Summary
Este protocolo detalha a técnica de remoção do cérebro de porco em sua totalidade e dissecção de várias regiões cerebrais comumente estudadas na neurociência.
Abstract
O uso do porco como modelo animal pré-clínico e traduzível tem sido bem documentado e aceito por campos de pesquisa que investigam sistemas cardiovasculares, sistemas gastrointestinais e nutrição, e o suíno está sendo cada vez mais usado como um grande modelo animal na neurociência. Além disso, o suíno é um modelo aceito para estudar o neurodesenvolvimento, pois exibe padrões de crescimento e desenvolvimento cerebral semelhantes ao que ocorre em humanos. Como um modelo animal menos comum na neurociência, procedimentos cirúrgicos e de dissecção em suínos podem não ser tão familiares ou bem praticados entre os pesquisadores. Portanto, um protocolo visual padronizado detalhando métodos consistentes de extração e dissecção pode ser valioso para pesquisadores que trabalham com o porco. O vídeo a seguir mostra uma técnica para remover o cérebro de porco, mantendo o córtex e o tronco cerebral intactos e revisa métodos para dissecar várias regiões cerebrais comumente investigadas, incluindo o tronco cerebral, cerebelo, cérebro médio, hipocampo, estrito, tálamo e córtex pré-frontal medial. O objetivo deste vídeo é fornecer aos pesquisadores as ferramentas e conhecimentos necessários para realizar consistentemente uma extração e dissecção cerebral no porco de quatro semanas de idade.
Introduction
O suíno foi bem documentado e aceito como modelo animal translacionável para pesquisa em sistemas cardiovasculares1, sistemas gastrointestinais2,nutrição3,4, diabetes5,toxicologia6, e técnicas cirúrgicas7. O uso do suíno na neurociência está começando a aumentar, à medida que as pesquisas do PubMed para as palavras-chave "modelo animal cérebro suíno" resultam em quatro vezes mais resultados de 1996-2005 do que no período anterior de 10 anos8, e ainda mais resultados no momento. Uma das principais razões pelas quais a popularidade do modelo suíno está se expandindo é devido às suas semelhanças em crescimento, estrutura e função do cérebro quando comparado com os humanos. Em comparação com o cérebro humano, o cérebro de porco apresenta padronagem giroscraca semelhante, vascularização e distribuição de matéria cinza e branca9. Além disso, o cérebro de porco tem sido usado em procedimentos de neuroimagem, evocado potencial de gravação e no estabelecimento de técnicas de neurocirurgia8,9. Ao contrário de outros modelos animais, no entanto, a experiência suína e humana de crescimento cerebral perinatal, em oposição aos surtos de crescimento pré ou pós-natal. Ao nascer, o cérebro humano e suíno pesa aproximadamente 27 e 25% de seu peso cerebral adulto, respectivamente, em comparação com o cérebro de rato que pesa 12% de seu peso cerebral adulto e o cérebro de macaco resus em 76% do peso adulto10.
Uma das razões pelas quais o porco só foi adotado lentamente como modelo animal para a neurociência é porque muitos pesquisadores não estão familiarizados com o animal neste contexto. Os pesquisadores podem não estar cientes de seus potenciais usos no campo ou podem não saber as técnicas adequadas necessárias para usar tal modelo. Como o uso do suíno como modelo biomédico e pré-clínico ganha atenção e uso na neurociência, é necessário estabelecer procedimentos padronizados de remoção de tecidos para garantir a comparação precisa dos dados entre os estudos. Embora as técnicas cirúrgicas e dissecção envolvendo o cérebro de suíno tenham sido publicadas em outros lugares11,12,13, há a necessidade de protocolos simples e padronizados para coletar tecido cerebral suíno, especialmente para uso em ensaios bioquímicos. Como tal, o objetivo deste vídeo é fornecer o conhecimento necessário para permitir que os pesquisadores realizem uma extração e dissecção cerebral padronizada. Este vídeo ilustra uma técnica adequada para remover o cérebro de porco, mantendo o córtex e o tronco cerebral intactos, e posteriormente revisar métodos para dissecar várias regiões cerebrais chave.
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Protocol
Procedimentos envolvendo matérias animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Illinois em Urbana-Champaign
NOTA: Antes da eutanásia, o porco foi anestesiado via injeção intramuscular com uma combinação de telazol:cetamina:xilazina (50,0 mg de tiletamina HCl mais 50,0 mgs de zolazepam HCl reconstituído com 2,50 mL de cetamina HCl (100 g/L) e 2,50 mL de xilazina (100 g/L) e administrada a 0,06 mg/kg BW). Uma vez anestesiado, o suíno foi eutanizado através da administração intracardiac de pentobarbital de sódio (390 mg/mL administrado a 1 mL/5 kg BW). Para dissecção cerebral, recomenda-se que o método de eutanásia seja escolhido com base no procedimento analítico desejado do tecido. O método de eutanásia deve causar o mínimo de danos ao cérebro possível.
1. Extração do cérebro de porco
- Seguindo a eutanásia humana, decapite o porco cortando acima da nuca, entre a primeira e a segunda vértebra (atlas e eixo, respectivamente).
- Fixar a cabeça em um torno de banco imobilizado modificado para incluir picos. Certifique-se de que a cabeça está completamente imobilizada antes de prosseguir.
- Usando um bisturi, faça um corte sagital ao longo da linha média do crânio que continua até o posterior da cabeça.
- Faça um segundo (transversal) corte na parte posterior da cabeça.
- Faça um terceiro (transverso) corte na extremidade posterior do focinho e em linha com os olhos. Corte a pele o mais longe possível do crânio para garantir fácil acesso ao crânio.
- Usando uma serra óssea, faça dois cortes anteriores a posteriores laterais até a linha média, estendendo-se dos olhos até o ápice da curvatura do crânio. Bevel a serra em direção à linha média e corte fundo o suficiente para penetrar o crânio.
- Repita o processo acima nas laterais perpendiculares, criando uma "janela" retangular no crânio.
- Usando um gancho de carne, tire a seção retangular do crânio. Comece colocando o gancho em um dos cantos da seção e aplique pressão para cima para soltar a peça do crânio. Tome cuidado para colocar o gancho de carne apenas no nível do crânio para evitar penetrar inadvertidamente o tecido cerebral.
- Se alguma camada meningeal permanecer no cérebro, use fórceps e tesouras sem cortes (ou, alternativamente, um bisturi) para remover suavemente as camadas sem cortar o cérebro.
- Use um bisturi para cortar músculo e gordura na parte posterior da cabeça, expondo a porção posterior do crânio.
- Faça dois cortes transversais ao longo da parte posterior do crânio. Certifique-se de não cortar o tecido cerebral.
- Segure a cabeça colocando uma mão firme no focinho e aplique uma pressão para trás para puxar a parte posterior do crânio, expondo o cerebelo.
- Retire a cabeça do vício do banco e coloque em um tapete cirúrgico.
- Use uma ferramenta longa e esbelta, como a extremidade cega de um bisturi, para remover o cérebro. Inverta a cabeça e use um movimento suave para persuadir o cérebro para fora da cavidade do crânio sem danificar a superfície do cérebro.
NOTA: Será necessário cortar nervos cranianos para remover o cérebro. Faça isso suavemente e não tente puxar o cérebro com força para fora. O cérebro cairá por conta própria quando estiver devidamente e completamente separado do crânio e coluna.
2. Dissecção do cérebro de porco
NOTA: Pode ser útil usar um atlas cerebral ou guia de dissecção defibras 14 como representação visual durante os procedimentos de dissecção. Certifique-se de que as amostras de tecido dissecadas sejam armazenadas adequadamente de acordo com as necessidades específicas do projeto após a remoção de cada amostra (descritas com mais detalhes abaixo). Além disso, observe que, para efeitos deste vídeo, todas as regiões cerebrais mostradas foram dissecadas do hemisfério direito, mas isso pode diferir por laboratório com base em objetivos experimentais.
- Para remover o tronco cerebral (predominantemente a medula), faça um corte coronal caudal ao cerebelo.
- Para remover o cerebelo, faça um corte coronal posterior ao córtex. Isolar as regiões desejadas (por exemplo, vermis, flocculus, etc.) do cerebelo desta amostra. Certifique-se de não incluir nenhuma parte do tronco cerebral nesta amostra.
- Separe os dois hemisférios do cérebro fazendo um corte sagital ao longo da fissura longitudinal. Faça este corte como um movimento contínuo para evitar causar danos ao córtex.
- Para remover o cérebro médio, dissecar uma quantidade desejada de tecido apenas ventral para o coliculi superior e inferior.
- Para remover o hipocampo, coloque a extremidade contundente de um bisturi na parte posterior do caloso corpus e role suavemente o hipocampo para fora, usando um movimento "J" a partir da parte posterior do caloso corpus; um chifre hipocampal inteiro é "em forma de feijão".
- O estriato (núcleo caudado é mostrado principalmente) é uma região listrada de matéria cinza e branca logo abaixo do caloso corpus e anterior ao hipocampo. Desenale o bisturi e remova esta região, revelando tecido estriado após a remoção.
- Para remover o córtex pré-frontal medial, disseque o tecido do giro frontal até o caloso corpus, removendo a porção mais medial dessa seção. O córtex direito deve permanecer após a remoção do córtex pré-frontal medial.
- Para remover o tálamo, remova a estrutura semelhante à lâmpada no centro da superfície midsagittal do cérebro e rostral até o cérebro médio. O tálamo tem uma forma esférica e vai parecer um pouco mais escuro do que o tecido circundante.
3. Pós-dissecção
- Após a conclusão da dissecção, preserve as amostras de tecido adequadamente para análises subsequentes. A omissão desta etapa resultará em uma autolise e degradação significativas em até 20 minutos.
- Deixe cada região cerebral intacta no momento da dissecação se forem realizadas análises estruturais, ou pica-se os tecidos para criar uma amostra de tecido homogênea antes da preservação. Os métodos comuns de preservação da amostra para tecidos cerebrais incluem criopreservação e fixação química utilizando agentes de crosslinking15.
- Para ensaios de laboratório padrão (por exemplo, expressão genética ou proteica), mergulhe em nitrogênio líquido ou soluções que estabilizem o material genético antes do armazenamento a longo prazo a -80 °C para fornecer métodos de preservação convenientes e econômicos.
- Se manter a estrutura tecidual é uma prioridade, preserve os tecidos cerebrais através de métodos tradicionais de fixação (por exemplo, usando fixações à base de aldeído para cruzar proteínas), sem ou com perfusão do animal ou órgão de interesse antes da dissecação tecidual.
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Representative Results
Esta seção descreve exemplos de resultados obtidos após a extração correta e dissecção de um cérebro de porco de 4 semanas de idade. A Figura 1 descreve a forma de cada região cerebral para uso como guia durante a dissecção. Parte do tronco cerebral pode permanecer no crânio após a remoção do cerebelo(Figura 1B). Isso pode ser removido enquanto isola a região desejada do cerebelo. A Tabela 1 exibe o peso médio (erro médio ± padrão da média) para cada uma das regiões cerebrais dissecadas (n=5).
Figura 1: Cérebro de porco extraído. Contornos de regiões cerebrais para uso como guia durante a dissecção. As regiões mostradas são do hemisfério direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| região | Peso (g) | SEM |
| Porco Inteiro* | 8.006 | 0.545 |
| Tronco cerebral | 0.829 | 0.132 |
| cerebelo | 5.929 | 0.137 |
| mesencéfalo | 0.376 | 0.047 |
| hipocampo | 0.500 | 0.051 |
| Striatum | 0.410 | 0.115 |
| tálamo | 0.476 | 0.120 |
| Córtex Pré-Frontal medial | 0.459 | 0.122 |
| *Peso apresentado como kg |
Tabela 1: Pesos das regiões cerebrais. Peso médio do cérebro de porco de 4 semanas de idade e cada região cerebral dissecada (n=5).
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Discussion
As técnicas aqui descritas foram projetadas para suínos com aproximadamente 4 semanas de idade. É fundamental realizar essas etapas imediatamente após o suíno ter sido humanamente eutanizado para garantir que a integridade da estrutura do tecido cerebral seja mantida, especialmente quando se considera ensaios bioquímicos subsequentes. É útil usar um atlas ou guias de dissecção de fibras16 ao aprender as técnicas pela primeira vez. Recomenda-se que o experimentador pratique várias extrações cerebrais e dissecções antes da obtenção de amostras para coleta de dados. O passo mais difícil é a remoção do crânio. Este passo se tornará mais fácil com a experiência, pois em grande parte requer prática em primeira mão para saber onde no crânio para serrar e quando o crânio foi cortado. Este procedimento é semelhante ao descrito por Bassi et al.12, embora não exija a necessidade de criar uma janela craniana hexagonal e fornece um tutorial visual de como executar a técnica.
Uma limitação dessa técnica é que, ao trabalhar com porcos mais velhos, pode levar mais tempo para remover o crânio à medida que ele se torna significativamente mais grosso com a idade. Se o uso de uma serra é muito trabalhoso ou ineficaz para crânios mais grossos, pode ser necessário usar um martelo e um cinzel, como o mostrado por Bjarkam et al.13, ou equipamento cirúrgico alimentado (por exemplo, serra óssea). Além disso, essa técnica nem sempre garante a captura das lâmpadas olfativas.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer Jim Knoblauch e Martin-Booth Hodges da Faculdade de Serviços de Tecnologia da Informação e Comunicação agrícola, de consumo e de ciências ambientais por sua experiência em fotografar, gravar e editar áudio e vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #22 Scalpel Blades for #4 Handles | Ted Pella, inc. | 549-4S-22 | |
| 11 1/2" Satterlee Bone Saw | Leica Biosystems | 38DI13425 | |
| 5 1/2" Skull Breaker with Chisel End (Meat Hook) | Leica Biosystems | 38DI37636 | |
| 5-inch Heavy Duty Workshop Bench Vise | Pony | 29050 | |
| Butcher Knife 25cm | Victorinox | 5.7403.25 | Sharpen before use |
| CM40 Light Duty Drop Forged C Clamps | Bessey | 00655BC3120 | |
| Diamond Hone Knife Shaper | Chef’s Choice | 436-3 | |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle #4 | ThermoScientific | 5334 | |
| Tissue Forceps | Henry Schein | 101-5132 | |
| Vinyl Dissecting pad | Carolina | 629006 |
References
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