Summary
Bu protokol, domuz beyninin bütünüyle çıkarılması ve sinirbilimde yaygın olarak çalışılan birkaç beyin bölgesinin diseksiyonu tekniğini detaylandırıyor.
Abstract
Domuzun klinik öncesi ve çevrilebilir bir hayvan modeli olarak kullanılması, kardiyovasküler sistemleri, gastrointestinal sistemleri ve beslenmeyi araştıran araştırma alanları tarafından iyi belgelenmiş ve kabul edilmiştir ve domuz giderek nörobilimde büyük bir hayvan modeli olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, domuz, insanlarda meydana gelenlere benzer beyin büyüme ve gelişme kalıplarını sergilediği için nörogelişim üzerinde çalışmak için kabul edilen bir modeldir. Nörobilimde daha az yaygın bir hayvan modeli olarak, domuzlar üzerindeki cerrahi ve diseksiyon prosedürleri araştırmacılar arasında tanıdık veya iyi uygulanamayabilir. Bu nedenle, tutarlı ekstraksiyon ve diseksiyon yöntemlerini detaylandıran standartlaştırılmış bir görsel protokol domuzla çalışan araştırmacılar için değerli olabilir. Aşağıdaki video, korteks ve beyin sapı sağlam tutarken domuz beynini çıkarma tekniğini sergiler ve beyin sapı, beyincik, orta beyin, hipokampus, striatum, talamus ve medial prefrontal korteks dahil olmak üzere yaygın olarak araştırılan birkaç beyin bölgesini inceleme yöntemlerini gözden geçirir. Bu videonun amacı, araştırmacılara dört haftalık domuz üzerinde sürekli olarak beyin çıkarma ve diseksiyon yapmak için gerekli araçları ve bilgileri sağlamaktır.
Introduction
Domuz iyi belgelenmiş ve kardiyovasküler sistemler araştırma için çevrilebilir bir hayvan modeli olarak kabul edilmiştir1, gastrointestinal sistemler2, beslenme3,4, diyabet5, toksikoloji6ve cerrahi teknikler7. Domuzun sinirbilimde kullanımı artmaya başlıyor, çünkü PubMed "domuz beyin hayvanı modeli" anahtar kelimelerini arıyor, 1996-2005'ten önceki 10 yıllık dönem8'dendört kat daha fazla sonuç ve şu anda daha fazla sonuç elde ediyor. Domuz modelinin popülaritesinin genişlemesinin birincil nedeni, insanlarla karşılaştırıldığında beynin büyümesi, yapısı ve işlevindeki benzerlikleridir. İnsan beynine kıyasla, domuz beyni benzer jinek paternleme, damarlanma ve gri ve beyaz maddenin dağılımını sergiler9. Ayrıca, domuz beyni nörogörüntleme prosedürlerinde, potansiyel kaydı çağrıştıran ve nöroşirurji tekniklerinin oluşturulmasında kullanılmıştır8,9. Bununla birlikte, diğer hayvan modellerinin aksine, domuz ve insan, doğum öncesi veya sonrası büyüme fışkırtmasının aksine perinatal beyin büyümesini teşvik ediyor. Doğumda, insan ve domuz beyni yetişkin beyin ağırlığının yaklaşık yüzde 27 ve 25'ini tartar, yetişkin beyin ağırlığının yüzde 12'sini ağırlığındaki sıçan beynine ve yetişkin ağırlığının yüzde 76'sına sahip rhesus maymun beynine kıyasla10.
Domuzun nörobilim için bir hayvan modeli olarak yavaşça benimsenmesinin bir nedeni, birçok araştırmacının bu bağlamda hayvana aşina olmasıdır. Araştırmacılar, alandaki potansiyel kullanımlarının farkında olmayabilir veya böyle bir modeli kullanmak için gereken uygun teknikleri bilmiyor olabilirler. Domuzun biyomedikal ve preklinik bir model olarak kullanılması dikkat ve sinirbilimde kullanım kazandığından, çalışmalar arasında verilerin doğru bir şekilde karşılaştırılmasını sağlamak için standartlaştırılmış doku çıkarma prosedürleri oluşturmak gerekir. Domuz beynini içeren diseksiyon ve cerrahi teknikler başka bir yerde yayınlanmış olmasına rağmen11,12,13, özellikle biyokimyasal tahlillerde kullanılmak üzere domuz beyin dokusunu toplamak için basit ve standartlaştırılmış protokollere ihtiyaç vardır. Bu nedenle, bu videonun amacı, araştırmacıların standartlaştırılmış bir beyin çıkarma ve diseksiyon gerçekleştirmelerine izin vermek için gerekli bilgileri sağlamaktır. Bu video, korteksi ve beyin sapını sağlam tutarken domuz beynini çıkarmak ve daha sonra birkaç kilit beyin bölgesini incelemek için yöntemleri gözden geçirmek için uygun bir tekniği göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan konularını içeren prosedürler Urbana-Champaign'deki Illinois Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Ötanaziden önce, domuz telazol bir kombinasyonu ile intramüsküler enjeksiyon ile uyuşturuldu:ketamin:ksilazin (50.0 kiremittamin HCl artı 50.0 mg zolazepam HCl reconstitu 2,50 mL ketamin HCl (100 g/L) ve 2,50 mL ksilazin (100 g/L) ile uygulanır ve 0,06 mg/kg BW'de uygulanır. Uyuşturulduktan sonra domuz, sodyum pentobarbital intradiyak uygulama yoluyla ötenaziye tabi tedavüle edildi (1 mL/5 kg BW'de uygulanan 390 mg/mL). Beyin diseksiyonu için, dokunun istenen analitik prosedürüne göre ötanazi yönteminin seçilmesi önerilir. Ötenazi yöntemi beyne mümkün olduğunca az zarar vermelidir.
1. Domuz beyninin çıkarılması
- İnsancıl ötanaziyi takiben, birinci ve ikinci omur (sırasıyla atlas ve eksen) arasında boynun ensesinin üzerinde keserek domuzun kafasını koparın.
- Başı, sivri uçları içerecek şekilde modifiye edilmiş hareketsiz bir tezgah mengenesine sabitleyin. Devam etmeden önce başın tamamen hareketsiz olduğundan emin olun.
- Neşter kullanarak, kafatasının orta çizgisi boyunca başın arka kısmına kadar devam eden bir sagittal kesim yapın.
- Başın arka tarafında ikinci bir (enine) kesim yapın.
- Burun arka ucunda ve gözlerle aynı hizada üçüncü (enine) bir kesim yapın. Kafatasına kolay erişim sağlamak için cildi kafatasından mümkün olduğunca uzağa kesin.
- Bir kemik testeresi kullanarak, gözlerden kafatası eğriliğinin tepelerine kadar uzanan, orta çizgiye iki ön-arka kesik yanal yapın. Testereyi orta çizgiye doğru büzün ve kafatasına nüfuz edecek kadar derin kesin.
- Yukarıdaki işlemi dik kenarlarda tekrarlayın, kafatasında dikdörtgen bir "pencere" oluşturun.
- Bir et kancası kullanarak, kafatasının dikdörtgen bölümünü kurut. Kancayı bölümün köşelerinden birine yerleştirerek başlayın ve kafatası parçasını gevşetmek için yukarı doğru basınç uygulayın. Yanlışlıkla beyin dokusuna nüfuz etmesini önlemek için et kancasını sadece kafatası seviyesine yerleştirmeye özen edin.
- Beyinde herhangi bir meningeal tabaka kalırsa, beyni kesmeden katmanları nazikçe çıkarmak için önps ve künt makas (veya alternatif olarak bir neşter) kullanın.
- Kafatasının arka kısmını açığa çıkaran, başın arka kısmındaki kas ve yağı kesmek için bir neşter kullanın.
- Kafatasının arka kısmı boyunca iki enine kesik yap. Beyin dokusunu kesmemeye dikkat edin.
- Burun üzerine sıkı bir el koyarak başı sabitleyin ve kafatasının arka kısmını çekmek için geriye doğru bir basınç uygulayarak beyincikleri açığa çıkarın.
- Başı tezgah mengenesinden çıkarın ve cerrahi bir paspasın üzerine yerleştirin.
- Beyni çıkarmak için neşterin kör ucu gibi uzun ince bir alet kullanın. Başı ters çevirin ve beynin yüzeyine zarar vermeden beyni kafatası boşluğundan çıkarmak için hafif bir kepçe hareketi kullanın.
NOT: Beyni çıkarmak için kraniyal sinirleri kesmek gerekecektir. Bunu nazikçe yapın ve beyni zorla çıkarmaya çalışmayın. Beyin, kafatasından ve omurgadan düzgün ve tamamen ayrıldığında kendi kendine düşecektir.
2. Domuz beyninin diseksiyonu
NOT: Diseksiyon işlemleri sırasında görsel bir gösterim olarak beyin atlası veya lif diseksiyon kılavuzu14 kullanılması yararlı olabilir. Diseksiyonlu doku örneklerinin, her numunenin çıkarılmasından sonra projeye özgü ihtiyaçlara göre düzgün bir şekilde depolandığından emin olun (aşağıda daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır). Ayrıca, bu videonun amaçları doğrultusunda, gösterilen tüm beyin bölgelerinin sağ yarımküreden parçalandığını, ancak bunun deneysel hedeflere dayanarak laboratuvar başına farklılık gösterebileceğini lütfen unutmayın.
- Beyin sapı (ağırlıklı olarak medulla) çıkarmak için, beyincik için bir koronal kesim kaudal yapın.
- Beyinciği çıkarmak için kortekse bir koronal kesim posterior yapın. Bu örnekten beyinciklerin istenen bölgelerini (örneğin vermis, flokülus vb.) izole edin. Bu örneğe beyin sapının herhangi bir bölümünü dahil etmeyin.
- Uzunlamasına yarık boyunca orta sagittal bir kesik yaparak beynin iki yarımküresini ayırın. Kortekste hasar görmesini önlemek için bu kesimi sürekli bir hareket olarak yapın.
- Orta beyinleri çıkarmak için, istenen miktarda dokuyu sadece ventral olarak üstün ve alt kollikulilere ayırın.
- Hipokampusu çıkarmak için, bir neşterin kör ucını korpus callosumunun arka kısmına yerleştirin ve hipokampusu, korpusun callosumunun arka kısmından başlayan bir "J" hareketi kullanarak hafifçe yuvarlayın; tüm hipokampal boynuz 'fasulye şeklindedir'.
- Striatum (kaudat çekirdeği öncelikle gösterilmiştir) korpus callosum'un hemen altında gri ve beyaz madde çizgili bir bölgedir ve hipokampusa ön bölgedir. Neşteri bevel ve bu bölgeyi çıkarın, çıkarıldıktan sonra çizgili doku ortaya çıkarın.
- Medial prefrontal korteksi çıkarmak için, dokuyu frontal girustan korpus callosum'a kadar parçalara ayrıştırarak o bölümün en medial kısmını çıkarın. Medial prefrontal korteksin çıkarılmasından sonra sağ korteks kalmalıdır.
- Talamusu gidermek için, beynin ortasagittal yüzeyinin merkezindeki ampul benzeri yapıyı ve orta beyine rostral'ı çıkarın. Talamus küresel bir şekle sahiptir ve çevredeki dokudan biraz daha koyu görünecektir.
3. Diseksiyon sonrası
- Diseksiyonun tamamlanmasından sonra, doku örneklerini sonraki analizler için uygun şekilde koruyun. Bu adımın atlanması, 20 dakika gibi kısa bir sürede önemli ölçüde otoliz ve bozulmaya neden olacaktır.
- Yapısal analizler yapılacaksa, diseksiyon anında her beyin bölgesini olduğu gibi bırakın veya korumadan önce homojen bir doku örneği oluşturmak için dokuları kıyın. Beyin dokuları için yaygın örnek koruma yöntemleri kriyoprezervasyon ve çapraz bağlama ajanları kullanılarak kimyasal fiksasyoniçerir 15.
- Standart laboratuvar tahlilleri (örneğin, gen veya protein ekspresyot) için, uygun ve uygun maliyetli koruma yöntemleri sağlamak için -80 °C'de uzun süreli depolamadan önce genetik materyali stabilize eden sıvı azot veya çözeltilere dalın.
- Doku yapısını korumak bir öncelikse, doku diseksiyonu öncesinde hayvanın veya ilgi organının perfüzyonu olmadan veya perfüzyonu olmadan, geleneksel fiksasyon yöntemleriyle (örneğin, proteinleri çapraz bağlamak için aldehit bazlı fiksatifler kullanarak) beyin dokularını koruyun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu bölümde, 4 haftalık bir domuz beyninin doğru çıkarılması ve diseksiyonu sonrasında elde edilen sonuçların örnekleri açıklanmaktadır. Şekil 1, diseksiyon sırasında kılavuz olarak kullanılmak üzere her beyin bölgesinin şeklini özetlemektedir. Beyin sapının bir kısmı beyincik çıkarıldıktan sonra kafatasında kalabilir (Şekil 1B). Bu, beyincik istenen bölgeyi izole ederken çıkarılabilir. Tablo 1, parçalanmış beyin bölgelerinin her biri için ortalama ağırlığı (ortalamanın ortalama ± standart hatası) görüntüler (n=5).
Şekil 1: Çıkarılmış Domuz Beyni. Diseksiyon sırasında kılavuz olarak kullanılmak üzere beyin bölgelerinin ana hatları. Gösterilen bölgeler sağ yarımküredendir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Bölge | Ağırlık (g) | Sem |
| Bütün Domuz* | 8.006 | 0.545 |
| Beyin sapı | 0.829 | 0.132 |
| Beyincik | 5.929 | 0.137 |
| Orta beyin | 0.376 | 0.047 |
| Hipokampus | 0.500 | 0.051 |
| Striatum | 0.410 | 0.115 |
| Talamus | 0.476 | 0.120 |
| medial Prefrontal Korteks | 0.459 | 0.122 |
| *Kg olarak sunulan ağırlık |
Tablo 1: Beyin Bölgeleri Ağırlıkları. 4 haftalık domuz beyninin ortalama ağırlığı ve her parçalanmış beyin bölgesi (n=5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan teknikler yaklaşık 4 haftalık domuzlar için tasarlanmıştır. Özellikle sonraki biyokimyasal tahliller göz önüne alındığında, beyin dokusu yapısının bütünlüğünün korunmasını sağlamak için domuz insanca ötenaziye uğradıktan hemen sonra bu adımların gerçekleştirilmesi kritik öneme sahiptir. Teknikleri ilk öğrenirken atlas veya fiber16 diseksiyon kılavuzları kullanmak faydalıdır. Deneycinin veri toplama için örnekler alamadan önce birkaç beyin ekstraksiyonu ve diseksiyonu uygulaması önerilir. En zor adım kafatasının çıkarılmasıdır. Bu adım deneyimle daha kolay hale gelecektir, çünkü kafatasının nerede görüleceğini ve kafatasının ne zaman kesildiğini bilmek için büyük ölçüde ilk elden pratik gerektirir. Bu prosedür, Bassi ve ark.12tarafından açıklanana benzer, ancak altıgen bir kranial pencere oluşturma ihtiyacı gerektirmez ve tekniğin nasıl gerçekleştirildiği hakkında görsel bir öğretici sağlar.
Bu tekniğin bir sınırlaması, yaşlı domuzlarla çalışırken, yaşla birlikte önemli ölçüde kalınlaştığı için kafatasının çıkarılması daha fazla zaman alabilir. Testere kullanmak daha kalın kafatasları için çok zahmetli veya etkisizse, Bjarkam ve ark.13tarafından gösterilen gibi bir çekiç ve keski veya güçlendirilmiş cerrahi ekipman (örneğin, kemik testeresi) kullanmak gerekebilir. Ayrıca, bu teknik her zaman koku ampullerinin yakalanmasını sağlamaz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar, Tarım, Tüketici ve Çevre Bilimleri Bilgi Teknolojisi ve İletişim Hizmetleri Koleji'nden Jim Knoblauch ve Martin-Booth Hodges'ı ses ve video çekme, kaydetme ve düzenleme konusundaki uzmanlıklarından dolayı tanımak istiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #22 Scalpel Blades for #4 Handles | Ted Pella, inc. | 549-4S-22 | |
| 11 1/2" Satterlee Bone Saw | Leica Biosystems | 38DI13425 | |
| 5 1/2" Skull Breaker with Chisel End (Meat Hook) | Leica Biosystems | 38DI37636 | |
| 5-inch Heavy Duty Workshop Bench Vise | Pony | 29050 | |
| Butcher Knife 25cm | Victorinox | 5.7403.25 | Sharpen before use |
| CM40 Light Duty Drop Forged C Clamps | Bessey | 00655BC3120 | |
| Diamond Hone Knife Shaper | Chef’s Choice | 436-3 | |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle #4 | ThermoScientific | 5334 | |
| Tissue Forceps | Henry Schein | 101-5132 | |
| Vinyl Dissecting pad | Carolina | 629006 |
References
- Hughes, H. C.
- Yen, J. Anatomy of the Digestive System and Nutritional Physiology. Biology of the Domestic Pig. , 31-63 (2001).
- Pond, W. G. Of Pigs and People. Swine Nutrition. , 3-24 (2001).
- Odle, J., Lin, X., Jacobi, S. K., Kim, S. W., Stahl, C. H. The Suckling Piglet as an Agrimedical Model for the Study of Pediatric Nutrition and Metabolism. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 419-444 (2014).
- Larsen, M. O., Rolin, B. Use of the Göttingen minipig as a model of diabetes, with special focus on type 1 diabetes research. ILAR Journal. 45 (3), 303-313 (2004).
- Lehmann, H.
- Richer, J., et al. Sacrococcygeal and transsacral epidural anesthesia in the laboratory pig. Surgical Radiologic Anatomy. 20, 431-435 (1998).
- Lind, N. M., et al. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (5), 728-751 (2007).
- Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. -H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
- Dobbing, J., Sands, J.
- Aurich, L. A., et al. Microsurgical training model with nonliving swine head. Alternative for neurosurgical education. Acta Cirurgica Brasileira. 29 (6), 405-409 (2014).
- Bassi, T., Rohrs, E., Fernandez, K., Ornowska, M., Reynolds, C. S. Direct brain excision: An easier method to harvest the pig's brain. Interdisciplinary Neurosurgery. 14, 37-38 (2018).
- Bjarkam, C. R., et al. Exposure of the pig CNS for histological analysis: A manual for decapitation, skull opening, and brain removal. Journal of Visualized Experiments. 122, e55511 (2017).
- Pascalau, R., Szabo, B. Fibre dissection and sectional study of the major porcine cerebral white matter tracts. Anatomia, Histologia, Embryologia. 46, 378-390 (2017).
- McFadden, W. C., et al. Perfusion fixation in brain banking: a systematic review. Acta Neuropathologica Communications. 7, 146 (2019).
- Félix, B., et al.
