Abstract
La recherche sur la programmation prénatale chez le porc a montré que le sexe de l'embryon ou du foetus peut influencer le résultat du développement. Par conséquent, la capacité de déterminer le sexe d'un embryon est nécessaire dans de nombreuses expériences en particulier en ce qui concerne le développement des jeunes. Le présent protocole démontre une préparation peu coûteuse, rapide et non-toxique de l'ADN génomique de porc pour une utilisation avec la PCR. Jour 30 embryons doivent être humainement collectées selon les lignes directrices établies par des institutions politiques relatives aux animaux et comités de protection pour le présent protocole. La préparation de l'embryon entier de cette technique basée sur la PCR de sexage consiste simplement en broyant le embryons congelés en une poudre fine en utilisant un mortier pré-refroidi et un pilon. ADN par PCR qualité est libéré à partir d'une petite quantité de poudre d'embryons par application d'une incubation à chaud dans un réactif de lyse alcaline. Ensuite, la solution d'ADN est mélangé avec un tampon de neutralisation et utilisé directement pour la PCR. Deux paires d'amorces sont générés pour DETECSexospécifiques t déterminer région du chromosome Y (SRY) et la région ZFX du chromosome X avec une grande précision et de spécificité. Le même protocole peut être appliqué à d'autres embryons allongés (de jour 10 et le jour 14) jours au plus tôt 30. En outre, ce protocole peut être réalisée avec des plaques de 96 jailli lors de la sélection d'un grand nombre d'embryons, ce qui rend possible pour l'automatisation et la haute débit typage sexe.
Introduction
Le porc domestique est devenue un sujet de recherche fondamentale dans le développement, la génétique et de la nutrition dans les deux secteurs de l'homme et le bétail. Le potentiel de porcs comme modèles biomédicaux pour la recherche humaine peut être attribuée à leurs similitudes physiologiques. Dans l'élevage, la manipulation de la sex-ratio peut améliorer l'efficacité de sélection et d'amélioration génétique des programmes 1. Sexage des embryons individuels est un outil fondamental utilisé dans de nombreuses études expérimentales, y compris, mais sans s'y limiter, le génotype, l'épigénétique et X inactivation du dimorphisme sexuel au début du développement embryonnaire 2.
Études chez la souris suggèrent que le régime alimentaire de la mère et d'autres facteurs peuvent entraîner un déséquilibre entre les sexes 3. Chez les porcs, les causes de sex-ratio déséquilibre comprennent race paternelle 4, la capacité de l'utérus 5, et l'état métabolique de la truie 6. Étant donné que les différences observées dans les embryons et les portées peuvent être influencés par soixual dimorphisme, les chercheurs doivent être conscients de l'embryon de sexe et les rapports sexuels avant de tirer des conclusions au sujet de leur recherche. Le développement d'outils et de protocoles efficaces pour le sexage des embryons de porcs au jour 30 du développement sera discuté ici.
Diverses méthodes de typage du sexe ont été développés pour les études génétiques chez les organismes modèles et le bétail. En particulier dans l'élevage, l'identification des embryons précoces, hommes et femmes est une pratique très courante pour améliorer la sélection génétique pour les programmes de sélection. Embryons précoces caryotype chez le porc en utilisant Giemsa 7 ou la fluorescence intense 8,9 techniques ont été utilisées pour le typage de sexe. Cependant, ces méthodes prennent beaucoup de temps et ne conviennent pas pour le criblage de grands nombres d'embryons rapidement et avec précision.
Le procédé de typage de sexe le plus efficace est l'amplification d'ADN en utilisant une ADN polymérase stable à la chaleur et une paire d'amorces. ADN sexage par la méthode PCR est plus spécifique, rapide et sensible, onécessitant eul une infime quantité de matériaux cellulaires. La première sexage des embryons par PCR a été effectuée sur des êtres humains 10, et plus tard chez la souris 11, les bovins, les buffles 12 13 et 14 moutons embryons pré-implantatoire. Chez le porc, la méthode de typage de l'ADN du sexe plus tôt a été établi pour les embryons de pré-implantation par une seule paire de chromosome Y amorces d'ADN spécifiques 15. Cependant, des amorces de PCR les plus courantes pour la détermination du sexe ont été choisis dans le chromosome Y du gène SRY spécifique mâle 16 et la non-sex région discriminante d'un gène à doigt de zinc située à la fois X et Y chromosome 17. Par la suite, ces amorces ont été appliqués pour déterminer le sexe d'embryons du jour 30 dans la présente étude avec une meilleure spécificité des amorces pour détecter uniquement le chromosome X d'un gène à doigt de zinc.
L'ADN génomique de porc embryons pré-implantation peut être extraite par l'exposition d'un blastocyste intact pour tamponner avec proteinase K 16 ou en prenant une biopsie de quelques cellules de la coupure rapide individuelle embryons de 15 et de les utiliser pour la PCR directe. Cependant, la libération de l'ADN à partir de sang de porc, les cheveux, les tissus ou une grande conceptus sur quelques centimètres dans la taille est pas effectivement fait en utilisant la méthode protéinase K. Méthodes d'extraction de l'ADN de ces matériaux ont été créés en utilisant soit chronophages protocoles phénol / chloroforme 6 ou des kits basés colonne coûteuse 18. Afin d'éviter l'utilisation de produits chimiques potentiellement toxiques, il y a une tendance à développer des méthodes d'extraction d'ADN faciles et sans phénol peu coûteux. Ce type de protocole pour l'isolement de l'ADN génomique par PCR qualité de la souris 19 et de poisson zèbre 20 tissus a été établie à l'aide d'hydroxyde de sodium chaud et Tris (champion). Cette étude fournit un protocole pour obtenir de l'ADN avec des paires d'amorces duplex modifiés champion et redessinés pour le sexe PCR tapant directement à partir de lysats cellulaires de Jour 30 embryons de porc avechaute précision.
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Protocol
En accord avec le Conseil canadien sur les directives de protection des animaux et avec l'approbation de la politique animale Faculté Comité social et - l'élevage de l'Université de l'Alberta, les truies gestantes ont été euthanasiés par le personnel formé à environ 30 jours de la grossesse et embryons ont été collectés. Utilisez des gants d'examen à tout moment pendant les procédures.
1. Prélèvement et stockage des échantillons
- Euthanasier truie par cheville percutante suivi par exsanguination. Porter des gants d'examen pour recueillir l'appareil reproducteur et des embryons de chaque truie euthanasiés.
Remarque: la collecte rapide d'échantillons et d'embryons de transfert à la glace sèche ou l'azote liquide se traduira dans les tissus de qualité supérieure pour les autres œuvres moléculaires tels que microarray et qPCR. - Disséquer l'utérus et on sépare doucement toutes les embryons dans leurs membranes extra-embryonnaires placentaires de la paroi de l'utérus 21 sous-jacent. Assurez-vous qu'il n'y a pas de contamination des tissus maternels.
- Réla longueur du cordon et le poids de tous les embryons viables avant la congélation.
- Recueillir chaque embryon individuel et immédiatement l'envelopper dans une feuille d'aluminium avant pression de congélation à l'azote liquide.
- Transférer les embryons congelés de l'azote liquide directement à un -80 ° C congélateur.
2. Grinding embryons
- Étiqueter tous les tubes échantillons (15 ml) avec l'ID de l'échantillon nécessaire pour le nombre d'échantillons à analyser.
- Remplissez le réservoir thermique avec de la glace sèche à moitié plein et insérer le tube pré-étiquetés échantillon dans la glace sèche.
- Porter des gants d'hiver avec une autre paire de gants d'examen sur le dessus pour transférer les mortiers et pilons pré-réfrigéré de -80 ° C congélateur pour sécher le bac à glaçons.
- Placez l'embryon congelé à l'intérieur du mortier sur la glace sèche.
- Verser de l'azote liquide suffisante pour couvrir l'embryon et le moudre avec le pilon en une poudre fine.
- Transférer la poudre d'embryon à un tube pré-étiquetés échantillon avec une MICRospatula (Figure 1) et placer le tube dans un congélateur à -80 ° C.
- Utiliser un mortier et un pilon pré-réfrigérés propre pour chaque embryon et changer les gants d'examen après broyage chaque embryon pour éviter la contamination croisée entre les échantillons.
3. L'ADN génomique préparation à l'aide d'hydroxyde de sodium de modification Méthode
- tous les tubes de microcentrifugation d'étiquetage (1,5 ml) nécessaires pour le nombre d'échantillons à analyser.
- Transférer les tubes d'échantillons contenant de la poudre d'embryon de -80 ° C congélateur dans un récipient avec de la glace sèche avant de commencer.
- Introduire à la pipette 180 pi de NaOH 50 mM (hydroxyde de sodium) dans chaque tube pré-étiquetés microcentrifugeuse.
- Activer un incubateur et de pré-chauffage à 95 ° C.
- Utiliser un cure-dent pour transférer la quantité correcte de poudre d'embryons (environ 5-10 mg) (figure 2) à partir du tube d'échantillon dans un tube de microcentrifugation de pré-marqué contenant la solution de NaOH 50 mM.
- tirez up la même cure-dent lentement pour visualiser le lysat d'ADN comme un collant, gluant, substance transparente comme blanc (Figure 3).
- Transférer les microtubes avec de l'ADN du lysat dans l'incubateur préchauffé à 95 ° C pendant cinq minutes. Transférer immédiatement le tube à une boîte de styromousse rempli de glace.
- Ajouter 20 pi de 1 M Tris-HCl directement dans le tube à centrifuger et mélanger en tapotant doucement le tube. Utiliser un papier indicateur de pH pour s'assurer que le pH est d'environ 8,0 (Figure 4) avant la centrifugation.
Remarque: Lorsque vous traitez avec un grand nombre de préparations d'échantillons, il est acceptable de choisir au hasard quelques échantillons pour vérifier le pH. - Centrifuger le tube avec le lysat d'ADN à 2000 x g dans une microcentrifugeuse pendant deux minutes à température ambiante pour éliminer les débris de tissu non dissous.
- Transfert 150 pi de haut surnageant clair dans un nouveau tube ou plaques à 96 puits.
Remarque: Le lysat d'ADN limpide est prête à utiliser comme modèle dans le PCR réactionnel et il est stable à 4 ° C pendant deux semaines, ou bien il peut être conservé à -20 ° C pendant un an.
Les amorces de PCR 4. Design Sex-spécifiques
- Obtenir les numéros d'accès pour le sexe porcin région de détermination de Y (SRY) (de NM_214452.3) et et (ZFX) gènes liés à l'X protéine à doigt de zinc (XM_005673501.1) de site NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov /.
- Copier et coller ces numéros d'accession NCBI à un outil de conception d'amorce en ligne.
Note: La meilleure information des amorces dont la longueur, Tm et GC% ainsi que la taille du produit PCR (pb) sera généré sur l'écran de l'ordinateur (Figure 5). - Valider la spécificité de ces amorces en utilisant le programme Blast nucléotidique (Blastn) contre la base de données génomique porcin courant 104 de sorte que ces séquences ne sont situés sur le chromosome X et Y pour SRY et ZFX respectivement (figure 6).
5. L'ADN génomique par PCR Directement à partir de l'ADN lysats
- Utilisationuniquement 1 ul du lysat de l'ADN comme matrice pour une réaction PCR de 15 ul.
Remarque: Une méthode de criblage à haut débit pour des plaques à 96 puits PCR peut être réalisée de manière similaire à l'aide d'une pipette multicanaux. - Ne le suivant juste pour la première PCR: préparer un tube PCR pour le pas de modèle contrôle négatif et deux tubes supplémentaires pour les contrôles positifs en ajoutant 1 pi (0,5 ng) d'ADN génomique porcine sexuel connu obtenue dans le commerce. Plus tard, inclure un échantillon du dernier succès l'analyse de sexage de contrôle positif et courir avec la nouvelle réaction de PCR pour la détermination du sexe.
- Utiliser tout mélange prêt enzyme PCR HotStart et préparer un mélange maître par des amorces ajout et la nucléase l'eau libre en fonction du nombre total de réactions PCR. Ajouter 1 pi de lysat de l'ADN dans un tube PCR préexistant avec 14 ul du mélange maître PCR. Ajouter des amorces de telle sorte que la concentration finale des amorces à partir de deux gènes spécifiques au sexe est de 0,3 uM dans 15 ul total de PCR reaction.
- Configurer le programme de PCR suivant dans un cycleur thermique: 95 ° C pendant 3 min, 35 cycles chacun avec une masse fondue à l'étape 20 sec 98 ° C, suivie d'une étape de recuit de 15 secondes à 65 ° C, suivie d'une étape d'élongation 15 sec à 72 ° C. Dans une dernière étape, incuber les réactions pendant 1 min à 72 ° C et continuer à incuber à 4 ° C jusqu'à ce que le retrait du tube de PCR pour la vérification de l'électrophorèse sur gel pour déterminer le sexe.
Remarque: Les conditions de PCR et l'optimisation sont selon le manuel du kit PCR mentionnée dans le tableau des matériaux. - Ajouter la quantité appropriée de non toxique serre SYBR fluorescent gel d'ADN tache lors de la préparation d'un gel agarose à 2% TBE.
Remarque: Le bromure d'éthidium peut être substitué à colorant fluorescent serre si elle ne sont pas disponibles. - Ajouter 1,5 ul du colorant de chargement (10x) dans le tube PCR et bien mélanger par pipetage le tampon de réaction PCR up-and-down.
- Charge 10 pi de l'échantillon dans le puits et rnon le gel d'agarose avec réglages de tension appropriées (de petits appareils de gel à 100 V, 96 puits appareil de gel à 150 V jusqu'à ce que la bande de colorant fonctionne à mi-chemin à travers le gel).
- Observer et ajuster les bandes intensités sous le réglage de l'éclairage fluorescent à l'aide d'un scanner laser et capturer une image du gel. Remarque: imageur gel commune peut être remplacé par du gel au bromure d'éthidium.
- Déterminer le sexe des embryons de porc en identifiant les embryons avec une bande en tant que femme et deux bandes comme un mâle (figure 7).
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Representative Results
Un résultat représentatif de la détermination du sexe de l'ADN des lysats 345 criblage par PCR est montrée à la figure 7 et résumées dans le tableau 1.
Comme on peut le voir sur la figure 7, la température d'annelage des amorces à 65 ° C est la condition optimale dans ce protocole PCR générer la même intensité et la taille des amplicons prédites (Figure 5) entre les différents échantillons.
Deux produits amplifiés de SRY (400 pb) et ZFX (506 pb) sont présentés dans l'image de gel (figure 7). embryons mâles ont montré deux fragments d'ADN de la taille correcte de la tige (400 pb) et inférieure (506 pb) bandes. L'intensité de ces deux groupes a été montré comme étant égale à la plupart des individus de sexe masculin. Tous les embryons femelles seulement montré un fragment d'ADN unique correspondant au gène situé dans le ZFXX-chromosome.
lysats d'ADN obtenus à partir de la NaOH 50 mM modifiée peuvent être utilisées directement pour la PCR avec un taux de réussite élevé et la précision. lysats d'ADN n'a pas montré de réaction PCR inhibition après criblage 345 embryons. Seules trois personnes ne sont pas sexué et le pourcentage d'embryons femelles était légèrement plus élevé que les hommes (tableau 1).
Figure 1:. Embryo Transfer Transfert de poudre Poudre d'embryons dans un tube de 15 ml.
Figure 2: la collecte et le transfert de l'embryon poudre dans un cure-dents (A) Une quantité excessive de l'embryon poudre adhérant à la cure-dent.. (B) de montant exact depoudre d'embryon adhérant à la cure-dent pour être transféré à la solution de réactif de lyse alcaline. (C) une quantité suffisante de poudre d'embryon adhérant à la cure-dent.
Figure 3:. ADN Visualisation Technique tirez doucement le cure-dent, après avoir ajouté de la poudre de l'embryon, afin de déterminer si l'ADN de l'embryon a dissous comme une substance transparente-like blanc gluant collant.
Figure 4:. Un pH de confirmation (A) pH de la solution d'hydroxyde de sodium (réactif de lyse alcaline) est de 12,0. (B) Après addition du tampon de neutralisation du tampon de lyse, une indication de couleur du papier pH est vert et le pH doit être d'environ 8,0.
Figure 5:.. Informations amorce spécifique de Sex noms de séquences, les séquences et la longueur de l'amplicon obtenu à partir de l'outil de conception d'amorce S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Cartographie des amorces spécifiques de sexe porcine sur le chromosome X et Y. (A) Situation de l'avant et inversées amorces spécifiées sur le gène ZFX. (B) Situation de l'avant et renversé amorces spécifiées sur le gène SRY. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7:. Amplification par PCR de porcins gènes spécifiques du sexe originaires Day 30 embryons gel d'agarose TBE 2% coloré avec du gel tache d'ADN SYBR avec les contrôles positifs connus sont indiqués par des hommes et des symboles féminins. Deux bandes ont indiqué que les hommes et une seule bande en tant que femelles. étoile rouge indique la contamination de l'échantillon possible dans le puits avec l'apparition d'une bande très faible inférieur (400 pb) par rapport à la bande supérieure (506 pb) de produit de PCR provoquée par SRY amorces Y-spécifiques. Flèche rouge indique le pas de modèle PCR contrôle négatif. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| sexage PCR | Nombre d'embryons | |
| ♀ | 185 | 53.60% |
| ♂ | 157 | 45.50% |
| Inconnu | 3 | 0,90% |
| Total | 345 | 100% |
Tableau 1: Pourcentage de Femme, Homme et inconnu après Sexage PCR entre 345 Jour 30 embryons.
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Discussion
La plupart des protocoles existants en matière de sexe porcine typage de l'ADN des embryons ne conviennent qu'aux stade précoce stade pré-implantatoire 15,16. Nous avons développé avec succès un protocole approprié pour le dépistage des embryons de porc en fin de gestation. Basé sur des études avec des stades de développement similaires d'embryons provenant d'études précédentes 6,18, le présent protocole est considéré comme plus sûr et à faible coût.
Ce protocole est également approprié pour un grand nombre d'échantillons pour le typage du sexe en utilisant une PCR en transférant des lysats d'ADN dans une plaque à 96 puits. Le format de la plaque permet un criblage à haut débit en permettant le transfert de 1 ul de l'ADN du lysat pour la réaction PCR à l'aide d'une pipette multicanaux.
Cependant, plusieurs étapes de la procédure doit être effectuée avec soin. Afin de réaliser le procédé de lyse NaOH 50 mM modifiée de manière plus efficace, l'embryon congelé individuellement doit être mise à la terre en poudre fineen utilisant un (-80 ° C) mortier et un pilon pré-refroidi. Évitez de renverser la poudre d'embryon sur la glace sèche, par doucement et lentement racler la poudre dans le tube de 15 ml, comme le montre la figure 1. Changement de gants d'examen après chaque échantillon est fortement recommandé d'éviter la poudre sur le gant transférer à un autre échantillon de l'embryon.
La quantité appropriée de poudre d'embryons à ajouter à la solution de lyse NaOH 50 mM modifié est représenté sur la figure 2B. Une quantité excessive de la poudre d'embryon est présentée sur la figure 2A et doit être évitée. De même, sur la figure 2C, la quantité de poudre d'embryon peut être insuffisante pour les procédures en aval. Bien que pesant la poudre d'embryons pour chaque échantillon est possible, il est peu pratique lors de la sélection d'embryons de sexe dans une étude à grande échelle impliquant plus d'une centaine d'embryons.
La quantité d'ADN peut être visiblement vérifiée à l'aide d'un cure-dent pour vérifier la g collantsubstance ooey-like comme le montre la figure 3, s'il est douteux que la quantité appropriée de poudre a été ajouté à l'étape précédente.
L'ajout de la quantité adéquate de solution de neutralisation est importante après lyse de la poudre de l'embryon. La figure 4 montre l'évolution du pH avant et après addition d'une solution de neutralisation. Cette étape est importante pour faire en sorte que le pH est légèrement alcalin (environ 8,0) et donc similaire à la plupart des PCR tampons de réaction.
Spécificité des amorces oligo est l'élément le plus important de l'exactitude de l'ADN sexage pendant la PCR. La spécificité des amorces oligo peut être confirmé par le programme NCBI Blastn. Un emplacement unique sera détecté sur le chromosome X dans la région non codante 3 'du gène ZFX pour chaque séquence d'amorce (figure 6A) pour les femelles. Une situation similaire est détectée seulement sur le chromosome Y dans la région codante du gène SRY (figure 6B
Le taux d'erreur due à aucune identification du sexe pourrait être très faible (<1%), comme indiqué dans le tableau 1, lorsque toutes les étapes se déroulent avec soin et correctement. Toutefois, dans certains cas rares, la contamination croisée entre les lysats d'ADN de deux échantillons différents sont possibles et peuvent être détectés par PCR, comme indiqué par une étoile dans le gel (figure 7). Ce type de profil de bandes chez les femmes peut être interprété comme la contamination croisée avec un échantillon masculin.
Il est peu probable que l'apparition d'une bande inférieure est très faible en raison de la concurrence d'apprêt pour les réactifs PCR. Dans ce cas, l'amplicon plus petit (400 pb) en lien avec le gène SRY va générer les produits de PCR plus vite que la bande supérieure correspondant au gène ZFX. Dans ce protocole, un inconvénient réside dans la détermination de la contamination croisée d'un échantillon avec une femelle mâle. Parce que notre objectif principal est pas de quantifier le nombre de copies pour chaque gène cible, un minusculequantité de poudre de l'échantillon féminin ne serait pas facile de visualiser sur le gel.
Le protocole de l'ADN de sexage présentée ici est la méthode la plus rentable pour identifier les embryons du sexe en fin de gestation et peut être appliquée à d'autres grands animaux d'élevage tels que les bovins, ovins et aux caprins. En outre, la méthode de sexage ADN similaire a été appliqué chez les porcs en relation avec l'état métabolique 18 truies. Enquête de la recherche une autre en utilisant l'ADN sexage pourrait être appliquée à l'étude du mécanisme de l'empreinte génomique lors de la programmation prénatale du développement postnatal chez le porc 22. Une large gamme d'applications dans l'élevage à l'aide de sexage ADN PCR est possible, comme les programmes de sélection reproduction pré-sexe, et des effets épigénétiques de la nutrition et les maladies infectieuses.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à souligner la collaboration et les contributions financières de l'agence de financement de la recherche suivante: Alberta bétail et des viandes Agency Ltd, porc CRC, Alberta Pork, Hypor A Hendrix Genetics Company et le CRSNG CRSNG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit | KAPABiosystems | KR0370 | other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Life Technologies | S33102 | Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe |
| Pig female and male genomic DNA | Zyagen | GP-160-F1 & GP-160-M5 | Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used. |
| Typhoon FLA 9500 laser scanner | GE Healthcare Life Sciences | 28-9969-43 | other imaging system can be used |
| Free Soft Nitrile Examination Gloves | WWR | 89038-270 | any other examination glove can be used |
| Sodium hydroxide, solid | Fisher | BP 359 -212 | Molecular Biology Grade |
| Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean | Eppendorff | 0030 108.051 | heat resistant |
| ThermoStat plus | Eppendorff | 22670204 | Use as a incubator for 95 °C , don't need to use the heater |
| Toothpick | Bunzl Plc | 75200815 | Any round wooden toothpicks can be used - quality wood |
| Microcentrifuge 5417R/5417C | Eppendorff | 22621807 | This model was discontinued. But another newer model can be used |
| Microspatula | Fisher | SDI28540115 | Autoclaved before use each time. |
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