Abstract
הכחדה של פחד מותנה נחקרה בהרחבה במכרסמים זכר. לאחרונה, היה מספר גדל והולך של מחקרים המראים כי מנגנונים עצביים למשימות התנהגותיות מסוימות והתנהגויות תגובה שונים אצל נשים וגברים. שימוש בנשים במחקרים יכול לייצג אתגר בגלל הווריאציה של הורמוני אשכים במהלך מחזור הייחום שלהם. פרוטוקול זה מתאר נהלים מבוססים היטב כי הם שימושיים בחקירת תפקידו של אסטרוגן בגיבוש זיכרון הכחדת פחד בחולדות נקבות. שלב של מחזור הייחום וממשל אסטרוגן אקסוגני לפני אימון הכחדה יכול להשפיע על זיכרון הכחדה 24 שעות מאוחר יותר. טכניקת שטיפת הנרתיק לזיהוי שלב ייחום המתואר כאן מסייעת בחינה ומניפולציה של מטבע רכיבה על אופניים הורמוני אשכים. השימוש במודל מכרסם בסיסי זה עשוי להתוות עוד יותר את המנגנונים שבאמצעותם אסטרוגן יכול לווסת את זיכרון הכחדת פחד בנקבות.
Introduction
הבדלים בין מינים הטמונים הם נצפו על פני התנהגויות קוגניטיביות שונות ופרדיגמות למידה בשני בני אדם ומכרסמים. לדוגמא, זה כבר דווח כי, בדרך כלל, לנשים יש יכולות מילוליות ואורינטצית פירוט חזקות, בעוד שגברים יש יכולות מרחבית טובות יותר 1-3. הבדלים בין מינים אלה עשויים להיות בין שאר כתוצאה מההשפעה של הורמוני אשכים. רמות אסטרדיול גבוהות לשפר את הביצועים במשימות שבו נשים הן יותר טובים, אבל להחמיר את הביצועים במשימות שגברים בדרך כלל עושים טובים 4-6. למרות עדות זו היא משכנעת, היכולת המוגבלת לשלוט לחלוטין סביבות ניסוי במחקרים בבני אדם עושה את זה קשה לקבוע אם ניתן לייחס את ההשפעות הללו על התנהגות ספציפית להורמונים. מחקרים בבעלי חיים, לעומת זאת, מאפשרים לנסיבות בשליטה מלאה.
למרות המנגנונים העצביים הבסיסיים של הכחדת פחד זוהו ונלמדים גם בגברים, לא ברור אםמערכות אלה הן אותם בנקבות או איך הם משתנים לאורך מחזור הייחום. אוויר פחד והכחדה נמצאים בשימוש נרחב פרדיגמות התנהגות במכרסמים ובני אדם לבצע מחקרים הקשורים להפרעות חרדה. בהתחשב בכך שיש לי נשים בסיכון גבוה יותר להפרעות חרדה, כמו גם משך סימפטום גבוה יותר ובחומרה 7-13, זה קריטי לכולל נקבות במחקרים אלה. תת-הייצוג של נשים במחקר זה ניתן לייחס לאתגרים של ניטור ייחום שלב וחשבונאיים להשפעות ההתנהגותיות של הורמוני מין. מעבדות שעושות לבחון נקבות בסוגיות מפגש הקשר זה, כי לעתים קרובות אינו מדווח או אינם מתואר בשיטות ללימודיהם.
מתעורר ראיות במכרסמים מצביע על כך שהבדלים בין מינים בהכחדת פחד הם מווסתים על ידי הורמוני אשכים 14-18. בפחד אוויר, הם מאומנים לפחד גירוי מסוים. לאחר מספר מצגות unreinforced שלהגירוי, בעלי החיים ללמוד לא לפחד קיו, תהליך הנקרא הכחדה. כמה טוב בעלי החיים לומדים ומאחדים את הזיכרון של למידת משימה זו ניתן לצפות במהלך בדיקת זיכרון הכחדה נתנה כמה זמן אחרי אימון ההכחדה. ביטוי פחד פחות בזכרון הכחדה מדגים גיבוש זיכרון הכחדה טוב. ממצאים אחרונים מהמעבדה שלנו מציעים כי אסטרוגן יכול לווסת את האיחוד של זיכרון הכחדת פחד ולשפר את זיכרון הכחדה. באופן ספציפי, חולדות נקבות שכובו בproestrus, השלב של מחזור הייחום שבמהלכו במחזור שיא רמות האסטרוגן, שימור משופר תערוכת זיכרון הכחדה. בניגוד לכך, נשים שכבו בתצוגת שלב metestrus אסטרוגן הנמוך זוכרת הכחדה עניה יחסית, שניתן לשפר עם ממשל אסטרדיול אקסוגניים לפני או מייד לאחר אימון הכחדת 15,16. המנגנונים העצביים של גיבוש זיכרון הכחדה (כולל מע"מuding את התפקיד של הורמוני אשכים) בנקבות אינם ברורים.
בחיות מעבדה, התפקיד של הורמונים יכול להיחקר באמצעות נהלי הסרה כירורגית פולשנית כגון סירוס וovariectomy. לאחר התאוששות מניתוח, הורמוני אשכים לעתים קרובות מניפולציות אקסוגני בזמן ההופעה של משימה התנהגותית 19. גישה זו סיפקה מידע קריטי על הורמוני מין ושימושי משום שהיא מאפשרת למניפולציות מבוקרות היטב של הורמוני אשכים (במונחים של תזמון ומינון) 20-23. גישה זו, עם זאת, לא להעריך את ההשפעה של התנודות טבעיות המתרחשות על פני מחזור הייחום וגם אינו מייצגים בעלי חיים "נורמלים", וכך להגביל את פוטנציאל translational למחקרים בבני אדם. זה תועד היטב כי שיא רמות הורמון מין נשי וירידה בשלבים מסוימים של מחזור הייחום, וביטוי קולטן אסטרוגן שינויים במחזור,ואחרי ovariectomy 24. לפיכך, יש צורך לערוך מחקרים על נשים עם בלוטות מין שלמים ולשפר את העיצוב ניסיוני ללמוד באופן מהימן את ההשפעות שמדינות אסטרוגן גבוהות ונמוכות עשויות להיות בנקבות בכל תוחלת החיים שלהם.
פרוטוקול זה מתמקד בהשפעה של אסטרוגן על מערכות נוירו-הביולוגיות מעורבות בהכחדת פחד. הוא מתאר כיצד: 1) לפקח בזהירות את מחזור הייחום, 2) להכין מינונים אפקטיביים של אסטרדיול לממשל מערכתי, ו- 3) לעקוב אחר פרדיגמה התנהגות הכוללת אוויר פחד, הכחדה, ולהיזכר בחולדות נקבות באופן טבעי רכיבה על אופניים. פרוטוקול זה יכול להיות שונה עם מניפולציות תרופתיות אחרות וכלים תאיים ומולקולריים כדי לסייע מחקרים כדי להבין טוב יותר הבדלים בין מינים שנצפו במותנה פחד הכחדת התנהגות. שים לב כי הנהלים המפורטים להלן הם אלה המשמשים במעבדה שלנו, וקיים מספר הווריאציות של נהלים אלה in הספרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הנהלים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת המשנה למחקר טיפול בבעלי חיים, המשמש כועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) לבית החולים הכללי מסצ'וסטס, ועומדים במכונים הלאומי לבריאות הנחיות.
1. שיכון בעלי חיים ונוהל טיפול
- עם ההגעה, חולדות נקבות בוגרות בית ספראג Dawley כ 8-10 שבועות של גיל (במשקל 200-225 גר ') בקבוצות של 3-4 פחי פלסטיק אינץ' עם מצעי woodchip. לשמור אותם בדיאטת גישה כרצונך מודעה של לצ'ו ומים ושעתי אור 12 / מחזור כהה. השאר חולדות להסתגל למתקן תנאי דיור ובעלי חיים למינימום של שבוע 1.
הערה: כל הנהלים בכתב היד הזה מתבצעים במהלך מחזור האור. - בעקבות תקופת הסתגלות זו, לטפל בכל בעלי החיים במשך 5 דקות כל אחד במשך 2-3 ימים. כראוי להרים את חולדות אחד בכל פעם (נתמך על ידי פלג הגוף העליון ולא בזנב),להחזיק אותם באופן מאובטח, וללטף אותם בתקופה זו. ידית בעלי חיים המופיעים יותר הדגיש, עצבני, או חרדה לתקופות זמן ארוכות יותר. לעשות את זה כדי למזער את הטיפול בלחץ, שעלול להשפיע על השלבים הבאים בפרוטוקול זה.
הערה: מספר הימים ומשך זמן טיפול בבעלי החיים יכולים להשתנות בין מעבדות שונות; עם זאת, אלה צריכים להיות עקביים בין ניסויים באותה המעבדה.
2. ניטור מחזור הייחום: הנרתיק ספוגית מריחה ומכתים נוהל
- הפוך 0.9% תמיסת מלח (נתרן כלורי מומס במים מזוקקים). להרטיב המוליך כותנה שקצה בפתרון זה. למחוק את הקצה בעזרת מגבת נייר, כדי למנוע oversaturation, מה שעלול להוביל לאוסף מדגם לקוי או אובדן של תאים. מחזיק את הזנב כלפי מעלה מאת פתח הנרתיק, בעדינות להכניס את קצה הכותנה לתעלת הנרתיק ולהתגלגל הקירות כדי ללכוד תאי נרתיק רופפים.
- אם בעל החיים משתינים על המיטהטיפ טון, להחליף עם אחד חדש, כמו זיהום בשתן יקשה על זיהוי שלב. להיות זהיר מאוד כדי לא לגרום למצוקה לבעלי החיים במהלך הליך זה, כי חשיפה ללחץ תשבש את מחזור הייחום. כאשר בניקוי, במטרה להשיג הכנסה מהירה ונסיגה שאינה עמוק מדי במטרה לצמצם את הגירוי נוסף לצוואר הרחם, שיכול לגרום לpseudopregnancy.
הערה: Pseudopregnancy יכול להיות מזוהה כמחזור ייחום אציקליים, כי בדרך כלל נמשך כ 12 ימים, כלומר ימים רצופים של diestrus 25. - מוציא בזהירות את קצה המוליך ולגלגל אותו לשקופית מיקרוסקופ שכותרתו מראש. הימנע לחיצה חזקה מדי, יותר מדי נוזלים בשקופית יכול לעשות זיהוי שלב קשה ברגע שיבש.
הערה: שקופית אחת יכולה להכיל מספר ימים לכל חיה, למרות שזה יכול להיעשות בהתאם להעדפות אישיות. - ודא העברות מדגם לשקופית. לאסוף דגימות לניתקימים רצופים אל על שקופית אחת כדי להיות מסוגלים לעקוב אחר טוב יותר ולזהות שינויי שלבי ייחום יומיים.
הערה: במידת האפשר, את זה הוא גם אידיאלי אם אנשי איסוף דגימות יישארו זהים לכל בעלי החיים. - ברגע שהשקופית היא יבשה, להתחיל הפרוטוקול מכתים לזיהוי שלב. שימוש בערכת הצביעה (ראה טבלה של חומרים), לטבול את שקופיות 10 פעמים במקבעות (תכלת), 10 פעמים בפתרון כתם (ורוד), ו -5 פעמים בפתרון counterstain (סגול). יש לשטוף את השקופיות בעדינות מתחת למים זורמים. בואו שקופיות יבשות לחלוטין אוויר לפני הצגה תחת מיקרוסקופ.
הערה: מחזור הייחום הארוך בדרך כלל 4-5 היום מורכב מ( לפי הסדר הזה): ייחום (E), metestrus (M), diestrus (ד '), וproestrus (P) 26. הייחום מאופיין בתאים כחולים, cornified, metestrus על ידי כדוריות דם לבנות ושילוב של תאי cornified והגרעיניים, diestrus דומה לmetestrus בנוכחות של סוגי תאים למעט הם מאוד דלילים, וproestrus ידי אגרגטים מוכתמים סגוליםתאים של בעלי הגרעין (איור 1). ישנם נהלים שונים צביעה, בנוסף לאלו שתוארו לעיל, כי הם יעילים באותה מידה לציטולוגית מריחה בנרתיק. - לאסוף דגימות לפחות שני מחזורים מלאים (כ 8-10 ימים) על מנת לעקוב אחר השלבים במדויק לפני ניסויים. בקנה אחד עם הזמן של יום הדגימות נלקחות. לאסוף דגימות משטח מהנרתיק יומי לאורך כל דרך ועד לסוף הניסוי.
3. טרום חשיפה
- לפני תחילתו של הניסוי, לפני לחשוף את בעלי החיים לאוויר תאים לאפשר החיות להסתגל למסגרת (תאי אוויר) לפני כל בדיקות התנהגותיות.
- טרום לחשוף את הנקבות לתאי האוויר (הממוקמים בתיבות ממתנות-קול) עם אורות הבית בבמשך 20-30 דקות ביום במשך 3 ימים לפני כל ניסויים. הקצה את התיבה שהם כלתאם למחקר נחשף מראש. t לנקות ביסודיותהוא קופסות (קירות ומגשים) בין פגישות ובעלי חיים כדי להסיר ריחות שכן הם יכולים להשפיע על התנהגות ומחזור הייחום.
4. יום 1: הרגלה / פחד אוויר
- ברגע שהבעלים החיים אומתו להיות בשלב הייחום של מחזורי הייחום שלהם, תתחיל את שלב התרגלות / אוויר של ניסוי 3 הימים.
- קח מראש טון צעדים בסיסיים של הקפאת מצגות לפני הגירוי המותנה הטון הראשון (CS) בכל יום של הניסוי. לעשות זאת על ידי רכישת ציוני הקפאת אחוזים (מחושבים על ידי חלוקת שניות בילו נייח על ידי משך המשפט, כפול 100) במרווח זמן הגירוי-נעדר בתחילת משפט CS-לבד הראשון לפני תחילת CS.
הערה: צעדים אלה יכולים לשמש כדי להעריך ולהשוות את רמות הקפאה בסיסיות עם אלה במהלך הרגלה, אוויר, הכחדה, וזכירה. - לנהל אימוני הכחדה בשלב metestrus,להתנות את החולדות ביום האחרון שלהם של ייחום. שלב ספוגית ולזהות ייחום (שלב 2) בכל יום לפני תחילת פרוטוקול הניסוי (אוויר / הכחדה / זוכר). כשלב הייחום עלול להימשך זמן רב יותר מיום אחד, היסטורית מחזור השימוש לחזות אורך שלבים כדי לקבוע מתי בעלי החיים מוכנים להתחיל אימון.
- קח מראש טון צעדים בסיסיים של הקפאת מצגות לפני הגירוי המותנה הטון הראשון (CS) בכל יום של הניסוי. לעשות זאת על ידי רכישת ציוני הקפאת אחוזים (מחושבים על ידי חלוקת שניות בילו נייח על ידי משך המשפט, כפול 100) במרווח זמן הגירוי-נעדר בתחילת משפט CS-לבד הראשון לפני תחילת CS.
- בתאי האוויר, לחבר את רצפת רשת רגל-ההלם לגנרטור גירוי חשמלי. השתמש ברמת גירוי של 0.5-0.6 mA כגירוי מותנה (US). השתמש kHz 4, 80 טון dB כגירוי המותנה (CS).
הערה: פרמטרים אלו עשויים להשתנות בכל מעבדות ועשויים להיות שונה לאוויר אופטימלי.- אם תכנית ניתוח ההקפאה דורשת רמזים חזותיים (בניגוד לזמן), שיתוף להפעיל אור LED עם הטון. מקם את האור בצד החיצוני של התא אופרנטית, בתוך מסגרת וידאו. בתחילת כל ניסוי, להפעיל את אור LED ולשמור אותו מואר ועד לסוף המשפט דואר.
הערה: אור זה לא נראה לעין על ידי בעלי החיים, ורק משמש כסמן לייזום ולסיומו של המשפט בתוך קבצי וידאו המוקלטים (שמשמש למדידת התנהגות הקפאה).
- אם תכנית ניתוח ההקפאה דורשת רמזים חזותיים (בניגוד לזמן), שיתוף להפעיל אור LED עם הטון. מקם את האור בצד החיצוני של התא אופרנטית, בתוך מסגרת וידאו. בתחילת כל ניסוי, להפעיל את אור LED ולשמור אותו מואר ועד לסוף המשפט דואר.
- מניחים את בעלי החיים לתאי האוויר במשך 5 ניסויים CS-לבד של התרגלות. מייד לאחר פגישת הרגלה, לבצע ניסויי 7 CS-אמריקאים לזווג פחד האוויר. ודא שטון CS נמשך 30 שניות וcoterminates עם הלם שניות 0.5. ניסויים לרוץ בכל המפגשים (התרגלות, אוויר, הכחדה, וזכירה) עם מרווח intertrial משתנה בממוצע 3 דקות.
- בסוף פגישת האוויר, להחזיר את החיות לכלובים בביתם ולמתקן בעלי החיים עד ליום המחרת.
5. יום 2: אסטרדיול הכנה
- ספוגית ולזהות את שלב הייחום לכל בעלי החיים שעברו יום 1 של פרוטוקול זה. הכן אסטרדיול (הידוע גם בE2, 17beta-אסטרדיול, אובטא-אסטרדיול) ל15 מיקרוגרם / קילוגרם מינון הזרקה תת עורית באמצעות שמן שומשום או מלח 0.9% כרכב.
- כדי לחשב את הסכום של אסטרדיול כדי להתכונן לזריקות, להשתמש במשקל הגוף של כל בעלי החיים, שנמדדו ונרשמו כאשר הם מותנים ביום 1 של פרוטוקול זה.
- לעשות חישובים כדי לתקן את עוצמת הקול של אסטרדיול מנוהל (כלומר 0.2 מיליליטר) לחולדה. מאז אסטרדיול קשה לפזר בשל insolubility המים שלה ודורש נפח גדול של ממס למנה הקטנה, להכין פתרון מניות על ידי ערבוב אסטרדיול בשמן שומשום על אש עד שהיא נמסה. הפתרון אז יכול להיות מועבר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר להסרת מזהמים. לדוגמא, להוסיף נפח מחושב של פתרון מניות שמן שומשום 3000 מיקרוגרם אסטרדיול מיליליטר / 1 עד נפח הדרושים הכולל של שמן שומשום על מנת להשיג 15 מיקרוגרם / קילוגרם מינון בהזרקה 0.2 מיליליטר לכל חיה נפח.
הערה: לחלופין, להשתמש בצורות אחרות של tha אסטרוגן t הם מסיסים במים וקלים יותר לפזר.
6. יום 2: אסטרדיול מנהל / הדרכת הכחדה
- לנהל את תת עורי אסטרדיול. הרם את העור הרפוי בין ההשכמות בצוואר בעת צרה עדינה ולהכניס את מחט המזרק לתוך המשולש שנוצר על ידי קפלי העור.
- 30 דקות הבאות זריקות תת עוריות של אסטרדיול, למקם את בעלי החיים בתאי האוויר שוב ולהתחיל אימוני הכחדה. בפגישה זו הכחדה, לבצע 20 ניסויים CS-לבד, עם כל ניסוי בהיקף של 30 שניות, 4 kHz, צליל dB 80, שהוצג במרווח intertrial משתנה בממוצע 3 דקות.
הערה: ההשפעה של אסטרדיול על החזרה מתרחשת כאשר אסטרדיול מנוהל לפני אימון הכחדה או מייד לאחר הכחדה. ההשפעה לא נצפתה הודעה הכחדה-4 שעות, ולכן מומלץ להזריק קרוב בזמן לתחילתו או בסופו של האימון 15.
- 24 שעות לאחר אימון ההכחדה, ספוגית בעלי החיים שהשלימו יום 1 ו- 2 של פרוטוקול זה.
- מניחים את החיות לתאי האוויר שהוקצו להם (כמו יום 1 ו -2). להתחיל את ההפעלה זוכר הכחדה על ידי הצגת 3 ניסויי CS-לבד (שלושה הניסויים של זיכרון הכחדה), אשר מורכבים מניסויי CS-לבד רק 3.80 dB עם מרווחי intertrial דומים ל -20 הניסויים מנוהלים לאימוני הכחדה כמתואר בשלב 6.2.
- עם השלמת הפעלת הזיכרון, להחזיר את החיות לכלובים בביתם.
ניתוח נתונים 8.
- לרכוש נתונים התנהגותיים באמצעות וידאו ולנתח אותם באמצעות תוכנת מחשב.
הערה: ציוני הקפאה גם ניתן לספור ידני על ידי הנסיין שהוא עיוור לטיפול התרופתי על ידי תזמון התקפי הקפאה במהלך מצגת CS של כל ניסוי, הביע כאחוז מהזמן בילה בהקפאה את הטון. הקפאה היאשהוגדר על ידי חוסר מוחלט של תנועה למעט הנשימה במהלך 30 ניסויי שניות CS-ארה"ב. לחשב הקפאת אחוזים על ידי חלוקת שניות בילו הקפאה (נייח) על ידי 30 שניות (משך המשפט) כפולות 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בפרוטוקול זוכר הכחדת הפחד הזה, הקפאת אחוזים נמדדה כמדד לפחד. בעלי חיים שכיבו היטב ושמרו את זכרו של אימון ההכחדה הציגו פחד נמוך ביום האחרון של הבדיקות התנהגותיות במהלך זוכר הכחדה. חולדות זכרים ונקבה אינן שונות באופן משמעותי בביטוי פחד מותנה באוויר, ההכחדה, ולהיזכר בשלבים (איור 2). עם זאת, הבדל מין הופך להיות ברור כאשר בעלי החיים מנותחים בנפרד כקבוצות שלב ייחום גבוהות ונמוך של אסטרוגן. חולדות נקבות שעוברות הכשרת הכחדה בשלב metestrus אסטרוגן הנמוך של מחזור הייחום לא זוכרים את זיכרון ההכחדה ביום 3, כמו גם אלה שהוכשרו בproestrus (איור 3). נקבות metestrus אלה גם תערוכת התאוששות פחד גדולה יותר באופן משמעותי במהלך זוכר הכחדה (זיכרון הכחדה עני) בהשוואה לגברים. עם זאת, כאשר נקבות metestrus הן injec תת עוריטד עם מנה / קילוגרם 15 מיקרוגרם של אסטרדיול לפני למידת הכחדה, איחוד של זיכרון הכחדת הפחד נראה משופר, כפי שהודגם על ידי הקפאה נמוכה במהלך זוכר הכחדה (איור 4). לכן, נתונים אלה מצביעים על כך שהורמוני אשכים יכולים לווסת זוכרים הכחדת פחד וגם לתווך הבדלים בין מינים בהכחדת התנהגויות פחד מותנות.
איור 1: נציג תמונות של סוגי תאים על פני שלבי מחזור ייחום (הגדלה 20X) Proestrus מאופיין בהמוני תאים עגולים, מוכתם סגולים גרעיניים אפיתל.. ניתן לזהות ייחום על ידי אגרגטים של תאים מוכתמים כחולים, קשקש cornified. Metestrus וdiestrus להביע שילוב של סוגי תאים (לויקוציטים, תאי בעלי הגרעין וcornified) אבל מראים פחות תאים. רמות האסטרוגן להשתנות לאורך שלבי הייחום, שהגיע לשיא במהלך proestrus. (Met = metestrus;.. Diest = diestrus;. Proest = proestrus). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. השוואה בין זכרים ונקבות על פני שלושה השלבים של הניסוי אין הבדלים מובהקים בין מינים שנצפו בהתרגלות (. Hab), אוויר (. Cond), הכחדה, או להיזכר בשלבים של הניסוי 15.
נקבות הבדלי התנהגות בין proestrus (הגבוה של אסטרוגן) וmetestrus (אסטרוגן הנמוך) נקבות בשלב o proestrus הגבוהה של אסטרוגן: איור 3.f תערוכת מחזור הייחום פחות פחד מאלה בmetestrus הנמוך של אסטרוגן. נתונים אלה מצביעים על כך שרמות האסטרוגן אצל נשים באופן טבעי רכיבה על אופניים יכולות להשפיע על גיבוש זיכרון הכחדת פחד, ויסות זוכרת 24 שעות מאוחר יותר 15.
איור 4: טיפול באסטרוגן נקבות metestrus. מנהל של אסטרדיול 30 דקות לפני אימון הכחדה (חץ) מאפשר החזרת הכחדה בהשוואה לרכב 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הכחדת פחד, נחקרה בהרחבה בחולדות זכרים עם המנגנונים העצביים תיווך הכחדת פחד מותנה לזהות ולהעריך תחת מניפולציות שונות. מעטים יחסית מחקרים בחנו חולדות נקבות או את התפקיד של הורמוני אשכים בהכחדת פחד. ללמוד באופן ספציפי את ההשפעה של אסטרוגן על הכחדת פחד, חולדות נקבות באופן טבעי רכיבה על אופניים נתונים לפרדיגמה התנהגות של שלושה ימים. הליך זה מורכב משלבי התרגלות / אוויר, הכחדה, וזכירת הכחדה. שימוש בפרוטוקול זה, זה כבר הוכיח כי חולדות נקבות התאמנו עם הכחדה במהלך הקפאת תערוכת שלב metestrus אסטרוגן נמוכה גבוהה יותר (או זוכרים הכחדה לקויה) בהשוואה לנשים שכבו בproestrus גבוה של אסטרוגן 15. מנהל של אסטרדיול לפני אימון הכחדה בשלב metestrus מודולציה האיחוד של זיכרון הכחדת 16. זה בא לידי הביטוי בירידה בהקפאהg במהלך זוכר הכחדה. יחד, תוצאות אלו מדגישות את החשיבות של עריכת מחקרים נשיים עם תשומת לב להשפעה של הורמונים בשחלות ומחזור הייחום בהתנהגות. למרות שניסויי שליטה לא תוארו כאן, יהיה צורך לכלול את הבקרות המתאימות, כלומר אין קבוצות הכחדה, על מנת להעריך את ההשפעה של אסטרוגן על תהליכים מעורבים בגיבוש זיכרון הכחדה נוסף.
המטרה של פרוטוקול זה היא כפול: 1) כדי לחקור את ההשפעות של אסטרוגן על הכחדת פחד מותנית בשלבים מסוימים של מחזור הייחום בבעלי חיים שלמים, ו- 2) לבחון כיצד חריף אסטרדיול החלפה בנקבת המדינה אסטרוגן בדרך כלל נמוכה יכולה לווסת את ההתנהגות שלה. בהליך שטיפת הנרתיק שתואר כאן, ארבעה השלבים של מחזור הייחום ניתן לזהות: ייחום, metestrus, diestrus, וproestrus. זה מאפשר לנו להעריך את ההתנהגות כאשר השחלות הורמונים such כמו אסטרוגן באופן טבעי בריכוזים נמוכים וגבוהים. לדוגמא, רמות האסטרוגן הם נמוכות במהלך הייחום (20-40 pg / ml), metestrus (15-20 pg / ml), וdiestrus (25-40 pg / ml) שלבים, אך גבוה בproestrus (~ 75 pg / Ml) שלב של מחזור ייחום 27,28. שלבים אלה אינם שונים רק בסביבת הורמונלית, אלא גם בזמן. למרות שמשתנה, proestrus נצפה בדרך כלל להימשך 12 עד 14 שעות; ייחום ל25-27 שעות; metestrus במשך 6 עד 8 שעות; וdiestrus ל55-57 שעות. משך הזמן של כל שלב יכול להיות ארוך או קצר יותר מיום אחד (תלוי בבעלי החיים), שמוביל למחזורים של 5 ימים הכוללים 2 ימים או diestrus או ייחום. כאמור, proestrus וmetestrus הם שלבים קצרים יותר (12-14 שעות ו6-8, בהתאמה), ועלול להחמיץ. בפרוטוקול זה, לכן זה קריטי כדי לפקח בזהירות את מחזור הייחום בעת שימוש בהורמונים באופן טבעי רכיבה על אופניים של בעלי החיים לבדיקת הבדלים בין-שלב ביכולת להיזכר אימון הכחדהמהיום הקודם. מחזור הייחום בחולדות נקבות, בדומה למחזור החודשי האנושי, הוא גם רגיש לגורמים חיצוניים רבים, כגון גיל, מתח, שעה ביום, בתנאי דיור, טמפרטורה, וכו ', ויש לשקול בעת תכנון ניסויים. בעלי חיים עשויים להיות אציקליים (ייחום / diestrus המורחב) או להציג מחזור לא סדיר (פחות מ 4 ימים או יותר מ -5 ימים) לפני או במהלך תקופת המחקר. במקרה זה, בעלי החיים האלה יכולים להיות מחוץ הניתוחים הניסיוניים, להיות קפדן לבדיקה בשלבים מסוימים של מחזור הייחום. חשוב לציין הם שלבי מעבר שבמהלכו הדגימות מעורבבות עם ריר, מה שהקשו מעט על מנת לזהות את סוגי התאים הספציפיים המאפיינים את כל אחד משלבים בצורה ברורה. זה יכול להיות גם בשל הזמן של יום הספוגית נלקחה. אם יש כמות מוגזמת של פריקה כמו ריר-במהלך איסוף למרוח כתוצאה של ניקוי יומי, המאפשרת כמה ימי טיפול לעבור ללא שטיפהיכול לפתור את הבעיה.
בנוסף לשיטת זיהוי שלב הייחום שתוארה כאן, יכולים להיות מועסקים כלים מתודולוגיים אחרים כדי לקבל אמצעים של מחזורי ריכוזי הורמון השחלה סרום. לדוגמא, ריכוז האסטרוגן ניתן לכמת בדגימות דם באמצעות assay צמוד אנזים immunosorbant (ELISA). בהליך זה, אסטרוגנים בסרום / הפלזמה דגימות להיקשר לנוגדן אנטי-אסטרוגן ספציפי, אשר קשור לאנזים. המצע של האנזים מייצר תגובה כי תוצאות באות גלויה כגון שינוי צבע שניתן למדוד באמצעות ספקטרופוטומטר. כלי זה מחשב הספיגה ומספק כימות של רמות האסטרוגן במדגם. שיטה זו יכולה להיות שימושית בהערכה באופן טבעי תנודות ברמות אסטרדיול על פני מחזור הייחום, ויותר מכך, בזמנים מסוימים במהלך הניסוי. גם זה יכול לשמש כדי לקבוע כיצד ממשל אקסוגני של אסטרוגן יכול לשנות נורמהריכוזים פיסיולוגיים אל. מדידה של ריכוזי אסטרוגן מהדם יכולה למנוע קשיים בזיהוי שלב בשלבי מעבר, או כאשר מריחות קשות לקריאה בשל ריר בדגימות. למרבה הצער, שיטה זו יכולה להיות די יקרה והצעות מתעכבות תוצאות בהשוואה לאוסף מריחה בנרתיק.
נהלים להשיג דגימות דם מספיקות, למשל., דרך וריד זנב, סינוס מסלולית, חיתוך זנב, ווריד saphenous 29, עלול לגרום ללחץ מיותר לבעלי החיים. זה עשוי להשפיע על רמות הורמונים בזמנים קריטיים בניסוי, מה שמוביל למדידה לא מדויקת או מוטה. השימוש בדם תא מטען כדי למדוד את רמות אסטרדיול הוא מסוף ולכן מספק מידע מוגבל מאוד על תנודות הורמונליות בתוך השלבים. הערכת ציטולוגיה תאי נרתיק מופיעה להציע חלופה טובה יותר. למרות ששיטה זו עשויה רק לספק הערכה גסה של פרופילי הורמון השחלה על פני שלבי ייחום, זה יכוללהקטין את הלחץ ולאחר מכן הוא פחות מפריע לניסוי התנהגותי.
ישנן צורות שונות של סטרואידים אסטרוגניים שמסתובבות באופן טבעי בבני אדם ובעלי חיים שאינם בני אדם, כגון אסטריול, אסטרדיול, ואסטרון. בפרוטוקול זה, אסטרדיול מנוהל בחריפות באמצעות זריקות תת עורית. אסטרדיול (שם נרדף לE2, 17beta-אסטרדיול או בטא-אסטרדיול) משמש בפרוטוקול זה, כי זה הוא הצורה החזקה ביותר של אסטרוגן טבעי בנשים שאינן בהריון 30. בניגוד לזריקות חריפות של אסטרדיול, מעבדות אחרות בשיטות של ממשל אסטרוגן הכרוני. לדוגמא, שתלים תת-עורי של כדורי שחרור איטי או כמוסות silastic לאפשר למסירה יציבה, מתמשכת של פתרון אסטרוגן או רכב 19. הליך זה משמש בדרך כלל בשילוב עם ovariectomies, המבטל את מצב הרבייה הטבעי של בעלי החיים.
Manipulations נדון כאן להתמקד במדינות הורמונלי טבעיות כדי להקל על יישום קליני של ממצאי המעבדה. אנשים עם הפרעת דחק פוסט-טראומטי (PTSD) לקויים נפוצים ביכולתם לכבות פחד של גירוי הקשור לחוויה הטראומטית שלהם ולזכור הכחדה זו. מצב זה לעתים קרובות נמשך זמן רב לאחר האירוע עבר. טיפול בחשיפה ממושכת הוא אפשרות טיפול נפוצה להפרעה פוסט-טראומטית המסתמכת על תהליכים מבוססי הכחדה למדו במודלים של מכרסמים כמו זו שתוארה כאן. מעניין, נשים הן בערך פעמיים כפי הנראה כמו גברים כדי לפתח מתח והפרעות פסיכיאטריות הקשורות לחרדה 31. הבדל מין זה בשכיחות עשוי להיות קשור להבדלים בין מינים בתהליכי הכחדת פחד ועומד בבסיס המשמעות הקלינית הפוטנציאלית של ממצאי מעבדה אלה. למרות השכיחות גבוהה יותר של PTSD בנשים, מעטים יחסית חוששים מחקרי הכחדה במכרסמים שנערכו בנקבות. מחקרי נקבה להתמקדing על עצם את התפקיד של הורמוני אשכים לא צריך להתעלם כאשר בוחנים הבדלים בין מינים בהתנהגות. המאפיין את ההשפעות ההתנהגותיות של באופן טבעי לשינויים ברמות הורמונים על פני מחזור הייחום מספק תובנה חשובה ההבדלים המהותיים בהתנהגות בין זכרים ונקבות. פרוטוקול זה מספק מודל בסיסי כדי להקל על מחקרים עתידיים של הורמונים בשחלות ובהשפעה שלהם על, אך לא רק, תהליכים קוגניטיביים והתנהגותיים כגון הכחדת פחד. פרוטוקול זה מתמקד בהורמון אשכים ספציפי, אסטרוגן, עם זאת, את ההשפעות של הורמונים אחרים כגון פרוגסטרון וטסטוסטרון יכול גם להיות מוערכת. שימוש בפרדיגמה ההתנהגות שהוצגה כאן בשילוב עם טכניקות תרופתיות, סלולריות, ומולקולריות אחרות (כלומר, חליטות מקומיות סמים, אימונוהיסטוכימיה, כתם מערבי), מחקר עתידי עשוי לזהות אתרים / מטרות ספציפיות של פעולת אסטרוגן במוח שעלול להגדיל את טיפול התנהגותי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש הסופרים של כתב היד הזה לא אינטרסים מתחרים פיננסיים או סכסוכים אחרים של עניין לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Graphic State | Coulbourn Instruments | ||
| Sound-attenuating box | Med Associates, Inc. | NIR-022MD | |
| Estradiol | Sigma-Aldrich | E1024 | In sesame oil for subcutaneous injection |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-250ML | |
| Freezescan | Cleversys, Inc. | ||
| Dip quick stain | Jorgensen Laboratories, Inc. | J0322A1, J0322A2, J0322A3 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6-inch, sterile |
| 0.9% saline | LabChem, Inc. | LC23460-2 | Sodium chloride w/v |
| Selectfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Virex II 256 | Diversey, Inc. | 5019317 | Dilute 1:256 with water |
| Luer-Lok Tip 1ml Syringes | Becton Dickinson | 309628 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26402 | 26-gauge |
References
- Baron-Cohen, S., Knickmeyer, R. C., Belmonte, M. K. Sex differences in the brain: implications for explaining autism. Science. 310 (5749), 819-823 (2005).
- Voyer, D., Voyer, S., Bryden, M. P. Magnitude of sex differences in spatial abilities: a meta-analysis and consideration of critical variables. Psychological Bulletin. 117 (2), 250-270 (1995).
- Pinker, S., Spelke, E. A Conversation with Steven Pinker and Elizabeth Spelke. The Science of Gender and Science. , Harvard University: Mind/Brain/Behavior Initiative. (2005).
- Hampson, E. Estrogen-related variations in human spatial and articulatory-motor skills. Psychoneuroendocrinology. 15, 97-111 (1990).
- Hampson, E., Kimura, D. Reciprocal effects of hormonal fluctuations on human motor and perceptual-spatial skills. Behavioral Neuroscience. 102, 456-459 (1988).
- Hampson, E. Variations in sex-related cognitive abilities across the menstrual cycle. Brain and Cognition. 14 (1), 26-43 (1990).
- Kilpatrick, D. G., Resnick, H. S., Milanak, M. E., Miller, M. W., Keyes, K. M., Friedman, M. J. National estimates of exposure to traumatic events and PTSD prevalence using DSM-IV and DSM-5 criteria. Journal of Traumatic Stress. 26 (5), 537-547 (2013).
- Breslau, N. Gender differences in trauma and posttraumatic stress disorder. Journal of Gender-Specific Medicine. 5 (1), 34-40 (2002).
- Frans, O., Rimmo, P. A., Aberg, L., Fredrikson, M. Trauma exposure and post-traumatic stress disorder in the general population. Acta Psychiatrica Scandinavica. 111 (4), 291-299 (2005).
- Breslau, N., Kessler, R. C., Chilcoat, H. D., Schultz, L. R., Davis, G. C., Andreski, P. Trauma and posttraumatic stress disorder in the community: the 1996 Detroit Area Survey of Trauma. Archives of General Psychiatry. 55 (7), 626-632 (1996).
- Seedat, S., Stein, D. J., Carey, P. D. Post-traumatic stress disorder in women: epidemiological and treatment issues. CNS Drugs. 19 (5), 411-427 (2005).
- Holbrook, T. L., Hoyt, D. B., Stein, M. B., Sieber, W. J. Gender differences in long-term posttraumatic stress disorder outcomes after major trauma: women are at higher risk of adverse outcomes than men. Journal of Trauma. 53 (5), 882-888 (2002).
- Labad, J., Menchon, J. M., Alonso, P., Segalas, C., Jimenez, S., Jaurrieta, N., et al. Gender differences in obsessive-compulsive symptom dimensions. Depression and Anxiety. 25 (10), 832-838 (2008).
- Gupta, R. R., Sen, S., Diepenhorst, L. L., Rudick, C. N., Maren, S. Estrogen modulates sexually dimorphic contextual fear conditioning and hippocampal long-term potentiation (LTP) in rats. Brain Research. 888, 356-365 (2001).
- Milad, M. R., Igoe, S. A., Lebron-Milad, K., Novales, J. E. Estrous cycle phase and gonadal hormones influence conditioned fear extinction. Neuroscience. 164 (3), 887-895 (2009).
- Zeidan, M., et al. Estradiol modulates medial prefrontal cortex and amygdala activity during fear extinction in women and female rats. Biological Psychiatry. 70 (10), 920-927 (2011).
- Lebron-Milad, K., Milad, M. R. Sex differences, gonadal hormones and the fear extinction network: implications for anxiety disorders. Biology of Mood & Anxiety Disorders. 2 (3), (2012).
- Rey, C. D., Lipps, J., Shansky, R. M. Dopamine d1 receptor activation rescues extinction impairments in low-estrogen female rats and induces cortical layer-specific activation changes in prefrontal-amygdala circuits. Neuropsychopharmacology. 39 (5), 1282-1289 (2013).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. , e4013 (2012).
- Markham, J. A., Pych, J. C., Juraska, J. M. Ovarian hormone replacement to aged ovariectomized female rats benefits acquisition of the morris water maze. Hormones & Behavior. 42 (3), 284-293 (2002).
- Markowska, A. L., Savonenko, A. V. Effectiveness of estrogen replacement in restoration of cognitive function after long-term estrogen withdrawal in aging rats. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10985-10995 (2002).
- Bredemann, T. M., McMahon, L. L. 17β Estradiol Increases Resilience and Improves Hippocampal Synaptic Function in Helpless Ovariectomized Rats. Psychoneuroendocrinology. 42, 77-88 (2014).
- Grueso, R., et al. Early, but not late onset estrogen replacement therapy prevents oxidative stress and metabolic alterations caused by ovariectomy. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 236-246 (2014).
- Shughrue, P. J., Bushnell, C. D., Dorsa, D. M. Estrogen receptor messenger ribonucleic acid in female rat brain during the estrous cycle: a comparison with ovariectomized females and intact males. Endocrinology. 131 (1), 381-388 (1992).
- Frye, C. A., Erskine, M. S. Influence of time of mating and paced copulation on induction of pseudopregnancy in cyclic female rats. Journal of Reproduction and Fertility. 90 (2), 375-385 (1990).
- Becker, J. B., et al. Strategies and methods for research on sex differences in brain and behavior. Endocrinology. 146, 1650-1673 (2005).
- Westwood, F. R. The female rat reproductive cycle: a practical histological guide to staging. Toxicologic Pathology. 36 (3), 375-384 (2008).
- Hurn, P. D., Macrae, I. M. Estrogen as a Neuroprotectant in Stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 20, 631-652 (2000).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Gillies, G. E., McArthur, S. Estrogen actions in the brain and the basis for differential action in men and women: a case for sex-specific medicines. Pharmacological Reviews. 62 (2), 155-198 (2010).
- Tolin, D. F., Foa, E. B. Sex differences in trauma and posttraumatic stress disorder: a quantitative review of 25 years of research. Psychological Bulletin. 132, 959-992 (2006).
