Abstract
La investigación en la programación prenatal en el cerdo ha demostrado que el sexo del embrión o feto en desarrollo puede influir en el resultado del desarrollo. Por lo tanto, la capacidad de determinar el sexo de un embrión es necesario en muchos experimentos particularmente en relación con el desarrollo temprano. El presente protocolo demuestra una preparación barata, rápida y no tóxica de ADN genómico de cerdo para el uso con la PCR. Día 30 embriones deberán ser recogidos con humanidad de acuerdo con las directrices establecidas por la Política Institucional Animal y comités de bienestar para el presente protocolo. La preparación de todo el embrión para esta técnica de sexado basado en la PCR implica simplemente moliendo la de embriones congelados hasta un polvo fino usando un mortero previamente enfriado y mano de mortero. DNA PCR calidad se libera de una pequeña cantidad de polvo de embriones mediante la aplicación de una incubación caliente en un reactivo de lisis alcalina. A continuación, la solución de ADN se mezcla con tampón de neutralización y se utilizó directamente para PCR. Dos pares de cebadores se generan a DETECt sexo específico región determinante del cromosoma Y- (SRY) y la región ZFX del cromosoma X con alta precisión y especificidad. El mismo protocolo se puede aplicar a otros embriones alargados (Día 10 a Día 14) antes que el día 30. Además, este protocolo se puede llevar con placas de 96 brotado cuando detección de un gran número de embriones, por lo que es factible para la automatización y la alta la asignación del sexo rendimiento.
Introduction
El cerdo doméstico se ha convertido en un tema de investigación fundamental en el desarrollo, la genética y la nutrición en ambos sectores humana y el ganado. El potencial de los cerdos como modelos para la investigación biomédica humana se puede atribuir a sus similitudes fisiológicas. En la ganadería, la manipulación de la proporción de sexos puede aumentar la eficacia de selección y mejoramiento genético programas 1. El sexado de embriones individuales es una herramienta fundamental utilizada en muchas investigaciones experimentales, incluyendo pero no limitado a genotipo, la epigenética y X inactivación del dimorfismo sexual durante el desarrollo embrionario temprano 2.
Los estudios en ratones sugieren que la dieta materna y otros factores pueden dar lugar a un desequilibrio de género 3. En los cerdos, las causas de la proporción de sexos desequilibrio incluyen raza paterna 4, 5 capacidad uterina, y el estado metabólico de la cerda 6. Dado que las diferencias observadas en los embriones y camadas pueden ser influenciados por SExual dimorfismo, los investigadores deben ser conscientes de embrión de sexo y relaciones sexuales antes de sacar conclusiones con respecto a su investigación. El desarrollo de herramientas y protocolos eficaces para el sexado de embriones de cerdo en el día 30 del desarrollo será discutido aquí.
Varios métodos de asignación del sexo se han desarrollado para los estudios genéticos en organismos modelo y el ganado. Sobre todo en la ganadería, la identificación de los embriones tempranos masculinos y femeninos es una práctica muy común para mejorar la selección genética para programas de mejoramiento. Los primeros embriones de cerdo en el cariotipo utilizando Giemsa 7 o la intensa fluorescencia 8,9 técnicas se han utilizado para la asignación del sexo. Sin embargo, estos métodos son mucho tiempo y no es adecuado para el cribado de un gran número de embriones con rapidez y precisión.
El método de tipificación sexo más eficaz es la amplificación de ADN usando un calor de la polimerasa de ADN estable y un par de cebadores. sexado de ADN por el método de PCR es más específica, rápida y sensible, orequiriendo ólo una mínima cantidad de materiales celulares. La primera determinación del sexo del embrión basados en la PCR se realizó en los seres humanos 10, y más tarde en los ratones 11, ganado, búfalos 12 13 y ovejas 14 embriones antes de la implantación. En el cerdo, se estableció el método de tipificación de ADN sexo más temprana para los embriones antes de la implantación a través de un único par de cebadores de ADN específico del cromosoma Y 15. Sin embargo, se seleccionaron los cebadores de PCR más comunes para la determinación del sexo del cromosoma Y del gen SRY específica macho 16 y la región discriminativo no sexual de un gen dedo de zinc ubicada en ambos X e Y cromosoma 17. Posteriormente, estos cebadores se han aplicado para determinar el sexo de los embriones del día 30 en este estudio con una mayor especificidad de los cebadores para detectar sólo el cromosoma X de un gen zinc-finger.
El ADN genómico a partir de embriones antes de la implantación de la especie porcina se puede extraer mediante la exposición de un blastocisto intacta para amortiguar con proteinase K 16 o tomando una biopsia de unas pocas células de la escisión temprana individuo embriones de 15 años y utilizarlos para la PCR directa. Sin embargo, la liberación de ADN a partir de sangre porcina, cabello, tejidos o una gran conceptus en unos pocos centímetros de tamaño no se hace efectiva utilizando el método de la proteinasa K. Métodos de extracción de ADN para estos materiales se han establecido utilizando ya sea el tiempo que consumen los protocolos de fenol / cloroformo 6 o kits 18 basados caro columna. Con el fin de evitar el uso de productos químicos potencialmente tóxicos, hay una tendencia a desarrollar métodos de extracción de ADN de bajo costo, fácil y sin fenol. Este tipo de protocolo para el aislamiento de ADN genómico PCR calidad de ratón 19 y de pez cebra 20 tejidos se ha establecido el uso de hidróxido de sodio caliente y Tris (HotSHOT). Este estudio proporciona un protocolo para la obtención de ADN con pares de cebadores dúplex modificados y rediseñados para HotSHOT sexo PCR escribiendo directamente a partir de lisados de células de embriones porcinos día 30 conalta precisión.
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Protocol
De acuerdo con el Consejo Canadiense para el manejo de estos animales y con la aprobación de la Política Animal de la Facultad y el Comité de Bienestar - Ganadería de la Universidad de Alberta, las cerdas gestantes fueron sacrificados por personal capacitado aproximadamente a día se recogieron 30 del embarazo y embriones. Utilice guantes de examen en todo momento durante los procedimientos.
1. Recogida y almacenamiento de la muestra
- La eutanasia cerda usando un perno cautivo seguido por desangramiento. Usar guantes para recoger los aparatos reproductores y embriones de cada cerda sacrificados.
Nota: recogida rápida de muestras y embriones de transferencia a hielo seco o nitrógeno líquido se traducirá en los tejidos de mayor calidad para otros trabajos moleculares como los microarrays y qPCR. - Diseccionar el útero y separar con cuidado todos los embriones dentro de sus membranas placentarias extraembryonic de la pared uterina subyacente 21. Asegúrese de que no hay contaminación tejido materno.
- Relongitud del cable y el peso de todos los embriones viables antes de la congelación.
- Recoger cada embrión individual y de inmediato se envuelve en una hoja de aluminio a presión antes de la congelación con nitrógeno líquido.
- La transferencia de los embriones congelados de nitrógeno líquido directamente en un congelador a -80ºC.
2. Los embriones de molienda
- Etiquetar todos los tubos de muestra (15 ml) con el ID de muestra necesaria para el número de muestras a analizar.
- Llene el recipiente térmico con hielo seco a la mitad e insertar el tubo de muestras de pre-marcado en el hielo seco.
- Use guantes de invierno con otro par de guantes de examen en la parte superior para la transferencia de los morteros y manos de pre-enfriado de -80 ° C congelador para secar el depósito de hielo.
- Coloque el embrión congelado en el interior del mortero en el hielo seco.
- Verter nitrógeno líquido adecuado para cubrir el embrión y se muele con la mano del mortero en un polvo fino.
- Transferir el polvo embrión a un tubo de muestra pre-marcado con un microspatula (Figura 1) y colocar el tubo en un congelador a -80 °.
- Use un mortero previamente enfriado limpia y mano de mortero para cada embrión y cambiar los guantes de examen después de moler cada embrión para evitar la contaminación cruzada entre las muestras.
3. Preparación de ADN genómico utilizando Modificado de sodio Método Hidróxido
- Etiqueta de todos los tubos de microcentrífuga (1,5 ml) necesarios para el número de muestras a analizar.
- La transferencia de los tubos de muestra que contienen polvo embrión a partir de la -80 ° C congelador a un recipiente con hielo seco antes de comenzar.
- Pipetear 180 l de NaOH 50 mM (hidróxido de sodio) en cada tubo de microcentrífuga de pre-marcado.
- Encienda una incubadora y de precalentamiento a 95 ° C.
- Utilice un palillo de dientes para transferir la cantidad correcta de polvo de embriones (alrededor de 5 a 10 mg) (Figura 2) del tubo de muestra en un tubo de microcentrífuga de pre-marcado que contiene la solución de NaOH 50 mM.
- tire up el mismo palillo de dientes lentamente para visualizar el lisado ADN como una pegajosa, pegajosa, sustancia blanca transparente similar (Figura 3).
- La transferencia de los tubos de microcentrífuga con lisado de ADN a la incubadora pre-calentado a 95 ° C durante cinco minutos. transferir inmediatamente el tubo a una caja de espuma de poliestireno lleno de hielo.
- Añadir 20 l de 1 M Tris-HCl directamente en el tubo de centrífuga y se mezcla golpeando suavemente el tubo. Use un papel de pH para asegurarse de que el pH es de aproximadamente 8,0 (Figura 4) antes de la centrifugación.
Nota: Cuando se trata de un gran número de preparaciones de muestra, es aceptable para recoger al azar algunas muestras para comprobar el pH. - Centrifugar el tubo con el lisado de ADN en 2000 xg en una microcentrífuga durante dos minutos a temperatura ambiente para eliminar los residuos de tejido sin disolver.
- Transferencia de 150 l del sobrenadante transparente de acabado en un nuevo tubo o placas de 96 pocillos.
Nota: El lisado ADN claro está lista para usarse como una plantilla en PCreacción R y es estable a 4 ° C durante dos semanas, o puede ser mantenido a -20 ° C durante un año.
Los cebadores de PCR 4. Diseño Sexo-específicas
- Obtener los números de acceso para la región determinante del sexo porcino Y (SRY) (NM_214452.3) y los genes y las proteínas ligadas al cromosoma X con dedos de zinc (ZFX) (XM_005673501.1) de la página web NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov /.
- Copiar y pegar estos números de acceso NCBI a una herramienta de diseño de la cartilla en línea.
Nota: La mejor información cebadores incluyendo la longitud, Tm y GC%, así como el tamaño del producto de PCR (pb), se genera en la pantalla del ordenador (Figura 5). - Validar la especificidad de estos cebadores utilizando el programa explosiva de nucleótidos (Blastn) en contra de la actual base de datos genómica porcina 104 para asegurar que estas secuencias sólo se encuentran en X y el cromosoma Y de SRY y ZFX respectivamente (Figura 6).
5. Genomic DNA PCR directamente a partir de ADN lisados
- Utilizarsólo 1 l de lisado de ADN como una plantilla para una 15 l de reacción de PCR.
Nota: Un método de cribado de alto rendimiento para placas de 96 pocillos PCR se puede realizar en forma similar utilizando una pipeta multicanal. - No la siguiente sólo para la primera PCR: preparar un tubo de PCR para el control negativo sin molde y dos tubos adicionales para controles positivos mediante la adición de 1 l (0,5 ng) de ADN genómico porcino sexo conocido obtenido comercialmente. Más tarde, incluir una muestra de la última análisis sexado éxito como un control positivo y para correr junto con la nueva reacción de PCR para la determinación del sexo.
- Utilizar cualquier enzima de PCR Ready Mix HotStart y preparar una mezcla maestra mediante la adición de cebadores y agua libre de nucleasa en función del número total de las reacciones de PCR. Añadir 1 l de lisado de ADN en un tubo de PCR pre-existente con 14 l de la mezcla maestra de PCR. Añadir cebadores de tal manera que la concentración final de los cebadores a partir de dos genes específicos del sexo es de 0,3 M en total de 15 l PCR reaction.
- Configurar el siguiente programa de PCR en un termociclador: 95 ° C durante 3 min, 35 ciclos cada uno con un paso 20 seg de fusión 98 ° C, seguido de una etapa de recocido 15 seg a 65 ° C, seguido de una etapa de elongación 15 sec a 72 ° C. En una etapa final, se incuban las reacciones durante 1 min a 72 ° C y continuar incubar a 4 ° C hasta la retirada del tubo de PCR para la verificación de la electroforesis en gel para determinar el sexo.
Nota: Las condiciones de PCR y optimización están de acuerdo con el manual del kit de PCR se menciona en la Tabla de Materiales. - Añadir la cantidad apropiada de invernadero SYBR fluorescente mancha de gel de ADN no tóxico cuando se prepara un gel de agarosa TBE 2%.
Nota: El bromuro de etidio puede ser sustituido por tinción fluorescente verde-si no está disponible. - Añadir 1,5 l de la colorante de carga (10x) en el tubo de PCR y mezclar bien pipeteando el tampón de reacción PCR de arriba a abajo.
- Carga de 10 l de la muestra en el pocillo y rONU del gel de agarosa con valores de voltaje adecuados (aparato de gel pequeño a 100 V, el aparato de gel de 96 pocillos a 150 V hasta que la banda de tinte se ejecuta medio camino a través del gel).
- Observar y ajustar las intensidades de las bandas con la configuración de la luz fluorescente usando un escáner láser y capturar una imagen del gel. Nota: imager gel común puede ser sustituido por el gel con bromuro de etidio.
- Determinar el sexo de los embriones de cerdo mediante la identificación de los embriones con una banda como una hembra y dos bandas como un macho (Figura 7).
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Representative Results
Un resultado representativo de la determinación del sexo de 345 DNA lisados de cribado por PCR se muestra en la Figura 7 y se resume en la Tabla 1.
Como puede verse en la figura 7, la temperatura de cebadores de recocido a 65 ° C es la condición óptima en este protocolo de PCR generando intensidad similar y tamaños de amplificación hendidas (Figura 5) entre las diferentes muestras.
Dos productos amplificados de SRY (400 pb) y ZFX (506 pb) se muestran en la imagen de gel (Figura 7). embriones masculinos mostraron dos fragmentos de ADN con el tamaño correcto de la parte superior (400 pb) y (506 pb) bandas inferiores. La intensidad de estas dos bandas se demostró que era igual en los individuos más masculinos. Todos los embriones de hembra solamente mostraron un único fragmento de ADN correspondiente al gen ZFX situado en elX-cromosoma.
lisados de ADN obtenidos a partir de la NaOH 50 mM modificada se pueden usar directamente para la PCR con una alta tasa de éxito y la precisión. lisados de ADN no mostraron ninguna inhibición de reacción de PCR después de cribado 345 embriones. Sólo tres personas no fueron sexados y el porcentaje de embriones femeninos fue ligeramente mayor que en los hombres (Tabla 1).
Figura 1:. Embryo Transfer Powder Transferencia de polvo embrión a un tubo de 15 ml.
Figura 2: Recolección y Transferencia de Embriones en polvo con un palillo de dientes (A) Una cantidad excesiva de embriones polvo adherido al palillo.. (B) la cantidad correcta depolvo embrión se adhiere a la palillo de dientes para ser transferido a la solución de reactivo de lisis alcalina. (C) Una cantidad insuficiente de polvo de embrión se adhiere a la palillo de dientes.
Figura 3:. Visualización ADN Técnica Lentamente tire hacia arriba el palillo de dientes, después de añadir el polvo de embrión, para determinar si el ADN de embriones se ha disuelto como pegajoso pegajoso blanco sustancia transparente similar.
Figura 4:. PH de confirmación (A) pH de la solución de hidróxido de sodio (reactivo de lisis alcalina) es 12,0. (B) Después de tampón de neutralización adición al tampón de lisis, indicación de color de papel pH es verde y el pH debería ser alrededor de 8,0.
Figura 5:.. Nombres de secuencia Primer información específica del sexo, las secuencias y la longitud amplicón obtenido a partir de la herramienta de diseño de la cartilla Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Asignación de cebadores específicos al sexo porcino en el cromosoma X e Y. (A) Localización del avance y cebadores inversos especificados en el gen ZFX. (B) Localización del avance y reversa cebadores especificados en el gen SRY. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7:. La amplificación por PCR de genes específicos por sexo porcino desde el día 30 embriones 2% en gel de agarosa TBE teñidas con tinción de gel de ADN SYBR con los controles positivos conocidos se indican con símbolos masculinos y femeninos. Dos bandas indicadas como machos y una sola banda como hembras. Estrella roja indica la posible contaminación de la muestra en el pocillo con la aparición de una banda muy débil inferior (400 pb) en comparación con la banda superior (506 pb) producto de la PCR causada por SRY cebadores Y-específicos. La flecha roja indica la plantilla sin control negativo de PCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| el sexado de PCR | Conde de embriones | |
| ♀ | 185 | 53.60% |
| ♂ | 157 | 45.50% |
| Desconocido | 3 | 0,90% |
| Total | 345 | 100% |
Tabla 1: Porcentaje de Mujer, Hombre y desconocido después de la PCR Sexing entre 345 Día 30 embriones.
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Discussion
La mayoría de los protocolos existentes en relación con la asignación del sexo porcina ADN embriones sólo son adecuados para la etapa temprana etapa de pre-implantación 15,16. Hemos desarrollado con éxito un protocolo adecuado para la selección de embriones porcinos durante el final de la gestación. Sobre la base de estudios con etapas similares de desarrollo de embriones a partir de estudios previos 6,18, el presente protocolo se considera que es más seguro y de bajo costo.
Este protocolo también es adecuado para un gran número de muestras para la tipificación sexo utilizando PCR mediante la transferencia de los lisados de DNA en una placa de 96 pocillos. El formato de placa permite cribado de alto rendimiento al permitir la transferencia 1 l de lisado de ADN para la reacción de PCR usando una pipeta multicanal.
Sin embargo, varios pasos implicados en el procedimiento debe hacerse con cuidado. Para llevar a cabo el método de lisis NaOH 50 mM modificado de manera más eficiente, el embrión congelado individualmente tiene que ser conectado a tierra en polvo finoel uso de un (-80 ° C) de mortero previamente enfriado y mano de mortero. Evitar el derrame de polvo embrión en el hielo seco, raspando suavemente y poco a poco el polvo en el tubo de 15 ml, como se muestra en la Figura 1. Cambio de guantes de examen después de cada muestra es muy recomendable para evitar polvo en el guante de transferir a otra muestra embrión.
La cantidad apropiada de polvo de embriones que se añade a la solución de lisis NaOH 50 mM modificado se muestra en la Figura 2B. Una cantidad excesiva de polvo embrión se presenta en la Figura 2A y debe ser evitado. Del mismo modo, en la Figura 2C, la cantidad de polvo de embriones podría ser insuficiente para los procedimientos aguas abajo. A pesar de que pesa el polvo de embriones para cada muestra es posible, no es práctico en la selección de embriones de sexo en un estudio a gran escala que participaron más de un centenar de embriones.
La cantidad de ADN puede ser verificada de forma visible utilizando un palillo de dientes para comprobar la g pegajosasustancia ooey similar como se muestra en la Figura 3, si es dudoso que se añadió la cantidad apropiada de polvo en el paso anterior.
La adición de la cantidad adecuada de solución de neutralización es importante después de lisar el polvo embrión. La Figura 4 muestra el cambio de pH antes y después de añadir la solución de neutralización. Este paso es importante para asegurarse de que el pH es ligeramente alcalino (alrededor de 8,0) y por tanto similar a la mayoría de los tampones de reacción de PCR.
La especificidad de los cebadores oligo es el elemento más importante de la exactitud de la determinación del sexo de ADN durante la PCR. La especificidad de los cebadores oligo se puede confirmar a través del programa NCBI Blastn. Una sola ubicación será detectado en el cromosoma X en la región no codificadora 3 'del gen ZFX para cada secuencia de cebador (Figura 6A) para las hembras. Una situación similar se detecta sólo en el cromosoma Y en la región codificante del gen SRY (Figura 6B
Tasa de error debido a ninguna identificación del sexo podría ser muy baja (<1%), como se muestra en la Tabla 1, cuando todos los pasos que proceder con cuidado y correctamente. Sin embargo, en algunos casos raros, la contaminación cruzada entre los lisados de ADN de dos muestras diferentes es posible y puede ser detectada por PCR como se indica con una estrella roja en el gel (Figura 7). Este tipo de patrón de bandas en la hembra se puede interpretar como la contaminación cruzada con una muestra masculina.
Es poco probable que la aparición de una banda inferior es muy débil debido a la competencia de imprimación para reactivos de PCR. En este caso, el amplicón menor (400 bp) en relación con el gen SRY generará más producto de PCR más rápido que la banda superior correspondiente al gen ZFX. En este protocolo, una desventaja es la determinación de la contaminación cruzada de una muestra macho con una hembra. Debido a que nuestro principal objetivo no es la cuantificación del número de copias de cada gen diana, una pequeñacantidad de polvo de la muestra femenina no sería fácil de visualizar en el gel.
El protocolo de determinación del sexo de ADN que aquí se presenta es el método más rentable para identificar los embriones del sexo durante la gestación tardía y se puede aplicar a otros grandes animales de granja como vacas, cabras y ovejas. Además, el método de determinación del sexo ADN similar se ha aplicado en cerdos relacionados con la condición metabólica cerdas 18. Otra investigación investigación utilizando sexado de ADN se podría aplicar para estudiar el mecanismo de la impronta genómica durante la programación prenatal del desarrollo postnatal en el cerdo 22. Una amplia gama de aplicaciones en el ganado utilizando el sexado de ADN PCR es posible, como los programas de mejoramiento de selección de pre-sexo, y los efectos epigenéticos de la nutrición y las enfermedades infecciosas.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer la colaboración y las contribuciones financieras de la siguiente agencia de financiación de la investigación: Alberta ganado y la carne Agencia Ltd, CRC carne de cerdo, carne de cerdo Alberta, Hypor Hendrix Genetics Company y CRSNG CRSNG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit | KAPABiosystems | KR0370 | other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Life Technologies | S33102 | Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe |
| Pig female and male genomic DNA | Zyagen | GP-160-F1 & GP-160-M5 | Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used. |
| Typhoon FLA 9500 laser scanner | GE Healthcare Life Sciences | 28-9969-43 | other imaging system can be used |
| Free Soft Nitrile Examination Gloves | WWR | 89038-270 | any other examination glove can be used |
| Sodium hydroxide, solid | Fisher | BP 359 -212 | Molecular Biology Grade |
| Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean | Eppendorff | 0030 108.051 | heat resistant |
| ThermoStat plus | Eppendorff | 22670204 | Use as a incubator for 95 °C , don't need to use the heater |
| Toothpick | Bunzl Plc | 75200815 | Any round wooden toothpicks can be used - quality wood |
| Microcentrifuge 5417R/5417C | Eppendorff | 22621807 | This model was discontinued. But another newer model can be used |
| Microspatula | Fisher | SDI28540115 | Autoclaved before use each time. |
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