Summary
우리는 전체 셀 패치 클램프 기록 및 2 광자 이미징 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 캘리포니아2 + 과도 기록 하는 방법 제시.
Abstract
칼슘 (캘리포니아2 +) 이미징 신경 모 수석에 세포내 캘리포니아2 + 신호 spatiotemporal 역학 조사 하는 강력한 도구입니다. 캘리포니아2 + 변동 막과 세포내 메커니즘의 다양 한 통해 발생 하 고 시 냅 스가 소성의 유도 및 수지상 흥분의 규칙에 중요 한 역할을 담당할 수 있습니다. 따라서, 수지상 지점에서 서로 다른 유형의 Ca2 + 신호를 기록 하는 기능 모 수석 정보를 통합 하는 방법을 공부 하는 그룹에 대 한 가치가 있다. 두 광자 현미경의 출현이 했다 이러한 연구를 훨씬 쉽게 이미징 산란 등 photodamage 살아있는 조직에 내재 된 문제를 해결 하 여. 또한, 기존의 electrophysiological 기법 2 광자 캘리포니아2 + 이미지의 조합를 통해 수는 로컬 Ca2 + 변동에 녹음과 동시에 신경 모 수석에서 시 냅 스 활동의 조사 소마입니다. 여기, 우리가 GABAergic 금지 수의 dendrites에이 메서드를 사용 하 여 로컬 Ca2 + 과도 (고양이)의 역학을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 공부 수지상 캘리포니아2 + 급성 뇌 조각에서 신경 종류에 신호에 적용할 수 있습니다.
Introduction
뉴런 네트워크 활동의 기여는 주로 수신 시 냅 시스 입력의 동적 특성에 의해 결정 됩니다. 전통적으로, 신경 세포에 시 냅 스 활동을 특성화의 주된 방법 postsynaptic 전류 통로의 축 삭의 전기 자극에 의해 evoked의 체세포 전체 셀 패치 클램프 기록에 의존. 그러나,이 경우1사실 proximally 있는 시 냅 스의 유일한 활동 보고 됩니다. 또한, 시 냅 스 특정 메커니즘을 평가, 녹음 및 특정 위치에 모 수석 신경의 쌍에서 각각의 시 냅 스 및 수지상 통합의 메커니즘을 대상으로 사용 되었습니다. 시 냅 스 생리학의 분야에서 중요 한 돌파구는 광학 및 electrophysiological 기법의 결혼을 통해 달성 되었다. 2 광자 여기 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (2PLSM) Ca2 + 이미징 및 optogenetic 도구와 함께 뇌 조각 에서에서 특정 신경 연결에 시 냅 시스 활동의 동적 조직의 엄청난 정보를 계시 할 수 있다 체 외 그리고 vivo에서.
몇 가지 주요 장점 만든 2PLSM 기존의 한 광자 여기 현미경2에서 밖으로 서: (1)의 2 광자 여기 비선형 특성상 형광 초점 볼륨에만 생성 되 고 모든 내보낸된 광자 대표 유용한 신호 (pinhole에 대 한 필요는 없음); (2) 긴 파장, 2PLSM, 사용 침투 분산 조직을 보다 효율적으로; 또한, 흩어져 광자는 2 광자 여기 및 배경 형광; 너무 희석 (3) photodamage 및 phototoxicity 초점 평면으로 제한 됩니다. 따라서, 기존의 confocal 현미경에 비해 2 광자 시스템의 높은 비용에도 불구 하 고는 2PLSM 신경 구조와 기능 두꺼운 살아있는 조직에서의 고해상도 조사 방법의 선택에 남아 있다.
분산 조직에서 2PLSM의 첫 번째 응용 프로그램 구조와 기능 수지상 쪽이3의 이미지를 했다. 캘리포니아2 + 이미지와 함께에서 2PLSM 고립 된 생 화 확 적인 격실으로 그 쪽이 기능을 공개 했다. 두 광자 캘리포니아2 + 곧 이미징 되었다 유용한 도구 그대로 조직5, 개별 시 냅 스의 활동을 보고 많은 신경 종류에 등뼈와 개별 시 냅 스4사이의 일대일 대응 관계입니다, 6,,78. 또한, 2PLSM 기반 Ca2 + 이미징 성공적으로 사용한 단일 칼슘 채널 및 기본 및 시 냅 스 conductances 사이 비선형 상호 작용의 활동을 모니터링 하로 평가 하는 상태 및 활동 의존 하 규칙의 캘리포니아2 + 신경 dendrites5,6,7,8,9,,1011에 신호.
칼슘은 유비 쿼터 스 세포내 두번째 메신저, 그리고 그것의 subcellular spatiotemporal 조직 이온의 레 귤 레이 션을 시 냅 스 강도에 따른 생리 적 반응의 방향을 결정 합니다 채널, 모 수석 등뼈 성장으로 뿐만 아니라 세포 죽음 및 생존 수지상 캘리포니아2 + 고도 여러 통로의 활성화를 통해 발생합니다. 활동 전위 (APs), 모 수석에 backpropagating 전압 개폐 칼슘 채널12 열고 dendrites와 쪽이13에 상대적으로 글로벌 캘리포니아2 + 과도 (고양이)를 생성 합니다. 시 냅 스 전송 postsynaptic 캘리포니아2 +의 활성화와 관련 된-투과 수용 체 (NMDA, 캘리포니아2 +-침투성 AMPA와 kainate),6,,1415고양이 시 냅 스 트리거링. 마지막으로, 특정 조건11,12,,1316에서 모 수석에 supralinear Ca2 + 이벤트를 생성할 수 있습니다.
두 광자 캘리포니아2 + 영상 패치 클램프 electrophysiological 녹음와 함께에서 사용 하 여 합성 캘리포니아2 +-전체 셀 녹음 중 패치 전극을 통해 일반적으로 배달 민감한 형광 표시기 . 캘리포니아2 + 역학의 정량화에 대 한 표준 방법 듀얼 표시기 방법17,18을 기반으로 합니다. 두 fluorophores 잘 분리 된 방출 스펙트럼을 사용 하 여 (예를 들어, 빨간색 캘리포니아2 +의 조합-녹색 Ca2 + 지표, 오 레 곤 그린 BAPTA-1 또는 Fluo-4 등을 구분 하지 않는 염료)에 비해 몇 가지 장점이 고는 단일 표시 방법입니다. 첫째, 캘리포니아2 +-구분 염료는 캘리포니아2 + 이미징 수행할 수 관심 (수지상 지점과 쪽이)의 작은 구조를 찾는 데 사용 됩니다. 둘째, 녹색과 적색 형광 (ΔG/R)에 있는 변화 사이 비율 측정 [캘리포니아2 +], [캘리포니아2 +]017 에서 변동으로 인해 초기 형광의 변화에 크게 민감한은으로 계산 됩니다. , 18. 또한, 형광 변경 절대 캘리포니아2 + 농도19의 점에서 측정 될 수 있다.
급성 조각에서 2 광자 캘리포니아2 + 이미징 실험을 실행 하는 때 일반적인 관심사 셀 건강 및 일반적으로 사용 하는 높은 레이저 전원 인해 이미지 수집의 안정성 이다. 또한, 캘리포니아2 + 이미징 실험, 거기에서는 섭 동 및 subcellular 캘리포니아2 + 역학의 실질적인 과대평가 대 한 우려 사실은 캘리포니아2 + 지표 역할 높은 모바일 exogenous 캘리포니아2 + 완충기입니다. 따라서, 실험 질문 및 신경 유형, 고양이의 예상된 진폭에 따라 Ca2 + 표시기와 그것의 농도의 선택 합니다.
우리는 캘리포니아2 + 변동 GABAergic 수9,,1011,,2021 의 dendrites의 조사를 위해 2 광자 캘리포니아2 + 이미징 방법 적응 , 22. 초기 캘리포니아2 + 이미징 연구의 대량 주 신경에서 수행 했다, 금지 수 피라미드 세포20 에 그 고유 기능 캘리포니아2 + 메커니즘의 큰 다양 한 쇼케이스 , 23 , 24. 이러한 interneuron 관련 메커니즘 (예:, 캘리포니아2 + 침투성 AMPA 수용 체) 세포 활동을 조절에 특정 역할을 재생할 수 있습니다. 수지상 캘리포니아2 + 수에서 신호는 추가 조사에 대 한 유혹 대상, 하는 동안 2 광자 캘리포니아2 + 모 수석 세포 이미징 과제가 추가, 모 수석의 더 얇은 직경을 등뼈의 부족에서 특히 높은 생 캘리포니아2 + 바인딩 용량. 우리의 연구 관심 hippocampal 수의 연구에 초점, 다음 프로토콜 다른 신경 인구에 적용 하는 동안 했다 그 문제를 다루는 적응.
이 프로토콜은 상업 confocal 2 광자 현미경, 2 개의 외부, descanned 비 감지기 (NDDs), 전기 광학 변조기 (엄), 및 Dodt 그라데이션 대비 (SGC), 스캔 광학 테이블에 설치는 처형 되었다. 현미경 모드 잠겨 800 Ti:Sapphire multiphoton 레이저와 결합 되었다 (> 3 W, 140 fs 펄스, 80 Hz 반복 속도) nm. 이미징 시스템 온도 제어, 2 개의 micromanipulators와 번역 플랫폼, 컴퓨터 제어 microelectrode 앰프, 디지타이저,는 자극 관류 챔버를 포함 하 여 표준 전기 생리학 장비를 장착 했다 단위, 및 데이터 수집 소프트웨어
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Protocol
모든 실험 동물 보호 위원회 대학교 발 및 동물 관리에 캐나다 위원회의 동물 복지 지침에 따라 수행 했다.
1. 사전 준비 (선택 사항: 1 일을 사전에 준비)
- 세 가지 유형의 인공 척수 (실제) 솔루션 (일반, 자당 및 복구 솔루션, 1 L 각; 표 1참조)를 준비 합니다. 300 ± 10 mOsm25 솔루션의 osmolality 조정 하 고 실제 자당 근처 빙 점 아래로 냉각 (0-4 ° C).
참고: 낮은 나트륨 절단 솔루션 (실제-자당)를 사용 하 여 급성 조각26의 표면 층에 있는 뉴런의 생존 능력을 유지 도움이 됩니다. - 준비 빨간색 fluorophore (예를 들어, 알 렉 사-594)를 포함 하는 패치 솔루션의 0.75 mL와 녹색 합성 칼슘 표시기 (예를 들어, 오 레 곤 그린 BAPTA-1, 표 1참조). Biocytin 포함 ( 표 1참조)에 기록 된 셀의 임시 게시물 형태학 식별이 필요한 경우 패치 솔루션.
- 280 ± 5 mOsm 해결책의 pH를 7.35 ± 0.5 osmolality를 조정 합니다. 항상 솔루션 또는 얼음에 냉장고에서 유지.
참고: 칼슘 표시기의 선택 해야 수 입각 한 동적 범위와 조사 캘리포니아2 + 이벤트의 성격. - ≈ 2 µ m 팁 (3-5 m ω의 저항 피 펫)와 붕 세타-유리 모 세관 (참조 테이블의에서 자극 펫 패치 펫에서 붕 규 산 유리 모 세관 ( 재료의 표참조)를 준비 하는 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여, 재료) 2-5 µ m 팁.
참고: 주어진된 직경 및 모양의 펫을 끌어당기는 설정은 끌어당기는 필 라 멘 트 유형 및 유리의 특정된 유형에 대 한 램프 테스트 결과 따라 결정 됩니다.
2. hippocampal 슬라이스 준비
- Anesthetize 마우스 (P13-20, 스트레인 및 마우스의 성 실험 질문 해결 되 고에 의해 결정 됩니다) isoflurane 흡입 마 취 법 챔버 내의 종이 타월에 배치의 1 mL와 함께. 동물 취 깊이 움직임과 느린 호흡의 부족에 의해 입증으로 때 마 취 법 상공에서 그것을 제거 하 고는 단두대를 사용 하 여 목을 벨.
- 코에 두개골의 뒤에서가 위의 작은 쌍으로 피부를 절단 하 여 두개골을 노출 합니다. Bregma 수준에서 구멍을 미니 뼈 rongeurs의 작은 쌍을 사용 합니다. 그런 다음가 위를 사용 하 여 화살 봉합을 따라 꼬리-rostral 컷을 만들기 위해. rongeurs와 뒷면 각 두개골 플랩 리프트 상승 및 바깥쪽 각 반구를 덮고 두개골을 제거 하 파악.
- 두뇌 완전히 노출 후 작은 주걱으로 시 신경 약화. 두개골에서 뇌를 제거 하 고 지속적으로 산소, 차가운 실제 자당을 포함 하는 배양 접시에 넣어 (자당 농도 표 1 참조).
- 더 오래 된 쥐에서 조직에 필요한 경우는 intracardiac 관류 뇌 추출 전에 차가운 실제 자당의 20 mL 가득 주사기 (25 G) 좋은 품질 슬라이스를 사용 하 여 수행 합니다.
- 추출한 동물 두뇌에서 hippocampal 조각을 준비.
- 약 2 분에 대 한 뇌 진정 얼음 포장 페 트리 접시에 필터 종이, 필터 종이에 두뇌를 전송 하자. 두 개의 반구를 해 부.
- Vibratome 테이블에 (방향 화관, 횡단, 또는 수평 분할을 얻기 위해 실험 목표에 의해 결정 됩니다) 해 부 반구를 접착제와 차가운 산소 실제 자당 가득 vibratome 트레이에 몰입할. Vibratome 트레이 주위 얼음 배치 또는 vibratome 쿨러를 사용 하 여 300 µ m 약 1 ° C의 온도에서 두꺼운 조각을 확인 합니다.
- 37 ° c가 열 산소 실제 복구를 포함 하는 목욕에서 해 마 (반구 당 최대 6 조각)를 포함 하는 조각 축적 무광택 페인트 브러시를 사용 하 여
- 적어도 45 분 동안 실제 복구 목욕에서 슬라이스를 둡니다.
3. 전체 셀 패치 클램프 기록
- 목표에서 배치 하는 목욕에서 hippocampal 슬라이스를 설정 (배율: 40 x, 숫자 조리개: 0.8) 레이저 스캔 2 광자 현미경의. 지속적으로 산소 실제 정상에 2.5-3 mL/min의 속도로 30-32 ° C에 온수로 목욕을 perfuse.
- 적외선 차동 간섭 콘트라스트 (IR-DIC) 또는 Dodt-SGC 현미경에 사용 하 여 관심의 크기, 모양 및 위치를 사용 하 여 셀을 찾습니다.
참고: 대상된 신경 인구에 따라 유전자 변형 마우스 모델 관심사의 세포를 쉽게 찾으려면 사용할 수 있습니다. 이 경우에,이 단계는 형광 광원의 사용으로 교체하실 수 있습니다. - (예를 들어, 알 렉 사-594) 빨간 fluorophore를 포함 하는 실제 일반 솔루션에 자극 피 펫을 채우십시오.
- 팁의 셀과 같은 지역에 되도록 조각 위에 자극 피 펫 (전기 자극 장치에 연결 된)을 설정 합니다.
- 패치 솔루션 패치 피 펫을 채우는 머리 단계에 그것을 연결 후, 설정 조각에는 그것의 팁의 셀 바로 위에.
- 3 방향 자 지에 주사기를 맞게 하 고 플라스틱 튜브를 통해 패치 피 펫을 연결. 패치 피펫으로 지속적인 긍정적인 압력 주입 (≈ 0.1 mL) 주사기를 사용 하 여. "가까운" 위치에 있는 자 지를 계속.
- 앰프 제어 소프트웨어 모듈을 활성화 하 고 "VC" 버튼을 클릭 하 여 전압 클램프 모드를 전환할. Electrophysiological 신호 수집을 위한 전기 생리학 데이터 수집 소프트웨어 (예, clampex)를 오픈 하 고 지속적으로 모니터링 하는 데 필요한 사각형 전압 펄스 (5 mV, 10 ms)를 보내 그것을 "막 테스트" 아이콘을 클릭 피 펫 저항 변화입니다.
- 오른쪽 상단에 대상된 셀의 될 때까지 패치 피 펫을 낮춥니다. 제작 시 세포 막과 접촉, "열기" 위치로 자 지를 설정 하 여 압력을 제거.
참고: 세포 막과 접촉 감지 때 피 펫 저항에 작은 증가 (≈ 0.2 m ω) 볼은 셀에 작은 들여쓰기는 긍정적인 압력에 의해 발생 하는 고. - 자 지에 적합 해 소프트웨어에서 제공 하는 피 펫 저항 1 GΩ에 도달할 때까지 빈 주사기를 사용 하 여 패치 피 펫에 약간의 부정적인 압력을 적용 됩니다. 데이터 수집 소프트웨어의 ' 막 테스트 ' 창에서 클램프-60 셀 mV.
- 부정적인 압력을 적용 하는 셀 열리고 전체 셀 구성 달성 될 때까지 계속 합니다. 이 셀의 검출 (interneuron 유형에 따라 70-500 m ω 1 GΩ)에서 피 펫 저항과 ' 막 테스트 ' 창에 큰 용량 성 과도의 외관에 급격 한 변화를 기반으로 합니다.
4. 2-광자 캘리포니아2 + 영상
- 흥분 성의 postsynaptic 응답에 관심이 있으면 추가 GABAA 수용 체 차단 gabazine (10 µ M) 및 GABAB 수용 체 차단 CGP55845 (2 µ M)에서 실제 목욕.
- 앰프 제어 소프트웨어 모듈에 "CC" 버튼을 클릭 하 여 패치 구성을 전류 클램프로 설정 하 고 전류를 depolarizing의 체세포 주사에 대 한 응답에서 셀의 발사 패턴 기록 (0.8-1.0 나, 1 s). 지표에 패치 솔루션으로 채워질 셀에 대 한 적어도 30 분을 기다립니다.
참고: 셀의 발사 패턴 및 활성 속성 사용할 수 있습니다 셀의 하위;을 식별 하 예를 들어, 빠른 급상승 셀입니다. 표시기 농도 기록 (문제 해결 참조 표 2 ) 고양이를 시작 하기 전에 보급을 통해 안정화를 위해 중요 하다. - AP 갖는 고양이
- 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 수집 시작 합니다. 빨간 형광 신호를 사용 하 여 관심사의 모 수석을 찾습니다. 보이는 응답을 보장 하기 위해, AP 역전파의 효율성을 크게 GABAergic 수22거리 거부할 수 있습니다으로 먼저, 근 모 수석 (≤ 50 µ m)를 선택 합니다.
- '직사각형 도구'를 사용 하 여 이미지 수집 소프트웨어에서, 대상된 지역에 확대 하 고 전환 하는 "xt" (라인) 모드. 관심의 수지상 지점에 걸쳐 스캔 위치입니다. 수집 소프트웨어에서 레이저 강도 컨트롤러 2 광자 레이저 phototoxicity을 피하기 위해, 단지 약간 표시 기준 녹색 형광이는 최소한의 전력 레벨에서 설정 합니다.
- 전기 생리학 데이터 수집 소프트웨어 '프로토콜' 창 및 이미지 수집 소프트웨어, 원하는 진폭의 체세포 현재 분사를 포함 하는 원하는 기간의 기록 재판을 만듭니다.
- 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 "시작 기록" 버튼을 클릭 하 고 3-10 회 지속적으로 1-2 미 반복을 위한 형광 이미지 수집을 취득. 단일 검색을 피하기 위해 photodamage 사이 대기 적어도 30 s. 모 수석 따라 여러 지점에서 linescans를 취득 하는 경우 순서 효과 피하기 위해 임의의 순서로 그들을 데리고.
- Synaptically 갖는 고양이
- 빨간 형광 신호를 사용 하 여 관심사의 모 수석을 찾습니다.
- 관심 있는 모 수석 위에 조각의 표면에 자극 피 펫을 설정 합니다. 천천히 낮은 자극 피 펫에 운동을 방해 하는 전체 셀 구성 하지 않으려면를 최소화. 위치는 모 수석에서 10-15 µ m에 피 펫입니다.
- Aspiny 모 수석에서 시 냅 스 microdomains의 위치를 시각화 하려면 이미지 수집 소프트웨어에서 전환 하는 'xt' (라인) 모드와 관심의 수지상 지점 따라 라인 위치.
- (의 전기 생리학 데이터 수집 소프트웨어) '프로토콜' 창에 이미지 수집 소프트웨어, 시험 시작 후 자극 단위는 기록 재판을 만듭니다.
- 수집 소프트웨어를 사용 하 여 버튼을 클릭 "시작 기록"를 3-5 번, 1-2 미 반복 수집을 위한 지속적으로 모 수석에 따라 스캔 30 대기 photodamage를 방지 하기 위해 검사 사이 s.
참고: 스캔 길이 갖는 이벤트의 속도 따라 조정 될 수 있다 하지만 photodamage 방지를 최소화 해야 합니다 (문제 해결 참조 표 2 ). - 해결 되 고 특정 질문에 따라 다른 조건 (예를 들면, 자극의 다른 강도/길이, 약리 차단, 등의 도입)에 4.5.5 단계를 반복 합니다.
- 셀 건강 악화의 흔적을 보여줍니다 때 인수를 중지:-45 아래 도발은 mV, 기준선 Ca2 + 레벨, 모 수석 (예를 들어, blebbing, 조각화; 보십시오 표 2 의 형태학 저하의에서 증가 대 한 문제 해결).
- 셀의 형태에 예비 정보를 자극 피 펫의 위치 기록을 유지, Z-스택 빨강 채널에 셀의 취득. 수집 소프트웨어를 사용 하 여 'xyz' 모드, 포함 하는 모든 프로세스와 전체 셀을 이미지를 상단 및 낮은 스택 제한을 설정. 1 µ m에서 '스텝 크기'를 설정 하 고 "시작 기록" 버튼을 사용 하 여 스택 수집 시작.
- 때 Z-스택 인수 완료, 소프트웨어에서 "최대 투영" 옵션을 사용 하 여 스택의 모든 초점 계획을 입력 해 수집의 품질을 확인 하. 그런 다음, 천천히 조각에서 패치 피펫으로 철회.
- 특별 게시 형태 식별에 대 한 슬라이스를 해결 하려면 신속 하 게 무광택 페인트 브러시를 사용 하 여 목욕에서 슬라이스를 제거 하 고 실제 가득 페 트리 접시에 두 개의 필터 논문 사이 장소. 4 %paraformaldehyde (PFA) 솔루션으로는 실제를 대체 하 고 밤새 4 ° C 방 또는 냉장고에 있는 요리를 두고.
5. Immunohistochemistry 포스트 Hoc 기록 된 셀의 형태학 식별
참고: 고정 PFA에서의 1 박 후 조각을 저장할 수 있습니다 나트륨 아 지 드 (0.5%)와 인산 버퍼 (PB)에 최대 1 개월.
- Tris 버퍼 염 분 솔루션 (TBS) 트라이 톤 X-100 (0.3%)에 슬라이스를 넣고 4 세척 (5-10 분 마다) 수행.
- TBS-트리톤에는 슬라이스를 넣어 1 시간에 대 한 10% 정상 염소 혈 청 (NGS) 0.3%.
- TBS-트리톤 0.3%는 슬라이스를 넣어 1 %NGS는 Streptavidin 활용 fluorophore (예를 들어, 알 렉 사 Fluor 546 활용 Streptavidin 1: 200)에 대 한 하룻밤 부 화.
- 씻어 4 번 (5-10 분) tbs.
- 현미경 슬라이드와 confocal 현미경을 사용 하 여 이미지에 분할 영역을 탑재 합니다. 완전 한 세포 재건 하려면, Z취득-스택 (단계 크기: 1 µ m) 20 x 목표를 사용 하 여. 알 렉 사-546-활용 된 레이블 이미징, 543 nm 레이저와 515-560 nm 검색 필터를 사용 하 여 설정 합니다.
6입니다. 고양이의 분석
- 빨간색과 녹색 채널에서 라인 이미지에 관심 (ROIs) 영역에서 형광 값을 추출 하 고 소음을 줄이기 위해 각 조건에 대해 여러 개의 반복의 값을 평균.
참고: 라인 인수는 모 수석에 따라 수행 될 때 그것은 수지상 microdomains (2-5 µ m)에 해당 하는 수 있습니다, 여러 ROIs에서 데이터를 추출 하 고 따라서 Ca2 + 신호 구획의 연구를 수 있도록. - 각 투자 수익에 대 한 캘리포니아2 + 진폭으로 변화를 표현.
참고: 여기 G는 녹색 채널;에서 형광 값 G0 은 녹색 채널에서 기준선 형광 값 사전 자극 기간; R은 빨강 채널18에서 형광 값입니다. 와 2 광자 여기 매우 지역화 된 중요 한 배경 생성 하지 않습니다, 배경 형광의 빼기 필요 하지 않습니다.
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Representative Results
여기에 제시 된 프로토콜을 사용 하 여, 우리 고양이 체세포 현재 분사와 해 마의 CA1 영역에서 oriens/alveus 수의 모 수석에 전기 자극을 갖는 얻은. 여러 점에서 근 모 수석에 걸쳐 linescans 획득 후에 그것의 모양 및 위치에 따라 식별 신경, 패치, 소마 (그림 1A)에서 거리에 주어진. 우리 고양이 소마 증가 (감소 AP 진폭 또는 칼슘 채널 유통, 그림 1B에 거리 의존 감소 지표)에서 거리로 backpropagating APs에 의해 유도 된의 진폭에 있는 감소는 관찰. Immunohistochemistry (를 사용 하 여 알 렉 사 Fluor 546 Streptavidin 활용), 후 biocytin 셀의 라벨을 검색 하 여 동일시 기록된 신경 bistratified 셀으로 축 삭 oriens 지층과 지층 radiatum (그림을 차지 수 있었습니다. 1 C). 두 번째 실험에서 자극 피 펫 원심 수지상 사이트에 주어졌다. 모 수석 따라 스캔, 우리 통로의 축 삭의 전기 자극에 대 한 응답에서 특정된 수지상 지점 (그림 2A-C)에 postsynaptic Ca2 + 신호 진폭 평가 수 다음 있었다. Postsynaptic 고양이 이웃 수지상 microdomains (1 ~ 6; 세그먼트 사이 달랐다 그림 2D), 캘리포니아2 + 신호 개시 관련된 다른 postsynaptic 메커니즘의 영역에서의 확산에 연관 될 수 있는.
그림 1: AP 갖는 Ca2 + 과도의 대표적인 예. (A) 최대 2 광자 Z의 투영-패치 interneuron의 스택 (13 µ m) 알 렉 사-594로 가득 (20 µ M). 화이트 라인 위치와 linescans의 길이 나타냅니다. A. 상단 추적에 표시 된 위치에 elicited 고양이 보여주는 (B) 추적 재판 기록 중 체세포 현재 분사를 통해 생성 된 짧은 AP 기차를 보여줍니다. 시간 규모는 모든 흔적 표시에 동일 합니다. (C) 최대 confocal Z의 투영-셀 라벨 biocytin 보여주는 스택. 종류나: Oriens/Alveus; PYR: 지층 Pyramidale; RAD: 지층 Radiatum입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Postsynaptic 캘리포니아2 + 과도 전기 자극 (3 자극 100 Hz에서)에 의해 불러 일으켰다. (A) 최대 2 광자 Z의 투영-스택 (148 µ m) 알 렉 사-594 가득 패치 interneuron 보여주는. 흰색 화살표는 axonal 단말기는 interneuron 바구니 셀 제안 피라미드 계층 내에서 위치를 가리킵니다. (B) 단일 초점 비행기 수지상 지점 자극 전극 위치를 보여주는. 파선 (C1 및 C2)에 표시 된 라인의 위치를 보여줍니다. (C) 이미지 (1; 빨간색에서 라인의 결과 보여주는 알 렉 사-594; 20 µ M) 및 녹색 (2; 오 레 곤 그린 Bapta-5N; 300 µ M) 채널입니다. 이미지 30 µ m. (D) 추적 Ca2 + 과도 (고양이)를 보여주는 c 2에 표시 하는 세그먼트에 elicited 응답의 확산 분석 하 더 작은 세그먼트로 범주화 되었다. 최고 추적 영상 재판 중 체세포 수준에서 기록 하는 전기 자극을 전압 응답을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 솔루션 | 구성 요소 | 농도 (mM) |
| 실제 정상 | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2포4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 2 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| 포도 당 | 10 | |
| CaCl2 | 2 | |
| 실제 복구 | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2포4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 3 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| 포도 당 | 10 | |
| CaCl2 | 1 | |
| 실제 자당 | KCl | 2 |
| NaH2포4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 7 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| 포도 당 | 10 | |
| 자당 | 219 | |
| CaCl2 | 1 | |
| K+-패치 솔루션을 기반으로 | K+-글 루 콘 산 | 130 |
| HEPES | 10 | |
| MgCl2 | 2 | |
| Phosphocreatin 디 (tris) 소금 | 10 | |
| ATP-트리 스 | 2 | |
| GTP-트리 스 | 0.2 | |
| Biocytin | 72 | |
| 알 렉 사-594 | 0.02 | |
| 오 레 곤 그린-BAPTA-1 | 0.2 |
표 1: 솔루션 조리법. 화합물 그리고 농도 프로토콜 중 사용 되는 솔루션에 대 한.
| 문제 | 솔루션 |
| 건강 한 신경 패치를 수 없습니다 | 슬라이스는 건강 신호에 대 한 확인: 수축 된 또는 셀, 보이는 핵, 등을 부 어. 그렇다면, 폐기 조각. 또한 패치 솔루션 osmolality; 패치-피 펫 저항 확인 값은 적절 한 범위에 있지 않은 경우에 그들을 대체. |
| 모 수석에서 형광 신호는 낮은 | 채울 셀에 대 한 더 기다려. 확산 하는 셀에 패치 솔루션을 유지 하는 방해 경우 패치-피 펫에 부정적인 압력의 작은 금액을 적용 하려고 합니다. |
| 전기 자극은 Ca2 + 응답을 evoking 하지 | Electrophysiological 기록에는 예의 존재를 확인 합니다. 결 석 한 단락-회로/자극에 대 한 확인 경우 장치 고장. 경우, 자극 강도 인상 하거나 자극 피펫으로 가까이 모 수석에 이동 합니다. 그것은 지적 자극 전극과는 모 수석 사이 거리 8 시 냅 스 응답을 공부 하면 dendrites의 직접 도발은 방지 하기 위해 um을 초과 하지 않아야 합니다. |
| 갖는 Ca2 + 신호는 너무 높은/포화 Ca2 + 표시기 | 레이저 파워를 줄일 수 있습니다. 문제가 지속 되 면 여러 셀에, 다른 Ca2 + 표시기, 사용 와 낮은 Ca2 + 선호도입니다. |
| 기준선 Ca2 + 신호는 실험 기간 동안 점차적으로 증가 하 | 개별 검사 사이 더 긴 기간에 대 한 기다립니다. 기준선은 여전히 증가 하는 경우 중지 수집; 그것은 세포의 건강 감소 가능성을 나타냅니다. |
| 검사 중 Ca2 + 신호 감소의 진폭 | 레이저 파워를 감소 또는 축소 (있는 경우). |
| 모 수석 검사 후 ("blebbing") 분할은 | 레이저 파워를 감소 또는 축소. Blebbing 대상된 모 수석으로 제한 하는 경우 선택 하는 또 다른 모 수석 레이저 전력 감소/축소. 만약 여러 dendrites blebbing, 수집을 중지 합니다. |
| 형광 신호는 "표류" 스캔 라인 청소 후 | 실제 관류의 속도 줄여 베이스에 움직임을 줄일 수 있습니다. 패치 하기 전에 확인 확실히 조각 그물에 의해 장소에서 강력 하 게 고정 됩니다. |
테이블 2: 테이블 문제 해결. 캘리포니아2 + 이미징 실험 하는 동안 발생할 수 있는 일반적인 문제 솔루션.
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Discussion
여기에 나와 있는 메서드는 공부 수지상 캘리포니아2 + 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 신호 2 광자 캘리포니아2 + 이미징 및 패치 클램프 전기 생리학의 결합을 사용 하는 방법을 보여 줍니다. 이 메서드는 두는 로컬 Ca2 + 고도 전기 자극 또는 backpropagating AP 수지상 세그먼트, 및 세포의 체세포 응답에 의해 evoked의 모니터링에 대 한 수 있습니다. 이렇게 하면 수지상 나무의 다양 한 부분 입력을 통합 하 고는 소마와 통신 공부 하는 훌륭한 도구. 하지만 실험의 길이, 주어진 특정 관심 dendrites의 photodamage 피하기 이미징을 위한 레이저 힘의 사용을 제한 하 여 세포 건강에 지불 되어야 합니다. 이 확대/축소 수준을 감소, 감소, 스캔 기간 및 이미지 수집 동안 스캔 속도 증가 또한 얻을 수 있습니다. 이미징 interneuron dendrites 추가적인 소개 합니다. 이러한 세포의 dendrites 없는 쪽이 있다는 모 수석에 따라 검사 것이 좋습니다 postsynaptic 캘리포니아2 + microdomains의 현지화를 촉진 하기 위하여. 또한, 캘리포니아2 + 고도 interneuron dendrites에 작고 피라미드 세포의 모 수석에서 생성 된 보다는 높은 생 Ca2 + 바인딩 용량을 감안할 때. 이 Ca2 + 신호 속도 적절 하 게 설명 하기 위해 개별 linescans의 충분히 긴 기간 뿐만 아니라 평균에 대 한 몇 가지 라인 이미지를 획득 해야 합니다.
바이 폴라 세타-유리 전극을 사용 하 여 로컬 전기 자극 수지상 postsynaptic Ca2 + microdomains의 특성 분석을 위한 유용한 도구를 나타냅니다. 그러나, 그것은 여전히 활성화 있습니다 다른 "앙 파상" 주어진된 지역에 있는 축 삭. 활성화 하는 입력의 수는이 경우 알 하 고 예상할 수 있는 추가 계산 도구를 사용 하 여. 두 광자 조미료 uncaging27, 여러 개별 시 냅 스의 동시 자극에 대 한 수 있는 로컬 수지상 Ca2 + 응답 도출에 대 한 좋은 대안을 나타냅니다. 이 방법은 흥분 성의 postsynaptic 구조 (등뼈) 명확 하 게 정의한, 주 세포의 연구에 널리 사용 하지만 전반적으로는 낮은 척추 밀도가지고 수의 연구에 적합 하지 않습니다. Uncaging 조미료 interneuron 모 수석 따라 주 셀에 적용 되어 피할 활성화 여러 extrasynaptic 메커니즘의 캘리포니아2 + 9,10, 해석 하기 어려운 신호는 관측입니다.
지난 10 년간, 광학 기술의 발전 2 광자 캘리포니아2 + 이미징에 대 한 향상 된 시간 해상도 제공합니다. 가장 유망한 중 하나는 acousto 광학 deflectors (AODs),2829통해 임의 액세스 현미경 (경사로)입니다. 전통적인 래스터 스캔, 달리 램프는 관성 무료 AODs의 빠른 속도 의해 활성화 되어 높은 주파수에서 선택한 포인트를 검색 합니다. 이건 여러 수지상 가지의 동시 연구에 이상적로 선형 패턴에 누워 포인트에 국한 되지 않습니다. 그러나, 캘리포니아2 + 이벤트 같은 초점 계획 내에서 밀리초의 수백을 지속 이미징 하는 경우에 더 높은 시간 해상도 AODs에서 제공 필요 하지 않을 수 있습니다. 또한, 검색 구조 내에서 동일한 관심의 포인트의 위치 제어와 슬라이스 준비에 좋은 조각 품질에 필요한 높은 관류 속도와 관련 된 마이크로-드리프트를 어려울 수 있습니다. 따라서,이 문서에 제공 된 높은 시간 해상도 (500-700 Hz) 라인 기반 수집 방법이 바람직합니다 여전히 개별 수지상 지점에서 캘리포니아2 + 신호를 이미징 하는 경우.
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Disclosures
저자는 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌 있다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회, 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC 발견 부여)와 사 보이 재단에 의해 지원 되었다. OC에서 NSERC 박사 장학금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Strain: Mouse CD1 | Charles River | 022 | |
| Isoflurane | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
| CGP 55845 hydrochloride | Abcam | ab120337 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
| SR95531 (Gabazine) | Abcam | ab120042 | |
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris |
Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosine (GTP)-Na+ |
Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 |
ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphocreatine di(tris) salt |
Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin-conjugated Alexa-546 |
ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Patch Borosilicate Glass Capillaries |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Borosilicate Glass Capillaries |
Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller |
Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope |
Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser |
Coherent | ||
| LAS AF Imaging Acquisition Software | Leica Microsystems | ||
Temperature Controller TC-324B |
Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifier |
Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer |
Molecular Devices | ||
Confocal Translator |
Siskiyou | ||
Micromanipulator |
Siskiyou | ||
pClamp Data Acquisition Software |
Molecular Devices | ||
A365 Constant Current Stimulus Isolator |
World Precision Instruments | ||
Vibraplane Optical Table |
Kinetic Systems |
References
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