Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optogenetic اضطراب النشاط العصبي مع إضاءة الليزر في شبه سليمة Published: July 4, 2013 doi: 10.3791/50513
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Complexity Science and Engineering, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2Department of Physics, Graduate School of Science, The University of Tokyo

Summary

نحن هنا وصف بروتوكول للoptogenetic التلاعب النشاط motoneuronal في حين رصد التغيرات في الناتج المحرك (تقلص العضلات) في شبه سليمة

Abstract

ذبابة الفاكهة اليرقات تحرك هو نظام نموذج رائع في علم الأعصاب التنموية والفسيولوجية، بحكم سهولة الجينية لمكونات الخلايا العصبية الكامنة في الدوائر 1-6. تطبيق optogenetics 7،8 في الدائرة العصبية اليرقات يتيح لنا التعامل مع نشاط الخلايا العصبية في طرق منقوشة مكانيا وزمانيا 9-13. عادة، تضاء العينات على نطاق واسع مع مصباح الزئبق أو الصمام، ويتم التحكم في خصوصية جدا من الخلايا العصبية المستهدفة من قبل ثنائي نظم التعبير الجيني مثل نظام GAL4-UAS 14،15. في هذا العمل، لتحسين القرار المكانية إلى "قرار شبه الوراثية"، ونحن مضيئة محليا مجموعة فرعية من الخلايا العصبية في الحبل البطني العصب باستخدام الليزر تنفيذها في المجهر متحد البؤر التقليدية. في حين رصد حركة جدار الجسم من اليرقات شبه سليمة، ونحن تفعيلها بشكل تفاعلي أو تثبيط النشاط العصبي مع channelrhodopsin 16،17 سR halorhodopsin 18-20، على التوالي. بواسطة مكانيا وزمانيا إضاءة محدودة من الأنسجة العصبية، يمكننا التلاعب في نشاط الخلايا العصبية المحددة في الدائرة في مرحلة معينة من السلوك. وهذه الطريقة مفيدة لدراسة العلاقة بين أنشطة جمعية العصبية المحلية في الحبل البطني العصب ونمط الزمانية المكانية من الناتج المحرك.

Introduction

تحرك إلى الأمام تحوي في يرقات ذبابة الفاكهة يحدث من قبل انتشار تقلص العضلات من الخلفي لشرائح الأمامي. ويتحقق هذا الاقتراح من قبل التنشيط متسلسلة من الخلايا العصبية الحركية في الحبل البطني العصب على طول محور الجسم الطولي. لفحص الدوائر وراء هذا النشاط الإكثار منقوشة، يمكن أن اضطراب المحلية من النشاط العصبي يكون نهجا بالمعلومات. على الرغم من أن الفحص الدوائية يمكن السيطرة على مادة معينة، مثل الناقلات العصبية، في الأنسجة العصبية، ويمكن للتأثير المخدرات الدوائية تكون مشابهة بين القطاعات كلها تقريبا لأن اليرقات الحبل البطني العصب هو بنية متكررة تتألف من neuromeres مماثلة على طول المحور الطولي. بدلا من ذلك، يمكن للمرء التعبير عن optogenetic أو جزيئات التحقيق حساسة للحرارة في عدد قليل من القطاعات. ومع ذلك، مثل GAL4 خطوط محددة هي صعبة للغاية لتوليد. ونحن هنا نقدم وسيلة لمعالجة الخلايا العصبية في بضع ثوانىالإدلاء بالبيانات باستخدام إضاءة الليزر. الاستفادة من الإضاءة تقتصر مكانيا في الفحص المجهري متحد البؤر، يمكن للمرء أن التشويش على نشاط الخلايا العصبية في منطقة محلية. جنبا إلى جنب مع نمط التعبير من لجنة التحقيق من قبل مجموعات فرعية من الخلايا العصبية GAL4 خطوط محددة، وهذه الطريقة إضاءة الليزر يحسن إلى حد كبير القرار المكانية للاضطراب. ولأن هذا الأسلوب يتطلب سوى المجهر متحد البؤر التقليدية، وشراء المعدات المختبرية إضافية هو عادة ليس ضروريا.

باستخدام هذه التقنية، درسنا دور نشاط الخلايا العصبية الحركية خلال نشر الانتاج موتور 13. من خلال منع أنشطة الخلايا العصبية الحركية في غضون بضعة شرائح أثناء الحركة تحوي، كنا قادرين على اختبار ما إذا كان نشاط الخلايا العصبية الحركية أنفسهم مطلوب لنشر إشارة خرج المحرك. الحصار المحلية وعابرة من الخلايا العصبية الحركية القبض على انتشار الحركة تحوي. بعد أن تم رفع الحصار، بروظهرت pagation في هذا الجزء حيث أنه تم القبض على الموجة. وتشير هذه الظاهرة التي بدون محرك تنشيط الخلايا العصبية، وموجة توالدي لا يمكن أن تقدم على طول الحبل البطني العصب إلى أبعد من ذلك، وبالتالي تفعيل الخلايا العصبية الحركية ضروري لحركة تحوي. لقد ذكرت سابقا بيانات تفصيلية ومناقشات حول هذه الظاهرة في Inada وآخرون (2011) 13. هنا، نحن تصف طريقة التشويش على النشاط العصبي بشكل تفاعلي حين رصد حركة اليرقات تشريح. باستخدام مختلف GAL4 خطوط وسلسلة من أنماط الزمانية المكانية للتلاعب النشاط، يمكن للمرء أن التحقيق في منطق الدوائر من خلال خصائص استجابة اضطراب من الدائرة الحركية.

Protocol

1. إعداد يرقات

  1. الحفاظ على خطوط الطيران من OK6-GAL4، UAS-ChR2 أو OK6-GAL4، UAS-NpHR2 في قارورة بلاستيكية تحتوي على المواد الغذائية ذبابة القياسية.
  2. الخميرة انتشار لصق تحتوي على جميع العابر الشبكية (ATR) بتركيزات المناسب (1 ملم لChR2، 10 مم للNpHR2 ("NpHR" قصيرة) على عصير التفاح لوحة آغار.
  3. تلتقط الثانية 2 أو 3 يرقات العمر الثالث من قوارير ووضعها على لوحة تحتوي ATR-.
  4. الخلفي لهم عند 25 درجة مئوية في الظلام لفترة مناسبة من الوقت (1 اليوم لChR2، 2 أيام عن NpHR.)

2. الإعداد المجهر

  1. إرفاق كاميرا CCD (XCD-V60، سوني) إلى المجهر متحد البؤر التقليدية (في حالتنا، FV1000، أوليمبوس) مع مرفق C-جبل (0.35x التكبير).
  2. إذا كان هناك مصراع على طول مسار الضوء من العدسة الشيئية إلى كاميرا CCD، الذي يغلق خلال المسح الضوئي ليزر، إزالته بعناية. وهذه الخطوة يعتمد على صغار جداالتعامل الإعداد، اتصل بالشركة المصنعة المجهر للدعم التقني، إذا لزم الأمر.

3. تشريح

  1. شطف اليرقات ATR التي تغذيها بالماء لإزالة بقايا الطعام من الجسم.
  2. وضع اليرقة على طبق المغلفة sylgard، حتى الجانب الظهري (الجانب الظهري لديه اثنين من أنابيب القصبة الهوائية تشغيل طوليا، واحد من جانبي خط الوسط الظهرية). سمك من sylgard حوالي 5MM.
  3. إدراج دبوس الحشرات (دبابيس الحشرات أوسترليتز، Φ0.10mm، غير القابل للصدأ) في ذيل بين أنابيب القصبة الهوائية مع ملقط (# 5 اينوكس، FST بواسطة دومون، سويسرا). دبابيس، حوالي طويل 10MM، وينبغي أن تكون عازمة أو خفض إلى أن تكون قصيرة بما فيه الكفاية (~ 2mm في طويل) لتجنب ضرب والإضرار سطح العدسة الهدف. ثم وضع دبوس الحشرات الثانية في رأس يرقة بالقرب من ربط الفم، أسود مخلب مثل هيكل في نهاية الأمامي.
  4. إضافة كا 2 + خالية المالحة العادي (كلوريد الصوديوم 140 ملم، بوكل 2 مم، MgCl 2 6 ملم، HEPES-هيدروكسيد الصوديوم 5 ملي،السكروز 36 ملم (pH7.1)) للحفاظ على اليرقة رطبة.
  5. إجراء شق صغير بالقرب من الذيل مع مقص الدقيقة (MB-50-7، Napox، اليابان).
  6. من شق، وجعل قطع طولية على طول خط الوسط الظهرية نحو الرأس. يجب الحرص على عدم تلف الحبل البطني العصب (VNC) ومحاور عصبية.
  7. إجراء شق صغير في الرأس جانبيا.
  8. ضع 4 دبابيس في كل ركن من أركان bodywall تشريح. يجب أن تكون الضغوط على جدار الجسم بما يكفي لتصور وجود نمط قطعي من جدار الجسم، ولكن الكثير لم يفت لعرقلة حركة تحوي.
  9. إزالة الأعضاء الداخلية باستثناء الدماغ وفنك وشطف العينة مع كا 2 + المالحة طبيعية خالية.
  10. ضبط اتجاه من الحبل البطني العصب أن يكون متماثل ثنائيا من خلال تغيير الموقف والتوجه من دبابيس الحشرات على جدار الجسم. لتحديد موقف من الحبل البطني العصب، اضافة الى وجود دبوس من خلال الأنسجة بين الدماغ والفم هوك أسفل إلى sylgard.
    11. <لى> استبدال المخزن المؤقت مع 2 ملي كا 2 + حل قارع الأجراس (كلوريد الصوديوم 130 ملم، بوكل 5mm، و MgCl 2 2mm في، و CaCl 2 2 مم، HEPES-هيدروكسيد الصوديوم 5 ملم، 36 ملم السكروز (pH7.3)).

4. التصوير مع ليزر الإضاءة

  1. إرفاق عدسة شيئية جافة 4X (UPlanSApo 4X، NA 0.16، أوليمبوس، اليابان) في المجهر متحد البؤر وتعيين إعداد يرقة على المسرح.
  2. الحصول على صورة انتقال من إعداد تشريح مع ليزر أحمر (633nm) لتحديد موقع الحبل البطني العصب بواسطة المجهر متحد البؤر. لهذا المسح، تأكد من عدم استخدام الليزر 488nm 559nm أو، الذي يدفع التحفيز غير المرغوب فيها من ChR2 أو NpHR، على التوالي.
  3. تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) على صورة انتقال. يمكن أن يكون وضع التكبير مفيدة لتقرير مفصل من العائد على الاستثمار.
  4. تغيير مجموعة من مرشح المجهر لتضيء مع ضوء 488nm 559nm أو.
  5. إلقاء الضوء على إعداد مع مصباح الهالوجين لتصور جدار الجسم. اليمكن رصدها إعداد البريد مع كاميرا CCD تعلق على المجهر متحد البؤر.
  6. تسجيل الحركة من جدار الجسم والتبديل شعاع الليزر على نحو متقطع في حين رصد الحركة.

Representative Results

تفعيل المحلية وعابرة من الخلايا العصبية الحركية مع ChR2.

عبرنا عن ChR2 في الخلايا العصبية الحركية. محاور عصبية من الخلايا العصبية الحركية الخارجة من كل مشروع الجزء VNC لشريحة المقابلة من جدار الجسم. عندما كنا حفز واحد أو اثنين من قطاعات VNC مع الليزر الأزرق، والعضلات في قطاعات المقابلة أظهرت انكماش (الشكل 1).

تثبيط المحلية وعابرة من الخلايا العصبية الحركية مع NpHR.

عبرنا عن NpHR في الخلايا العصبية الحركية. عندما كنا حفز بضعة (1 ~ 2) شرائح من VNC مع ليزر الصفراء في تقلصات العضلات تحوي، ألقي القبض على موجة التكاثر في قطاعات المقابلة من جدار الجسم (الشكل 2). ثم إعادة تشغيل موجة من قطاعات اعتقلت عندما كنا أطفأ إضاءة ليزر 13.

50513fig1.jpg "بديل =" الشكل 1 "FO: محتوى العرض =" 5.5in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg "/>
الشكل 1. التنشيط المحلي من الخلايا العصبية الحركية مع ChR2. A. مخطط التنشيط المحلي من إعداد شرائح. بواسطة إضاءة زرقاء ضوء بضعة شرائح من الحبل البطني العصب معربا عن ChR2 في الخلايا العصبية الحركية، ويتم التعاقد مع العضلات في قطاعات المقابلة (رأس السهم). B. الصور انتقال اليرقة تشريح. إضاءة المحلية من الحبل البطني العصب (السهم رؤساء) يدفع انكماش قطعي من عضلات جدار الجسم (السهام).

الشكل 1
الشكل 2. تثبيط المحلية من الخلايا العصبية الحركية مع NpHR. A. مخطط تثبيط المحلية من إعداد شرائح. بواسطة الأصفر-Lإضاءة آيت من بضع شرائح من الحبل البطني العصب معربا عن NpHR في الخلايا العصبية الحركية والعضلات الانكماش خلال عفويا-قعت تحوي الحركة (رأس السهم في الجزء العلوي) وخففت (رأس السهم في القاع.) B. الصور انتقال اليرقة تشريح . إضاءة المحلية من الحبل البطني العصب (رؤساء السهم) خففت بشكل عفوي المتعاقدة مع شرائح جدار الجسم (السهام).

Discussion

اضطراب الزمنية والمحلية من النشاط العصبي هو أسلوب لا تقدر بثمن لتحليل ديناميات شبكة من الدوائر العصبية. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم وسيلة للتلاعب النشاط العصبي بواسطة optogenetics باستخدام الليزر. الاتجاهية العالية ليزر يسمح التحفيز optogenetic أكثر محلية من التحفيز حقل واسع باستخدام الزئبق أو مصباح زينون. على الرغم من إضاءات الليزر وقد تم بالفعل تطبيقها على optogenetics في الدراسات السابقة، ويلزم الاجهزة الخاصة مثل الألياف الزجاجية، مياداة مجهرية، ومصدر ليزر، في معظم الدراسات السابقة. في هذا البروتوكول، ونحن استخدام الفحص المجهري متحد البؤر التقليدية للإضاءة المحلية. منذ يتم استخدام نظام المجهر متحد البؤر على نطاق واسع، وهذا أسلوب فتح الفرصة لتطبيق optogenetics دقة أعلى في العديد من المختبرات.

بروتوكول اثنين من النقاط الحرجة: تشريح اليرقات وقوة الليزر. أولا، إذا كان الدماغ، والحبل البطني العصب أو الأعصاب الحركية تلف الدوريتشريح نانوغرام، فإن اليرقات تظهر أقل أو لا شيء الحركة تحوي عفوية. وبالتالي الدقة أمر ضروري، خاصة عند إجراء شق على الجانب الظهري مع مقص الربيع وإزالة الأعضاء الداخلية مع ملقط. وقد تم الإبلاغ عن تفاصيل حول تشريح سابقا 21. ثانيا، إذا التحفيز يكفي أن يتحقق، طاقة الليزر من حوالي 0.1 ~ 1 ميغاواط / مم 2 للChR2 أو 1 مطلوب ~ 10 ميغاواط / مم 2 للNpHR. قمنا بتقييم قوة الليزر على أساس إجمالي قوة الضوء أدناه عدسة الهدف مقسوما على مساحة تقدر ب إضاءة. قمنا بقياس إجمالي قوة الضوء باستخدام السلطة متر (mobiken، سانوا MI Technos، اليابان). قدرنا مجال الإضاءة لأوقات ثابتة دائري مربع من طول موجة الليزر، والذي يعطي ما يقرب من المنطقة المضاءة في الحد الحيود. قوة الإضاءة فعالة على عينة يمكن تعديل ليس فقط من قبل السلطة من انتاج الليزر، ولكن أيضا عن طريق تغيير سرعة المسح الضوئي وخدرإيه من التكرار. نحن فحص الليزر مع 20-100 μsec / بكسل ل 63 مرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مستوى التعبير عن optogenetics البروتين وكمية ATR بالغة الأهمية بالنسبة لكفاءة التحفيز أيضا. وبناء عليه، إذا أظهرت يرقات أي رد optogenetic، يجب فحص النقاط التالية وتصحيحها: 1) قوة الليزر (عن طريق تحسين نظام المجهر)، 2) مستوى التعبير عن optogenetics البروتين (عن طريق فحص الوراثي ودرجة الحرارة تربية)، و 3) كمية من ATR (عن طريق ضبط تركيز ATR وتغذية الفترة). يتطلب NpHR تركيز أعلى من ATR من ChR2 يفعل لأسباب غير معروفة 13. ChR2 يعمل بشكل جيد في يرقات المرباة في الأغذية التي تحتوي على أقل ATR (مثل 0.1 ملم) من وصفها هنا (1 ملم). كما تتغذى اليرقات إلى 1 ملي ATR يكفي لصنع ChR2 الصورة التفاعلي، ونحن نوصي هذا التركيز للمحاكمة لأول مرة في ChR2 التجارب. تركيز ATR يمكن بعد ذلك أن معاير أسفل من 1 ملم. كما أن مدة التعرض لATR، ونحن نوصيمدة صفها هنا من أجل السيطرة optogenetic قوية. ونحن غالبا ما فشلت في مراقبة استجابة optogenetic عند تغذية اليرقات إلى ATR لأقصر مدة.

في هذا البروتوكول، ويتم تشغيل إضاءة الليزر والحصول على الصور عن طريق جهاز كمبيوتر منفصلة. لذلك، كشف واضح لنمط الزمانية المكانية من إضاءة الليزر بواسطة كاميرا CCD أمر بالغ الأهمية لتحليل البيانات. إذا بقعة الليزر أو خط قاتمة على الصورة CCD، يجب تحسين قوة مصابيح الهالوجين، وقيمة الربح للكاميرا CCD لتصور إضاءة الليزر مع الحفاظ على جدار الجسم المرئي.

إضاءة الزمانية المكانية هو مبين في هذا البروتوكول يوفر معلومات عن الدوائر موتور اليرقات، إلا أن الأسلوب له بعض القيود. كما أن الجانب "المكانية"، والموقع من الإضاءة يتم تسجيلها من قبل منخفضة التكبير CCD الصورة المستخدمة للتصوير بالفيديو الحركات جدار الجسم. وفقا لذلك، يمكن تعيين منطقة الإضاءة في الجزء الرفيع المستوى، ولكن ليس على المستوى الخلوي. وفيما يتعلق "تيemporal "الجانب، تأخر الوقت بين التبديل على المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر من قبل والإضاءة بواسطة الليزر يعتمد على نظام المجهر متحد البؤر وحالة المسح، وبالتالي مطلوب بعض التجارب عن طريق التجربة والخطأ لضبط توقيت الإضاءة. منذ توقيت إضاءة يمكن يتحدد في الأفلام صورة CCD باستخدام البرمجيات المناسبة مثل يماغيج، وعاملا حاسما في القرار الزماني هو معدل الإطار من CCD كاميرا التصوير. نحن عادة تعيين معدل الإطار ل7،5 حتي 15 لقطة في الثانية.

التقدم في أدوات optogenetic توفر لنا فرصة لتعديل هذا البروتوكول. كنا 3 طريق يرقات العمر حيازة OK6-GAL4 وUAS-ChR2 [H134R] أو UAS-NpHR2. أدوات optogenetic أخرى بدلا من ChR2 [H134R] أو NpHR2 مثل ChR2 [T159C/E123T]، NpHR3 أو قوس يمكن أن تعزز كفاءة الرقابة على النشاط 22. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام GAL4 خطوط أخرى أو تحليل في مراحل النمو الأخرى تقديم مزيد من المعلومات حول محرك داءره TS.

في هذا البروتوكول، تم رصد النشاط الحركي من خلال الصور انتقال من الانكماش bodywall مع كاميرا CCD. ويمكن أيضا نشاط الخلايا العصبية الحركية مع جزيئات مضان الكالسيوم الحساسة (مثل GCaMP) يتم رصدها مباشرة في حين التلاعب النشاط العصبي مع ChR2 أو NpHR. في هذه الحالة، يتم استخدام إضاءة الضوء الأزرق في منطقة واسعة وكاميرا CCD حساسة للغاية (على سبيل المثال كاميرا EMCCD) بدلا من مصابيح الهالوجين، والكاميرا CCD طبيعي سابقا الموصوفة هنا. لتحسين القرار المكانية من التحفيز في حين رصد حركة bodywall، وذلك باستخدام عدسة الهدف إضافية قد تكون وسيلة أكثر تقدما: إضاءة من الحبل البطني العصب بواسطة عدسة الهدف التكبير عالية (على سبيل المثال 40X) من فوق العينة ورصد bodywall بواسطة عدسة التكبير منخفضة (على سبيل المثال 4X) أدناه العينة. هذا نظام عدسة مزدوجة قد تسمح لنا لتحفيز الجهاز العصبي في أعلى المكاني القرار.

"jove_content"> بروتوكول المعروضة هنا يمكن تطبيقها على الدوائر العصبية الأخرى، وأدوات optogenetic المقدمة يمكن التعبير عنها في الجهاز العصبي ويمكن أن تنشأ في إعداد التي يمكن تسليمها في ضوء كاف في الأنسجة العصبية.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من خلال منحة في والمعونة للبحوث العلمية في مجالات مبتكرة "جرحشاعثزرحشرتاد Neurocircuitry" (رقم 22115002)، و "شبكة علوم الدماغ الشامل" (رقم 221S0003) من وزارة التربية والتعليم والثقافة والرياضة والعلوم، والتكنولوجيا، اليابان إلى والمنح التي تقدم للمساعدة للعلماء الشباب (B) (رقم 21700344) من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) إلى هونج كونج

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BX61WI Microscope Olympus Corporation BX61WI
Fluoview FV1000 confocal system Olympus Corporation FV1000
CCD camera Sony XCD-V60
all-trans retinal Sigma R2500-500MG 200 mM stock in 95% EtOH
Silpot184 Dow Corning Toray 3255981

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 48, 58-73 (2001).
  2. Fox, L. E., Soll, D. R., Wu, C. F. Coordination and modulation of locomotion pattern generators in Drosophila larvae: effects of altered biogenic amine levels by the tyramine beta hydroxlyase mutation. J. Neurosci. 26, 1486-1498 (2006).
  3. Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
  4. Gomez-Marin, A., Louis, M. Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than. Curr. Opin. Neurobiol. , (2011).
  5. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nat. Methods. , (2012).
  6. Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
  8. Miesenbock, G., Kevrekidis, I. G. Optical imaging and control of genetically designated neurons in functioning circuits. Annu. Rev. Neurosci. 28, 533-563 (2005).
  9. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
  10. Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
  11. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J. Neurophysiol. 101, 3075-3088 (2009).
  12. Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. Optogenetics in the teaching laboratory: using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in Drosophila. Adv. Physiol. Educ. 35, 82-91 (2011).
  13. Inada, K., Kohsaka, H., Takasu, E., Matsunaga, T., Nose, A. Optical dissection of neural circuits responsible for Drosophila larval locomotion with halorhodopsin. PLoS One. 6, e29019 (2011).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  15. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  16. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  17. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (1073).
  18. Hildebrand, E., Dencher, N. Two photosystems controlling behavioural responses of Halobacterium halobium. Nature. 257, 46-48 (1975).
  19. Takahashi, T., Mochizuki, Y., Kamo, N., Kobatake, Y. Evidence that the long-lifetime photointermediate of s-rhodopsin is a receptor for negative phototaxis in Halobacterium halobium. Biochem. Biophys. Res. Commun. 127, 99-105 (1985).
  20. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  21. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107 (2009).
  22. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).

Tags

علم الأعصاب، العدد 77، البيولوجيا الجزيئية، بيولوجيا الأعصاب وعلم الأحياء التطوري، الهندسة الحيوية، علم الأحياء الخلوية، الخلايا العصبية الحركية، العلوم العصبية،
Optogenetic اضطراب النشاط العصبي مع إضاءة الليزر في شبه سليمة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات في الحركة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matsunaga, T., Fushiki, A., Nose,… More

Matsunaga, T., Fushiki, A., Nose, A., Kohsaka, H. Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion. J. Vis. Exp. (77), e50513, doi:10.3791/50513 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter