात्मकता पारा या क्सीनन दीपक का उपयोग कर व्यापक क्षेत्र उत्तेजना से अधिक स्थानीय optogenetic उत्तेजना की अनुमति देता है. लेजर illuminations पहले से ही पिछले अध्ययनों में optogenetics के लिए लागू किया गया है, जैसे कि फाइबर ग्लास, micromanipulator, और लेजर स्रोत के रूप में विशेष सेटअप के सबसे पिछले अध्ययनों में आवश्यक हैं. इस प्रोटोकॉल में, हम स्थानीय रोशनी के लिए एक पारंपरिक confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें. Confocal खुर्दबीन प्रणाली व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है, इस विधि के कई प्रयोगशालाओं में उच्च संकल्प optogenetics लागू करने के लिए अवसर खुल जाएगा.

लार्वा विच्छेदन और लेजर शक्ति: प्रोटोकॉल दो महत्वपूर्ण अंक हैं. सबसे पहले, मस्तिष्क, उदर तंत्रिका कॉर्ड या एक मोटर तंत्रिका duri क्षतिग्रस्त हैएनजी विच्छेदन, लार्वा कम दिखा रहे हैं या कोई भी सहज क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला गति देगा. प्रेसिजन वसंत कैंची के साथ पृष्ठीय पक्ष पर एक चीरा और संदंश के साथ आंतरिक अंगों को हटाने, खासकर जब इसलिए आवश्यक है. विच्छेदन के बारे में विवरण पहले से ²¹ सूचित किया गया है. दूसरे, अगर पर्याप्त उत्तेजना, के बारे में 0.1 की एक लेजर बिजली ~ ChR2 या 1 NpHR के लिए ~ 10 मेगावाट / ² मिमी की आवश्यकता है के लिए 1 मेगावाट / ² मिमी प्राप्त किया जा रहा है. हम रोशनी की अनुमानित क्षेत्र से विभाजित एक उद्देश्य लेंस के नीचे कुल प्रकाश शक्ति के रूप में लेजर शक्ति का मूल्यांकन किया. हम एक बिजली मीटर (mobiken, Sanwa एमआई प्रौद्योगिकी में, जापान) का उपयोग करते हुए कुल प्रकाश शक्ति मापा. हम परिपत्र लगातार बार लगभग विवर्तन सीमा में प्रबुद्ध क्षेत्र देता है जो लेजर की तरंग लंबाई के वर्ग के रूप में रोशनी के क्षेत्र का अनुमान है. नमूना पर प्रभावी रोशनी शक्ति स्कैनिंग गति और सुन्न बदलकर भी लेजर उत्पादन की शक्ति से न केवल समायोजित किया जा सकता, लेकिनrepetitions के एर. हम 63 बार के लिए 20-100 μsec / पिक्सेल लेजर स्कैन. इसके अलावा, optogenetics प्रोटीन और एटीआर की राशि की अभिव्यक्ति के स्तर भी उत्तेजना क्षमता के लिए महत्वपूर्ण हैं. लेजर शक्ति (माइक्रोस्कोप प्रणाली के अनुकूलन के द्वारा), 2) optogenetics प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर (जीनोटाइप और पालन के तापमान की जाँच करके), और 3) राशि की: 1) लार्वा नहीं optogenetic प्रतिक्रिया दिखाई अगर तदनुसार, निम्नलिखित बातों की जाँच की और सही किया जाना चाहिए एटीआर (एटीआर की एकाग्रता का समायोजन और अवधि खिला द्वारा). NpHR ¹³ अज्ञात कारणों से ChR2 करता है एटीआर के उच्च एकाग्रता की आवश्यकता है. ChR2 यहाँ वर्णित से कम एटीआर (जैसे 0.1 मिमी) (1 मिमी) युक्त भोजन में पाला लार्वा में अच्छी तरह से काम करता है. 1 मिमी एटीआर को लार्वा खिला ChR2 फोटो प्रतिक्रियाशील बनाने के लिए पर्याप्त है, हम ChR2 प्रयोगों में पहली बार परीक्षण के लिए इस एकाग्रता की सलाह देते हैं. एटीआर की एकाग्रता बाद में 1 मिमी से नीचे titrated किया जा सकता है. एटीआर के लिए जोखिम अवधि के रूप में, हम अनुशंसा करते हैंअवधि मजबूत optogenetic नियंत्रण के लिए यहाँ वर्णित है. हम अक्सर छोटी अवधि के लिए एटीआर को लार्वा खिला जब optogenetic प्रतिक्रिया का पालन करने में विफल रहा.

इस प्रोटोकॉल में, लेजर रोशनी और छवि के अधिग्रहण के लिए एक अलग से कंप्यूटर द्वारा संचालित कर रहे हैं. तो, सीसीडी कैमरा द्वारा लेजर रोशनी के spatiotemporal पैटर्न का स्पष्ट पता लगाने डेटा विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है. लेजर स्पॉट या लाइन सीसीडी छवि पर मंद है, तो आप हलोजन दीपक और शरीर दीवार दिखाई रखते हुए लेजर रोशनी कल्पना करने के लिए सीसीडी कैमरे का लाभ मूल्य की शक्ति का अनुकूलन करना चाहिए.

इस प्रोटोकॉल में दिखाया spatiotemporal रोशनी लार्वा मोटर सर्किट पर जानकारी प्रदान करता है, लेकिन, विधि कुछ सीमाएँ हैं. के रूप में "स्थानिक" पहलू, रोशनी का स्थान शरीर दीवार आंदोलनों videotaping के लिए इस्तेमाल कम बढ़ाई सीसीडी छवि द्वारा दर्ज की गई है. तदनुसार, रोशनी क्षेत्र सेलुलर स्तर पर खंड स्तर पर सौंपा है, लेकिन नहीं किया जा सकता है. "टी के रूप मेंलेजर द्वारा confocal खुर्दबीन और रोशनी से लेजर स्कैन पर स्विचन के बीच emporal "पहलू, समय अंतराल confocal खुर्दबीन प्रणाली और स्कैनिंग हालत पर निर्भर करता है. नतीजतन, परीक्षण और त्रुटि से कुछ परीक्षण रोशनी समय को समायोजित करने के लिए आवश्यक है. रोशनी के समय कर सकते हैं के बाद से ImageJ तरह पर्याप्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सीसीडी छवि फिल्मों में निर्धारित किया, अस्थायी समाधान में महत्वपूर्ण कारक सीसीडी कैमरा इमेजिंग के फ्रेम दर है. हम आम तौर पर प्रति सेकंड 7.5-15 फ्रेम के लिए फ्रेम दर निर्धारित किया है.

Optogenetic उपकरणों के क्षेत्र में अग्रिम हमें इस प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए एक मौका प्रदान करते हैं. हम 3 ^Rd instar OK6-Gal4 रखने लार्वा और यूएएस ChR2 [H134R] या यूएएस NpHR2 इस्तेमाल किया. बजाय ChR2 की अन्य optogenetic उपकरण [H134R] या NpHR2 ऐसे ChR2 रूप [T159C/E123T], NpHR3 या आर्क गतिविधि नियंत्रण ²² की दक्षता को बढ़ा सकते हैं. इसके अलावा, अन्य gal4 लाइनों का उपयोग कर या अन्य विकास के चरणों में विश्लेषण मोटर Circui के बारे में अधिक जानकारी प्रदान कर सकते हैंटीएस.

इस प्रोटोकॉल में, मोटर गतिविधि एक सीसीडी कैमरे के साथ bodywall संकुचन का प्रसारण छवियों से नजर रखी थी. ChR2 या NpHR साथ तंत्रिका गतिविधि से छेड़छाड़, जबकि कैल्शियम के प्रति संवेदनशील प्रतिदीप्ति अणु (जैसे GCaMP) के साथ मोटर न्यूरॉन्स की गतिविधियों को भी सीधे नजर रखी जा सकती है. इस मामले में, एक व्यापक क्षेत्र है और एक बेहद संवेदनशील सीसीडी कैमरा (जैसे EMCCD कैमरे) में नीले प्रकाश रोशनी एक हैलोजन लैंप की जगह इस्तेमाल किया और सामान्य सीसीडी कैमरा पहले से यहाँ बताया जाता है. कम बढ़ाई लेंस से नमूना और निगरानी bodywall ऊपर से एक उच्च वृद्धि के उद्देश्य लेंस (जैसे 40x) द्वारा उदर तंत्रिका कॉर्ड की रोशनी: एक अतिरिक्त उद्देश्य लेंस का उपयोग निगरानी bodywall आंदोलन, एक और अधिक उन्नत तरीका हो सकता है, जबकि उत्तेजना के स्थानिक संकल्प में सुधार करने के लिए (जैसे 4x) नमूना नीचे. इस दोहरी लेंस प्रणाली हमें उच्च स्थानिक संकल्प में तंत्रिका तंत्र को उत्तेजित करने के लिए अनुमति दे सकता है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक अनुदान सहायता के द्वारा समर्थित किया गया था "Mesoscopic neurocircuitry" (नंबर 22115002) और शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान मंत्रालय के "व्यापक मस्तिष्क विज्ञान नेटवर्क" (सं 221S0003), और प्रौद्योगिकी, जापान के एक और अनुदान में विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसाइटी के युवा वैज्ञानिकों के लिए (बी) (नंबर 21700344) (JSPS) के लिए एच

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BX61WI Microscope	Olympus Corporation	BX61WI
Fluoview FV1000 confocal system	Olympus Corporation	FV1000
CCD camera	Sony	XCD-V60
all-trans retinal	Sigma	R2500-500MG	200 mM stock in 95% EtOH
Silpot184	Dow Corning Toray	3255981