הפרעות optogenetic של פעילות עצבית עם תאורת לייזר בחצי ללא פגע Published: July 4, 2013 doi: 10.3791/50513

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Teruyuki Matsunaga¹, Akira Fushiki¹, Akinao Nose^1,2, Hiroshi Kohsaka¹

¹Department of Complexity Science and Engineering, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, ²Department of Physics, Graduate School of Science, The University of Tokyo

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור המניפולציה optogenetic פעילות motoneuronal תוך מעקב אחר שינויים בתפוקת מנוע (התכווצות שרירים) בחצי ללא פגע

Abstract

תנועת הזחל דרוזופילה היא מערכת מפוארת מודל במדעי המוח התפתחותית ופיסיולוגיים, מכוח הנגישות הגנטית של הרכיבים העצביים הבסיסיים במעגלים ^1-6. יישום של optogenetics ^7,8 במעגלים העצביים הזחל מאפשר לנו לתפעל את הפעילות עצבית בדרכים ^9-13 בדוגמת מרחב ובזמן. בדרך כלל, דגימות מוארים באופן רחב עם מנורת כספית או LED, ולכן הספציפיות של הנוירונים היעד נשלטת על ידי מערכות ביטוי גנים בינאריות כגון מערכת Gal4-כטב"מ ^14,15. בעבודה זו, על מנת לשפר את הרזולוציה המרחבית ל" רזולוציה משנה גנטית ", אנו באופן מקומי מוארים משנה של תאי עצב בחוט עצב הגחון באמצעות לייזרים שיושמו במיקרוסקופ confocal קונבנציונלי. תוך מעקב אחר התנועה של קיר הגוף של הזחלים למחצה ללא פגע, אנו אינטראקטיביים מופעלים או עכבות פעילות עצבית עם channelrhodopsin ^16,17 Or ^18-20 halorhodopsin, בהתאמה. על ידי תאורה מוגבלת מרחב ובזמן של הרקמה העצבית, אנחנו יכולים לתפעל את הפעילות של תאי עצב מסוימים במעגל בשלב מסוים של התנהגות. שיטה זו שימושית לחקר הקשר בין הפעילות עצבית הרכבה מקומית בחוט עצב הגחון ודפוס spatiotemporal תפוקת מנוע.

Introduction

תנועה קדימה peristaltic בזחלים תסיסנית מתרחשת על ידי ההפצה של התכווצות שרירים מאחוריים למגזרים קדמיים. תנועה זו מתממשת על ידי הפעלה רציפה של הנוירונים מוטוריים בחוט עצב הגחון לאורך ציר אורך הגוף. כדי לבחון את המעגלים מאחורי פעילות הפצת דוגמת זו, הפרעות מקומית של פעילות עצבית יכולה להיות גישה אינפורמטיבי. למרות assay התרופתי יכול לשלוט בחומר מסוים, כגון מוליכים עצביים, ברקמה עצבית, ההשפעה של תרופות תרופתיות יכולה להיות דומה בין המגזרים, כי כמעט כל חוט עצב הגחון הזחל הוא מבנה חוזר על עצמו מורכב מneuromeres דומה לאורך ציר האורך. לחלופין, אפשר להביע optogenetic או מולקולות בדיקה רגישות טמפרטורה במספר קטן של מגזרים. עם זאת, Gal4 קווים ספציפיים כאלה קשים מאוד לייצר. כאן אנו מציגים שיטה למניפולציה בתאי עצב מעטים צינוקments באמצעות תאורת לייזר. ניצול של התאורה מרחבית מרותק במיקרוסקופיה confocal, אפשר לטרוד את הפעילות של תאי עצב באזור מקומי. בשילוב עם דפוס הביטוי של החללית על ידי תת קבוצות של Gal4 קווי נוירון ספציפיים, שיטת תאורת לייזר זה משפרת באופן משמעותי ברזולוציה מרחבית להפרעות. ומכיוון ששיטה זו דורשת רק מיקרוסקופ confocal קונבנציונלי, רכישת ציוד מעבדה נוספת שלו בדרך כלל לא הכרחית.

שימוש בטכניקה זו, בדקנו את התפקיד של פעילות עצבית מוטורית במהלך ההתפשטות של מנוע פלט ^13. על ידי חסימת פעילותם של הנוירונים מוטוריים בתוך כמה מגזרים בזמן תנועת peristaltic, היינו יכול לבחון האם הפעילות של תאי עצב מוטוריים עצמם נדרשת להתפשטות של אות הפלט המוטורית. מצור מקומי וזמני של הנוירונים מוטוריים נעצר ההתפשטות של תנועת peristaltic. לאחר המצור הוסר, פרוpagation הופיע בקטע שבו הגל נעצר. תופעה זו מצביעה על כך שללא הפעלה עצבית מוטורית, גל propagative לא יכול להתקדם לאורך חוט עצב הגחון הלאה, ובכך ההפעלה של מנוע הנוירונים היא הכרחית לתנועת peristaltic. יש לנו דיווח נתונים ודיונים על תופעה זו מפורטים בעבר בInada et al. (2011) ^13. כאן, אנו מתארים את השיטה כדי לטרוד פעילות עצבית אופן אינטרקטיווי תוך מעקב אחר התנועה של הזחלים גזורים. שימוש Gal4 קווים וסדרה של דפוסי spatiotemporal למניפולצית פעילות שונים, אפשר לחקור היגיון מעגלים דרך תזזית מאפייני תגובה של מעגל המנוע.

Protocol

1. הכנת זחלים

1. לשמור על לטוס קווי OK6-Gal4, כטב"מ-ChR2 או OK6-Gal4, כטב"מ-NpHR2 בבקבוקוני פלסטיק המכילים מזון זבוב סטנדרטי.
2. שמרי מורחים דבק המכילים רשתית כל טרנס (ATR) בריכוזים מתאימים (1 מ"מ לChR2, 10 מ"מ לNpHR2 ("NpHR" בקיצור) על צלחת אגר מיץ תפוחים.
3. תרים 2 ^nd או 3 זחלי instar ^Rd מהבקבוקונים ולשים אותם על הצלחת המכילה ATR.
4. שלהם אחורי של 25 מעלות צלזיוס בחושך במשך תקופה מתאימה של זמן (יום 1 לChR2, 2 ימים לNpHR.)

2. התקנת מיקרוסקופ

1. צרף מצלמת CCD (XCD-V60, סוני) למיקרוסקופ confocal קונבנציונלי (במקרה שלנו, FV1000, אולימפוס) עם קובץ מצורף C-Mount (הגדלה 0.35x).
2. אם יש תריס לאורך נתיב האור מהעדשה האובייקטיבית למצלמת CCD, שסוגרת בסריקת לייזר, להסיר אותו בזהירות. כצעד זה תלוי במייקרולהתמודד התקנה, פנה ליצרן מיקרוסקופ לקבלת תמיכה טכנית, במידת צורך.

3. בתור

1. יש לשטוף את זחלי ATR-fed עם מים כדי להסיר את שארית אוכל מהגוף.
2. שים את הזחל על צלחת מצופה sylgard, צד עד הגבי (יש צד גב שני צינורות קנו נשימת הריצה longitudinally, אחד מכל צד של קו אמצע הגב). העובי של 5 מ"מ sylgard הוא כ.
3. הכנס סיכת חרק (סיכות חרקים אוסטרליץ, Φ0.10mm, נירוסטה) לתוך הזנב בין הצינורות קנו נשימה עם מלקחיים (# 5 Inox, FST ידי דומונט, שוויץ). הפינים, שאורכו 10 מ"מ, צריכים להיות כפופים או לחתוך להיות קצר מספיק (~ 2 מ"מ ארוך) כדי להימנע מהפגיעה וניזק לפני השטח של העדשה האובייקטיבית. ואז לשים את סיכת החרק השנייה לראש של הזחל בסמוך לקרס הפה, המבנה דמוי טופר שחור בקצה הקדמי.
4. הוסף מלח Ca ^{2 +} ללא נורמלי (140 מ"מ NaCl, 2 מ"מ KCl, MgCl ₂ 6 מ"מ, HEPES-NaOH 5,סוכרוז 36 מ"מ (pH7.1)) כדי לשמור את הזחל לח.
5. לעשות חתך קטן ליד הזנב במספריים מיקרו (MB-50-7, Napox, יפן).
6. מהחתך, לעשות חתך אורכי לאורך קו האמצע הגב לכיוון הראש. היזהר שלא לגרום נזק לחוט עצב הגחון (VNC) ואקסונים.
7. לעשות חתך קטן בראש רוחבי.
8. מניחים 4 סיכות בכל פינה של bodywall גזור. קיר הגוף צריך להיות מתוח מספיק כדי להמחיש דפוס מגזרי של קיר הגוף, אבל הרבה לא יותר מדי כדי לעכב את תנועת peristaltic.
9. הסר את האיברים הפנימיים למעט המוח וVNC ולשטוף את המדגם עם Ca ^{2 +} מלח רגיל חינם.
10. התאם את הכיוון של חוט עצב הגחון להיות סימטרי בילטרלי על ידי שינוי העמדה והכיוון של סיכות חרקים על קיר גוף. כדי לתקן את המיקום של חוט עצב הגחון, הכנס סיכה דרך רקמות בין המוח והפה להתחבר אל sylgard.
<li> החלף את החיץ עם 2 מ"מ Ca ^{2 +} פתרון רינגר (130 מ"מ NaCl, KCl 5 מ"מ, MgCl ₂ 2 מ"מ, CaCl ₂ 2 מ"מ, HEPES-NaOH 5, סוכרוז 36 מ"מ (pH7.3)).

4. הדמיה עם תאורת לייזר

1. צרף עדשה אובייקטיבית יבשה 4x (UPlanSApo 4x, NA 0.16, אולימפוס, יפן) במיקרוסקופ confocal ולהגדיר את הכנת הזחל על הבמה.
2. לקבל תמונת שידור של ההכנה גזור עם לייזר אדום (633nm) כדי לאתר את חוט עצב הגחון על ידי מיקרוסקופ confocal. לסריקה זו, הקפד לא להשתמש בליזר או 488nm 559nm, אשר גורם לגירוי לא רצוי של ChR2 או NpHR, בהתאמה.
3. הגדר את האזור של עניין (ROI) על תמונת השידור. מצב מוגדל יכול להיות שימושי להגדרה מפורטת של ההחזר על ההשקעה.
4. לשנות את מערכת הסינון של מיקרוסקופ כדי להאיר באור 488nm או 559nm.
5. להאיר את ההכנה עם מנורת הלוגן לדמיין את קיר הגוף. ההכנת דואר יכולה להיות במעקב עם מצלמת CCD מחוברת למיקרוסקופ confocal.
6. להקליט את התנועה של קיר הגוף ולעבור את קרן לייזר ברשת ומחוצה תוך ניטור התנועה.

Representative Results

הפעלה מקומית וזמנית של הנוירונים מוטוריים עם ChR2.

אנחנו הביעו ChR2 בתאי עצב מוטורי. את האקסונים של תאי עצב מוטוריים המתעוררים מכל פרויקט קטע VNC לקטע מקביל לקיר הגוף. כאשר אנו מגורה מגזרים אחת או שניים של VNC עם לייזר כחול, שרירים במגזרים המקבילים הציגו התכווצויות (איור 1).

עיכוב מקומי וזמני של הנוירונים מוטוריים עם NpHR.

אנחנו הביעו NpHR בתאי עצב מוטורי. כאשר אנו מגורה כמה (1 ~ 2) קטעים של VNC עם לייזר צהוב בהתכווצויות השרירים peristaltic, גל הפצת נעצר במגזרים המקבילים של קיר הגוף (איור 2). ואז הגל מחדש מהמגזרים שנעצרו כשכיבינו את תאורת לייזר ^13.

50513fig1.jpg "alt =" איור 1 "עבור: תוכן-width =" 5.5in "עבור: src =" / files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg "/>
איור 1. הפעלה מקומית של הנוירונים מוטוריים עם ChR2. תכנית א 'של ההפעלה המקומית של הכנת פילה. על ידי תאורה בצבע הכחול בהירה של כמה קטעים של חוט עצב הגחון להביע ChR2 בנוירונים מוטוריים, שרירים במגזרים המקבילים מכווצים (ראש חץ). תמונות תמסורת של זחל גזור. תאורה מקומית של חוט עצב הגחון (חץ ראשים) גורמת להתכווצות שרירים מגזרי של קיר גוף (חיצים).

איור 2. עיכוב מקומי של הנוירונים מוטוריים עם NpHR תכנית. א העיכוב המקומי של הכנת פילה. על ידי צהוב-Lתאורת ight של כמה קטעים של חוט עצב הגחון להביע NpHR בנוירונים מוטוריים, התכווצות שרירים באופן ספונטני, התרחש תנועת peristaltic (ראש החץ בחלק העליון) רגועים (ראש החץ בתחתית.) תמונות תמסורת של זחל גזור . תאורה מקומית של חוט עצב הגחון (ראשי חץ) רגועה מגזרי קיר הגוף באופן ספונטני, התכווץ (חיצים).

Discussion

הפרעות זמנית ומקומיות של פעילות עצבית היא טכניקה לא יסולא בפז לניתוח דינמיקת הרשת של מעגלים עצביים. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לתפעל את הפעילות עצבית על ידי optogenetics באמצעות לייזר. יווני גבוהות של לייזר מאפשרת גירוי optogenetic מקומי יותר מגירוי שדה הרחב באמצעות כספית או קסנון מנורה. למרות תאורות לייזר כבר הוחלו optogenetics במחקרים קודמים, מערכים מיוחדים כגון סיבי זכוכית, micromanipulator, ומקור לייזר, נדרשים במחקרים הקודמים ביותר. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במיקרוסקופיה confocal קונבנציונלית לתאורה מקומית. מאז הוא משמש את מערכת מיקרוסקופ confocal נרחבת, שיטה זו תפתח את ההזדמנות ליישם optogenetics ברזולוציה גבוהה יותר במעבדות רבות.

יש הפרוטוקול שתי נקודות קריטיות: נתיחת הזחל וכוח לייזר. ראשית, אם המוח, חוט עצב הגחון או עצב מוטורי פגום דורינתיחת נג, הזחלים יפגינו פחות או תנועה ספונטנית peristaltic אף אחד. Precision לכן חיוני, במיוחד בעת ביצוע חתך בצד הגבי עם מספריים באביב והסרה איברים פנימיים עם מלקחיים. פרטים על הנתיחה כבר דווחו בעבר ^21. שנית, אם גירוי מספק הוא להיות מושגת, כוח לייזר של כ 0.1 ~ 1 mW / ² מ"מ או 1 לChR2 נדרש ~ 10 mW / ² מ"מ לNpHR. הערכנו את כוח לייזר ככולל כוח האור מתחת לעדשה אובייקטיבית מחולקת בשטח מוערך של תאורה. אנחנו נמדדים כולל כוח האור באמצעות מד כוח (mobiken, Sanwa MI Technos, יפן). הערכנו את השטח של תאורה כקבועות פעמים חוזרים רבועות של אורך הגל של לייזר, אשר בערך נותן שטח מואר בגבול השתברות. כוח התאורה אפקטיבי על המדגם יכול להיות מותאם לא רק על ידי כוחו של פלט לייזר, אלא גם על ידי שינוי המהירות ותחושת הסריקהאה של חזרות. אנחנו סרקנו לייזר עם 20-100 פיקסל μsec / ל63 פעמים. בנוסף, רמת הביטוי של חלבון optogenetics והסכום של ATR הן גם קריטית ליעילות גירוי. בהתאם לכך, אם זחלים לא הראו תגובת optogenetic, יש לבדוק את הנקודות הבאות ותיקן: 1) כוח לייזר (על ידי אופטימיזציה של מערכת מיקרוסקופ), 2) רמת ביטוי של חלבון optogenetics (על ידי בדיקת גנוטיפ וטמפרטורת גידול), ו 3) הסכום של ATR (על ידי התאמת ריכוז של ATR ומאכיל את התקופה). NpHR דורש ריכוז גבוה יותר של ATR מאשר ChR2 עושה על ידי ¹³ מסיבות לא ידועות. ChR2 עובד היטב בזחלים גודלו במזון המכיל פחות ATR (לדוגמה 0.1 מ"מ) מאשר שתואר כאן (1 מ"מ). כהאכלת זחלים לATR 1 מ"מ מספיק להכנת ChR2 צילום תגובתי, אנו ממליצים לריכוז זה המשפט הראשון בChR2 ניסויים. הריכוז של ATR לאחר מכן ניתן טיטרציה למטה מ 1 מ"מ. מבחינת משך חשיפה לATR, אנו ממליציםהמשך מתואר כאן לבקרה חזקה optogenetic. לעתים קרובות אנו לא הצלחנו להתבונן תגובת optogenetic כאשר האכלת זחלים לATR למשך זמן קצר יותר.

בפרוטוקול זה, תאורת לייזר ורכישת תמונה המופעלות על ידי מחשב נפרד. לכן, זיהוי ברור של דפוס spatiotemporal של תאורת לייזר על ידי מצלמת CCD הוא קריטי לניתוח נתונים. אם כתם לייזר או קו הוא עמום על תמונת CCD, אתה צריך לייעל את כוחה של מנורת הלוגן וערך רווח של מצלמת CCD לדמיין את תאורת לייזר, תוך שמירה על קיר גוף גלוי.

תאורת spatiotemporal שמוצגת בפרוטוקול זה מספק מידע על מעגלים מוטוריים זחל, עם זאת, יש כמה מגבלות השיטה. אשר להיבט "מרחבי", המיקום של התאורה שתועד על ידי תמונת CCD ההגדלה נמוכה המשמשת לצילום וידאו תנועות גוף קיר. בהתאם לכך, ניתן להקצות שטח תאורה ברמת מגזר, אבל לא ברמה תאית. באשר ל" לא"היבט, פער זמן בין emporal מיתוג על ידי סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal ותאורה על ידי לייזר תלוי במערכת מיקרוסקופ confocal ומצב סריקה. כתוצאה מכך, כמה בדיקות על ידי ניסוי וטעייה נדרשת כדי להתאים את תזמון תאורה. מאז העיתוי של הארה יכול ייקבע בסרטי CCD תמונה באמצעות תוכנה מתאימה כמו ImageJ, הגורם הקריטי בהחלטה זמנית הוא במסגרת שיעור של מצלמת CCD הדמיה. אנחנו בדרך כלל להגדיר את המסגרת דולר ל7.5-15 פריימים לשנייה.

התקדמות בכלים optogenetic לספק לנו הזדמנות לשנות את הפרוטוקול זה. אנחנו השתמשנו 3 ^rd זחלי instar בעל OK6-Gal4 וכטב"מ-ChR2 [H134R] או כטב"מ-NpHR2. כלים optogenetic אחרים במקום ChR2 [H134R] או NpHR2 כגון ChR2 [T159C/E123T], NpHR3 או קשת יכולה להגביר את היעילות של השליטה בפעילות ^22. בנוסף, באמצעות Gal4 קווים אחרים או ניתוח בשלבי התפתחות אחרים יכול לספק מידע נוסף על המנוע circui TS.

בפרוטוקול זה, פעילות המוטורית הייתה פיקוח על ידי תמונות שידור של התכווצות bodywall עם מצלמת CCD. הפעילות של הנוירונים מוטוריים הקרינה עם מולקולות סידן רגישות (למשל GCaMP) יכולה גם להיות במעקב באופן ישיר תוך מניפולציה פעילות עצבית עם ChR2 או NpHR. במקרה זה, תאורת אור כחולה באזור רחב ומצלמת CCD רגישה מאוד (EMCCD מצלמה למשל) משמשות במקום מנורת הלוגן ומצלמת CCD הרגילה שתוארה קודם לכן במסמך זה. כדי לשפר את הרזולוציה המרחבית של גירוי תוך תנועת bodywall ניטור, תוך שימוש בעדשת מטרה נוספת עשויה להיות שיטה מתקדמת יותר: תאורה של חוט עצב הגחון על ידי עדשה אובייקטיבי ההגדלה גבוהה (למשל 40X) מלמעלה ומדגם bodywall ניטור על ידי עדשת ההגדלה נמוכה (לדוגמה: 4x) להלן המדגם. מערכת עדשות כפולה זה עשויה לאפשר לנו לעורר את מערכת עצבים ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר.

"Jove_content"> הפרוטוקול המוצג כאן יכול להיות מיושם על מעגלים עצביים אחרים, יכולים לבוא לידי ביטוי כלים optogenetic ניתנים במערכת העצבים, וניתן להקים בי הכנה מספיק אור יכול להיות מועברת לתוך הרקמה העצבית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BX61WI Microscope	Olympus Corporation	BX61WI
Fluoview FV1000 confocal system	Olympus Corporation	FV1000
CCD camera	Sony	XCD-V60
all-trans retinal	Sigma	R2500-500MG	200 mM stock in 95% EtOH
Silpot184	Dow Corning Toray	3255981