Summary
Сфинголипиды являются биологически активными метаболитами с хорошо известной ролью в заболеваниях человека. Характеристика изменений в тканях с помощью масс-спектрометрии может выявить роли в этиологии заболевания или определить терапевтические мишени. Однако OCT-соединение, используемое для криоконсервации в биорепозиториях, мешает масс-спектрометрии. Описаны методы анализа сфинголипидов в тканях человека, встроенных в ОКТ с помощью LC-ESI-MS/MS.
Abstract
Сфинголипиды являются клеточными компонентами, которые имеют хорошо установленную роль в метаболизме и болезнях человека. Масс-спектрометрия может быть использована для определения того, изменяются ли сфинголипиды при заболевании, и для изучения того, могут ли сфинголипиды быть клинически нацелены. Тем не менее, надлежащим образом подготовленные проспективные исследования, которые приобретают ткани непосредственно из хирургического набора, могут быть трудоемкими и технически, логистически и административно сложными. Напротив, ретроспективные исследования могут использовать криоконсервированные человеческие образцы, уже доступные, обычно в больших количествах, в тканевых биорепозиториях. Другие преимущества получения тканей из биорепозиториев включают доступ к информации, связанной с образцами тканей, включая гистологию, патологию и в некоторых случаях клинико-патологические переменные, все из которых могут быть использованы для изучения корреляций с данными липидомики. Однако технические ограничения, связанные с несовместимостью оптимальной температуры резания соединения (ОКТ), используемого в криоконсервации и масс-спектрометрии, являются техническим барьером для анализа липидов. Тем не менее, ранее мы показали, что OCT может быть легко удален из образцов биорепозиториев человека посредством циклов промывки и центрифугирования без изменения их содержания сфинголипидов. Мы также ранее установили, что сфинголипиды в тканях человека, криоконсервированные в ОКТ, стабильны до 16 лет. В этом отчете мы описываем этапы и рабочий процесс анализа сфинголипидов в образцах тканей человека, которые встроены в OCT, включая промывку тканей, взвешивание тканей для нормализации данных, извлечение липидов, подготовку образцов для анализа с помощью жидкостной хроматографии электрораспылительной ионизационной тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS / MS), интеграцию данных масс-спектрометрии, нормализацию данных и анализ данных.
Introduction
Сфинголипиды являются биологически активными метаболитами, известными своей ролью в метаболизме человека и заболеваниях 1,2. Они регулируют сложные клеточные процессы, такие как миграция клеток, выживание и гибель клеток, движение клеток, везикулярный трафик, клеточная инвазия и метастазирование, ангиогенез и производство цитокинов 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Дефекты в регуляции метаболизма сфинголипидов способствуют инициации и прогрессированию рака, определяют, насколько агрессивны раковые заболевания, и как рак реагирует и развивает устойчивость к терапии 3,10. Поэтому из-за этих широких воздействий на этиологию заболевания аналитические методы, которые могут точно установить специфические для заболевания изменения сфинголипидов, являются важными инструментами. Масс-спектрометрия (МС) является наиболее точным и надежным методом анализа изменений сфинголипидов.
Человеческие образцы, которые могут быть использованы для анализа сфинголипидных изменений, могут быть получены перспективно из хирургического набора или ретроспективно из тканевых биорепозиториев. Свежие ткани от операции выгодны, потому что они могут быть непосредственно проанализированы РС или другими аналитическими методами. Тем не менее, приобретение тканей в перспективе имеет административные, технические и логистические препятствия, и сбор достаточного количества образцов для достижения статистической мощности может быть сложной задачей. Получение тканей из биорепозиториев выгодно, потому что они могут быть приобретены ретроспективно, в большом количестве, а биорепозитории подтверждают гистологию и патологию, используют стандартные операционные процедуры для криогенного сохранения и хранения тканей и могут предоставлять клинико-патологические данные, которые могут быть использованы для корреляционного анализа. Однако для сохранения молекулярных и структурных особенностей биорепозитории могут криоконсервировать ткани, встраивая их в соединение оптимальной температуры резания (ОКТ), которое, как мы показали, мешает анализам нормализации данных и количественному определению сфинголипидов с помощью жидкостной хроматографии электрораспылительной ионизационной тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS/MS)11 . Также было показано, что поливиниловый спирт и полиэтиленгликоль, первичные компоненты в соединении OCT, приводят к подавлению ионов в других платформах анализаMS 12,13,14,15. Поэтому соединение OCT должно быть удалено из тканей перед сфинголипидомическим анализом РС.
В предыдущем отчете мы подтвердили протокол удаления соединения OCT из образцов человека для анализа LC-ESI-MS/MS11 и методологию, используемую для взвешивания тканей для нормализации данных11. Здесь мы подробно описываем этапы протокола удаления соединений sphingolipidomic OCT (sOCTrP) и показываем репрезентативные данные опухолей аденокарциномы легких человека и нормальных прилегающих невовлеченных тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Деидентифицированные легочные ткани человека были получены из Университета Содружества Вирджинии (VCU) Tissue and Data Acquisition and Analysis Core в соответствии с протоколом (#HM2471), утвержденным внутренним наблюдательным советом (IRB). Использование мышей для исследования и сбора тканей мышей было одобрено институциональным комитетом по уходу и использованию животных VCU (IACUC).
1. Подготовка материалов
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги должны быть выполнены за день до промывания тканей.
- Предварительно маркировать и взвешивать 1,5 мл полипропиленовых центрифужных трубок с краткими, но четкими идентификационными кодами для каждого образца, который будет обработан на следующий день. Используйте химически стойкий перманентный маркер (см. Таблицу материалов), который не исчезнет при повторной обработке трубы.
- Откройте электронную таблицу и пометьте последовательные столбцы со следующими заголовками столбцов: идентификатор трубки (ID), только трубка, трубка с тканью и общая ткань. Введите идентификаторы трубок, которые будут обработаны, в столбец с маркировкой идентификатор трубки.
- Предварительная калибровка и обнуление аналитической шкалы. Поместите чистую колбу Эрленмейера объемом 10 мл в центр балансировочной пластины (колба будет действовать как держатель трубки). Закройте дверцу весовой камеры и обведите колбой весы.
- Вес 1,5 мл центрифужных трубок. Осторожно поместите трубку в колбу и закройте дверцу весовой камеры. Дайте весу стабилизироваться и запишите вес только в колонке, помеченной трубкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте перемещения колбы Эрленмейера объемом 10 мл при взвешивании трубок. Если колба перемещена, перецентрируйте колбу и снова снимите баланс. Поместите закрытые трубки в стеллаж и храните до тех пор, пока это не понадобится. - Предварительно этикетируйте стеклянные трубки и колпачки с винтовым верхом 13 х 100 мм с идентификационными кодами и заполняйте их 2 мл метанола марки LC-MS. Поместите их в стойку для трубок, закройте трубки крышкой и храните в холодильнике (4 °C) до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте дозатор растворителя для бутылок (см. Таблицу материалов). Если один из них недоступен, используйте стеклянные пипетки, чтобы избежать использования пластмасс при дозировании органических растворителей. - Предмаркировочные стеклянные пробирки 13 x 100 мм. Накройте крышкой и храните пробирки при комнатной температуре.
- Флаконы с автоинжектором предварительной маркировки с идентификационными кодами. Накройте крышкой и храните флаконы с автоинжектором при комнатной температуре до использования.
- Приготовьте фитили для сушки тканей.
- Начните с чистки хирургических ножниц, погрузив их в метанол класса LC-MS на 5 минут, а затем протрите их чистой лабораторной тканью.
- Используя перчатки без порошка, закрутите конец ткани лабораторного сорта (см. Таблицу материалов) до образования мелкоконечного фитиля диаметром 30-40 мм.
- С помощью ножниц, очищенных метанолом, вырежьте фитиль на толстом конце. Поместите фитили в чистую картонную коробку. Сделайте вдвое больше фитилей, чем потребуется для обработки всех образцов.
- Подготовьте укороченные наконечники пипетки объемом 1 мл. С помощью хирургических ножниц, очищенных метанолом, отрежьте 4-5 мм от наконечника пипетки объемом 1 мл и поместите наконечник обратно в держатель наконечника. Подготовьте в два раза больше подсказок, чем образцов для обработки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Они будут использоваться при извлечении промытых тканей из трубок. Не прикасайтесь к концу наконечника. - Предварительный прохлад молекулярной биологии сорт фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) до 4 °C (достаточно 0,5 л). Это будет использоваться для извлечения образцов. Для каждого образца, который будет обработан, предварительно охладите (4 °C) 60 мл сверхчистой деионизированной воды.
- Подготовка внутренних стандартов масс-спектрометрии. Растворяют следующие липиды в этаноле:метанол:вода (7:2:1; v/v/v) в концентрации 25 нмоль/мл: d17:1-сфингозин, (2S,3R,4E)-2-аминогептадек-4-ен-1,3-диол; d17:1-сфингозин-1-фосфат, гептадекасфинг-4-энин-1-фосфат; C12-керамид (d18:1/C12:0), N-(додеканоил)-сфинг-4-энин; C12-сфингомиелин (d18:1/C12:0), N-(додеканоил)-сфинг-4-энин-1-фосфохолин; C12-глюкозилцерамид (d18:1/C12:0), N-(додеканоил)-1-β-глюкозил-сфинг-4-эйн; C12-лактозилцерамид (d18:1/C12:0), N-(додеканоил)-1-ß-лактозил-сфинг-4-ен.
2. Промывка тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение всех шагов в разделе 1 за один день до этого позволяет квалифицированному исследователю обрабатывать до 40 образцов в день, а новичкам ~ 10-15 образцов в день. Начинайте рано утром и не останавливайтесь, пока не будут завершены все шаги в разделах 2.1-3.8.
- В день, когда ткани будут обработаны, подготовьте рабочую зону шкафа биобезопасности, оснастив ее вихрем, полностью заряженным серологическим пипеттором и лотком для льда. Для всех этапов в этом разделе надевайте соответствующие СИЗ, включая лабораторный халат, двойной слой перчаток и защитные очки. ВНИМАНИЕ: Человеческие ткани и жидкости следует рассматривать и рассматривать как биологически опасные материалы.
- Предварительное охлаждение (4 °C) центрифуги с качающимся ковшом, любые адаптеры, необходимые для хранения конических центрифужных трубок объемом 15 мл, и крышки биоконтейнмента центрифуги. Предварительное охлаждение (4 °C) центрифуга с фиксированным углом, способная удерживать 1,5 мл центрифужных трубок.
- Если ткани не распределены в 15 мл полипропиленовых центрифужных пробирок, используйте очищенный метанолом шпатель (чистый для каждого нового образца ткани), чтобы перенести их в предварительно маркированные полипропиленовые трубки объемом 15 мл. Также нанесите маркировку на колпачки объемом 15 мл.
- Поместите трубчатую стойку, способную удерживать трубки центрифуги объемом 15 мл, в лоток для льда и наполните лоток льдом. Оттаивайте ткани, которые будут обработаны в этот день, поместив их в стойку на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимум 3-4 мг ткани должно быть запрошено из биорепозитория для обработки, поскольку ранее было показано, что протоколы промывания и взвешивания тканей являются точными и надежными при этих весах11.
- Поместите трубчатую стойку, способную удерживать трубки центрифуги объемом 15 мл, в лоток для льда и наполните лоток льдом. Оттаивайте ткани, которые будут обработаны в этот день, поместив их в стойку на льду.
- Переместите лоток для льда с образцами в шкаф биобезопасности.
- Выполните три цикла sOCTrP11 , как описано ниже (т.е. выполните шаги 2.5.1-2.5.5 три раза).
- Добавьте 10 мл ледяной сверхчистой деионизированной воды в каждую трубку и плотно закрывайте их крышкой. Дайте пробиркам инкубироваться в течение 10 минут.
- Энергично вихрьте каждую трубку в течение 10-20 с или до тех пор, пока вся ткань, нанесенная на стенки трубки, или тканевая гранула, не будет полностью повторно суспендирована.
ПРИМЕЧАНИЕ: В циклах sOCTrP 2-3 крайне важно, чтобы гранула была повторно суспендирована таким образом, чтобы любой ОКТ в грануле был разбавлен в промывочном растворе. - Переложите трубки в предварительно охлажденную (4 °C) центрифугу с качающимся ковшом. Образцы центрифуг при 4000-5000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования и воздействия биоопасных аэрозолей, образующихся во время центрифугирования, путем герметизации носителей центрифуг крышкой биоконтейнмента (см. Таблицу материалов). - Извлеките образцы из центрифуги и перенесите в лоток для льда. Поместите лоток в шкаф для биобезопасности и расстегните трубки. Сохраните колпачки.
- Осторожно аспирируйте раствор для мытья. Избегайте аспирации тканевого материала в грануле, оставляя ~ 0,5 мл супернатанта в пробирке. Закройте трубки крышками и избегайте перекрестного загрязнения, сопоставляя меченые колпачки с трубками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Моющий раствор (супернатант) на этапе 2.5.5 представляет собой биологически опасный материал; обрабатывать и утилизировать его в соответствии с руководящими принципами биобезопасности, подходящими для образцов человеческого происхождения.
3. Взвешивание тканей (для нормализации данных)
- После последнего цикла промывки sOCTrP тщательно аспирируйте большую часть моющего раствора, но не нарушайте гранулу. Оставьте ~0,5 мл промывочного раствора в пробирке.
- Используя укороченные наконечники пипетки (подготовленные на этапе 1.9), возьмите 500 мкл ледяного PBS и добавьте его в трубку.
- Используя тот же наконечник, аккуратно повторно суспендируйте гранулу и извлеките всю ткань. Избегайте турбулентного пипетирования, чтобы уменьшить потерю ткани за счет ее прикрепления к стенкам трубки и наконечника пипетки.
- Добавьте повторно суспендированную ткань в соответствующую предварительно маркированную и предварительно взвешенную трубку центрифуги объемом 1,5 мл и поместите трубку на лед. Повторите для всех тканей в наборе данных.
- Поместите пробирки объемом 1,5 мл в предварительно охлажденную центрифугу и гранулируйте ткани при 7000 х г в течение 5-7 мин и 4 °C.
- Извлеките трубки и тщательно аспирируйте как можно больше PBS, не нарушая гранулы. Поместите трубку обратно на лед.
- Центрифужные трубки в течение дополнительных 3 мин при 7000 х г для обеспечения хорошего гранулирования тканей. Переложите трубки на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная стадия центрифугирования важна для предотвращения потери тканей при удалении всего промывочного раствора и впитывания. При обработке более пяти образцов повторите стадию центрифугирования 3 мин 7000 х г после обработки каждого пятого образца, чтобы обеспечить гранулирование тканей. - Используя фитили, приготовленные на этапе 1.8, аккуратно удалите оставшийся раствор для мытья. Используйте чистый фитиль для каждого образца. Допустимо аккуратно смазать ткань фитилем, который поможет удалить большую часть моющего раствора, но избежать потери какой-либо ткани при прилипании к фитилю. Закройте трубку и поместите ее на лед.
- Взвесьте каждую трубку в недавно откалиброванных, смолистых и обнуленных аналитических весах.
- Поместите каждую трубку в стеклянную колбу Erlenmeyer и закройте дверцу камеры. Когда вес стабилизируется, запишите его в колонку электронной таблицы, помеченную трубкой с тканью.
- После взвешивания поместите трубку обратно на лед.
- Добавьте 300 мкл ледяного PBS. Используя укороченный наконечник пипетки (этап 1.9), осторожно извлеките всю ткань и нанесите в предварительно маркированную стеклянную трубку с винтовым верхом (подготовленную на этапе 1.5), содержащую 2 мл ледяного метанола класса LC-MS (добавьте ткань к метанолу, а не к боковой части трубки).
- Рассчитайте количество ткани, которая была промыта, вычитая только трубку из трубки со значением ткани. Запишите это число в столбец общей ткани. Общее значение ткани будет использоваться для нормализации данных масс-спектрометрии на шаге 6.12.
- Храните образцы при температуре -80 °C до готовности к выполнению шагов 4.1-4.15.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это хорошая остановка, и образцы могут безопасно храниться в течение нескольких недель при -80 °C. Для других методов нормализации тканей, таких как концентрация белка или содержание липидного фосфата, обратитесь к Rohrbach et al.11.
4. Экстракция липидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно начинать эти шаги утром, особенно когда будет обработано много образцов. Перед началом работы предварительно нагрейте водяную баню или инкубатор до 48 °C.
- Извлеките образцы, подготовленные на этапе 3.8, и стандарты липидов MS (подготовленные на этапе 1.11) из морозильной камеры. Дайте им уравновеситься до комнатной температуры в течение 20 мин.
- Вихрь и погружение внутреннего стандартного раствора в ультразвуковую водяную баню (см. Таблицу материалов) на 2-3 мин или до полного растворения липидных эталонов MS перед дозированием в образцы. Это позволит избежать ошибок при нормализации данных.
- Используя повторяющуюся пипетку, добавляют 250 пмоль (10 мкл из раствора 25 нмоль/мл, приготовленного на стадии 1.11) внутренних стандартов масс-спектрометрии в каждую трубку. Слегка обложите трубки.
- Для облегчения гомогенизации отрегулируйте объем метанола до 2 мл. Используйте только метанол марки LC-MS/MS.
- Работая по одной трубке за раз, используйте гомогенизатор для тритурации ткани до тех пор, пока не будут видны сгустки (обычно 5-20 с). Переместите наконечник гомогенизатора круговыми движениями и осторожно прижмитесь к стенке трубки, чтобы облегчить тритурацию. Снова закройте трубку крышкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечение того, чтобы все ткани были тонко тритурированы, максимизирует извлечение липидов. Не добавляйте хлороформ в образцы перед гомогенизацией, так как одноразовые наконечники гомогенизатора изготовлены из пластика, который растворится в растворах, содержащих хлороформ. - Погружайте трубку под углом 45° в ультразвуковую водяную баню на 5-10 с.
- Если при погружении в ультразвуковую ванну не образуются сгустки ткани, закройте ее крышкой и перейдите к следующей трубке.
- Если сгустки тканей образуются, когда трубка погружается в ультразвуковую ванну, повторно гомогенизируйте и нацеливайтесь на сгустки.
- Повторяйте этот процесс (гомогенизация/погружение в ультразвуковую ванну) итеративно до тех пор, пока не будут разрушены все крупные сгустки тканей.
- В вытяжке добавьте хлороформ и метанол LC-MS в каждую трубку (используйте верхний дозатор для бутылок), чтобы достичь соотношения 2:1:0,1 метанол:хлороформ:вода. Используя чистые колпачки, плотно запечатайте трубки и оставьте на столешнице до конца дня.
- Для тканей массой 50 мг или менее используйте общий объем экстракции 4 мл и регулируйте с помощью этого соотношения (50 мг: 4 мл экстракционного раствора) для более крупных образцов.
- Перед выходом вечером поместите плотно закрытые трубки в водяную баню или инкубатор с температурой 48 °C и высиживайте их на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы трубки были плотно закрыты, чтобы соотношение растворителей не изменялось из-за испарения. - На следующее утро извлеките образцы с водяной бани с температурой 48 °C и гранулируйте любой нерастворимый в растворителе мусор путем центрифугирования при 4000-5000 х г при 4 °C в течение 20 мин.
- Работая в вытяжке, тщательно декантируйте супернатант в предварительно маркированные 13 x 100 мм боросиликатные стеклянные пробирки. Наклоните трубку размером 13 x 100 мм под углом 30-45° для облегчения декантирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: При обработке более 12 образцов не допускайте, чтобы центрифугированные трубки сидели в течение длительных периодов времени, так как гранулы будут размягчаться и нерастворимый мусор будет перенесен при выполнении этапа 4.10. Чтобы избежать этого, вынимайте только 12 трубок из центрифуги за раз и продолжайте центрифугировать другие трубки, пока вы не будете готовы их декантировать. - Перенесите трубки в вакуумный концентратор, способный удерживать трубки размером 13 x 100 мм. Испарите весь растворитель с начальным шагом нагрева 1 ч (40 °C) и работайте под максимальным вакуумом.
- Извлеките трубки из вакуумного концентратора и добавьте 500 мкл метанола марки LC-MS (используйте верхний дозатор для бутылок) в каждую трубку.
- Повторно суспендируют высушенные липидные экстракты путем вихря в течение 5-10 с с последующим погружением трубок под углом 45° в ультразвуковую водяную баню на 2 мин при вращении трубки. Повторно вихрь на 5 с и погружение в ультразвуковую водяную баню на дополнительную минуту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это критический шаг для обеспечения максимального восстановления экстрагированных липидов. Не двигайтесь вперед, пока весь высушенный материал на стенке трубки не будет повторно суспендирован. - Поместите трубки размером 13 x 100 мм в предварительно охлажденную (4 °C) центрифугу и удалите нерастворимый мусор центрифугированием при 4000-5000 х г при 4 °C в течение 20-30 мин.
- Тщательно декантируйте осветленный супернатант в предварительно маркированный флакон автоинжектора. Наклон флакона автоинжектора под углом 30-45° облегчит декантирование. Убедитесь, что все содержимое трубки размером 13 x 100 мм декантировано во флакон автозагрузчика.
- Плотно закройте трубки и храните трубки при -80 °C до анализа LC-ESI-MS/MS.
5. Анализ LC-ESI-MS/MS
ПРИМЕЧАНИЕ: В следующей процедуре используется двоичная насосная система, соединенная с автоинжектором, дегазатором и системой LC-MS/MS, работающей в трехквадрупольном режиме. Температуру колонны поддерживали с помощью колонной печи. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации об используемом оборудовании.
- Подготовьте подвижную фазу A1 (CH3OH:H2O:HCOOH, 58:41:1, v:v:v, с формитом аммония 5 мМ) и подвижную фазу B1 (CH3OH:HCOOH, 99:1, v:v, с формиатом аммония 5 мМ). Используйте только растворители класса LC-MS, воду и реагенты.
- Для каждого набора образцов подготовьте четыре заготовительных флакона, содержащих 500 мкл метанола марки LC-MS.
- Для каждого набора образцов готовят два внутренних стандартных (этикетка как IS) флакона автозагрузчика путем разбавления 10 мкл (всего 250 пмоль в каждом стандарте) внутреннего стандартного раствора, приготовленного на стадии 1.11 в 500 мкл метанола марки LC-MS.
- Установите температуру колонной печи на уровне 60 °C, а температуру источника ионов на 500 °C.
- Для анализа MS/MS используйте трехквадрупольный режим спектрометра. Установите первый квадруполь (Q1) для прохождения ионов-предшественников, в то время как третий квадруполь (Q3) для прохождения молекулярно отличительных ионов продукта (или сканирование через несколько m/z в Q1 или Q3), используя N2 для коллизионного индуцирования диссоциаций в квадруполе 2 (Q2), который смещен от Q1 на 30-120 эВ.
- Установите окно обнаружения нескольких пар мониторинга реакций (MRM) на 120 с с целевым временем сканирования 1,0 с. В таблице 1 приведен список пар МИМ, энергий ионизации и энергий столкновений.
- Используйте следующие параметры для разрешения сфинголипидов на стадии LC: используя скорость потока 0,7 мл/мин, уравновешивайте столбец обратной фазы C18 размером 2,1 (т.д.) x 50 мм в течение 0,5 мин смесью растворителей 95% подвижной фазы A1 и 5% подвижной фазы B1.
- После инъекции образца поддерживайте соотношение подвижной фазы A1/B1 на уровне 95/5 в течение 2,25 мин с последующим линейным градиентом до 100% B1 в течение 1,5 мин, который затем удерживают при 100% B1 в течение 5,5 мин с последующим возвратом градиента до 95/5 A1/B1.
- После прогона повторно уравновешивают колонну смесью 95/5 А1/В1 в течение 0,5 мин.
- Используйте следующие настройки для автозагрузчика образцов: объем промывки, 500 мкл; ход иглы, 52 мм (это должно быть отрегулировано в зависимости от размера флакона и объема в каждом флаконе); скорость промывки, 35 мкл/с; скорость дискретизации, 5,0 мкл/с; время погружения промывки, 2 с; режим полоскания, до и после аспирации; время промывки,2 с.
- Поместите образцы, подготовленные на этапе 4.15, в лоток автозагрузчика в следующем порядке: Пустой; ЕСТЬ; Пустой; Образцы, подготовленные на этапе 4.15; Пустой, IS, Пустой.
- Анализируйте 5-10 мкл каждого образца с помощью LC-ESI-MS/MS. Анализируйте один и тот же объем для всех образцов в наборе данных.
6. Обработка, интеграция и нормализация данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя следующие шаги описывают процедуру для конкретного программного обеспечения (см. Таблицу материалов), аналогичные процедуры на эквивалентных приборах и программном обеспечении LC-MS могут быть использованы для интеграции пар MRM для анализируемых классов липидов и соответствующих внутренних стандартов.
- Откройте программное обеспечение для количественного определения. На вкладке Quantitate дважды щелкните мастер quantitation. Во всплывающем окне в крайней левой рабочей области перейдите к нужному набору данных и щелкните его левой кнопкой мыши. Доступные образцы будут показаны в средней рабочей области.
- Выделите анализируемые образцы, а затем щелкните стрелку вправо, чтобы добавить образцы в рабочую область Выбранные образцы . Нажмите кнопку Далее , чтобы перейти к экрану настроек и запросов, где обычно используются параметры по умолчанию.
- Нажмите Далее , чтобы перейти к экрану выбора метода интеграции. Выберите подходящий метод интеграции, содержащий пары переходов MRM для анализируемых липидов. Пары переходов управления записями сообщений приведены в таблице 1 . Нажмите «Финиш».
ПРИМЕЧАНИЕ: Время хранения зависит от приборов и индивидуальных настроек и поэтому должно быть проверено для каждой отдельной установки. - На панели навигации щелкните панель Пиковый обзор , чтобы можно было проверить пары управления записями сообщений. Чтобы упростить просмотр, щелкните правой кнопкой мыши панель «Обзор пиков », измените автоматическое масштабирование на 100% от наибольшего пика и окно масштабирования 1,00 - 2,00 минуты.
- Щелкните правой кнопкой мыши на окне Quantitation Display и выберите Analyte и нужный sphingolipid для изучения. Убедитесь, что в образцах Blank нет пиков и что правильный пик интегрирован в образцы IS.
- Начните интеграцию неизвестных образцов. Работая по одному классу sphingolipid за раз, проверяйте время удержания пары MRM внутреннего стандарта (т.е. C12:0). ceramide) и убедитесь, что программное обеспечение интегрировало правильный пик.
- Продолжайте переходить к аналитам того же класса липидов (т.е. C14:0) керамид, C16:0-керамид и др.), начиная с самого короткого липида длины цепи в классе. Убедитесь, что для каждого липида длиной цепочки программная процедура интегрировала правильный пик пары управления записями сообщений.
- Когда все аналиты будут интегрированы, создайте электронную таблицу для каждого анализируемого вида сфинголипидов (например, керамиды, сфингомиелины и т. Д.). Заголовки столбцов меток соответствуют порядку анализируемых веществ и длине цепи в программном обеспечении для количественного определения LC-MS/MS. Также включите заголовок столбца для идентификатора образца и весов нормализации образца, определенных на шаге 3.9.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как описано ранее11, другие общие меры нормализации включают общее содержание липидфосфата или количество белка. - Экспортируйте или скопируйте пиковые области для всех анализируемых веществ и внутренних стандартов в электронную таблицу.
- Нормализуйте данные, разделив интегрированную пиковую площадь каждого вида длиной цепи для данного класса сфинголипидов на пиковую площадь соответствующего ему внутреннего стандарта. Например, C14:0 керамид, C16:0 керамид, церамид C18:1 и т.д. должны быть разделены на C12:0 керамидная внутренняя стандартная пиковая область.
- Преобразование пиковой площади в моли восстановленного липида путем умножения нормализованной пиковой площади (рассчитанной на шаге 6.10) на количество внутреннего стандарта в пикомоле, которое было добавлено к образцу на этапе 4.3. В этом протоколе это количество составляет 250 пмоль.
- Чтобы получить относительное количество липидов в каждом образце, разделите пикомолы длины каждой липидной цепи на вес ткани, определенный на этапе 3.9. Это даст единицы пикомолей липидов на мг ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом протоколе мы подробно описываем метод удаления ОКТ из крио-сохраненных тканей человека и взвешиваем ткани для анализа LC-ESI-MS/MS. Материалы, необходимые для этой процедуры, перечислены в Таблице материалов. На рисунке 1 показаны результаты типичного эксперимента, в котором 10 опухолей аденокарциномы легкого человека и 10 нормальных соседних тканей были промыты для удаления ОКТ и проанализированы LC-ESI-MS / MS. Важно отметить, что, как мы ранее показали11, существуют различные виды керамидов с длиной цепи (рисунок 1A) и моногексозил-керамидов (рисунок 1B), которые значительно повышены в опухолях аденокарциномы легких по сравнению с нормальными соседними невовлеченными тканями.
В контрольных экспериментах по оценке влияния ОКТ на стадии экстракции липидов, описанные в разделе 4, 200 мг печени мышей (C57BL6; самцы; 14-16 недель) повторно суспендировали в 2 мл фосфатного буферного физиологического раствора и гомогенизировали до мелкого тритурирования. Полученную тонкую суспензию печени затем интенсивно обрабатывали ультразвуком с помощью зондового ультразвукового аппарата (три раунда по 1 мин обработки ультразвуком на льду, 1 мин отдыха на льду, мощность 60%; микроконфор). Из этого раствора были приготовлены шесть 300 мкл печеночно-гомогенатных реплик. К трем репликатам добавляли 200 мг ОКТ (среднее количество, обнаруженное в образцах биорепозиториев11), а к трем другим добавляли 200 мкл воды. Затем образцы обрабатывались параллельно в соответствии с этапами, описанными в разделе 4. Важно отметить, что после центрифугирования однофазного раствора Bligh-Dryer образцы, содержащие OCT, были мутными, тогда как контрольные образцы, содержащие воду, были прозрачными (рисунок 2A). Помутнение в однофазном растворе для экстракции липидов сохранялось даже после повышенного центрифугирования и обширной обработки ультразвуком (не показано). После того, как растворитель испарялся, образцы, содержащие ОКТ, имели большие гранулы (рисунок 2B), которые не могли быть восстановлены в метаноле даже при энергичном вихре и обширной обработке ультразвуком. Образцы, содержащие ОКТ, также показали большую потерю сигнала для внутренних стандартов всех проанализированных видов (рисунок 3A-G). Мы также ранее показали, что образцы, содержащие ОКТ, показали потерю сигнала для многих из проанализированных сфинголипидов11.
Как правило, ожидается, что стандарты сфинголипидов будут элюировать последовательно, как показано на рисунке 4, в следующем порядке: d17:1 сфингозин, d17:1 сфингозин-1-фосфат, C12:0 лактозил-керамид, C12:0 моногексозил-керамид, C12:0 сфингомиелин и C12:0 керамид. Для каждого из этих видов сфинголипидов, используя настройки градиента и приборов, описанные в разделе 5 и ранее11, время удержания будет приблизительно +0,15 мин для каждого 2-углеродного увеличения длины цепи. Например, как показано на рисунке 5, C14:0-керамид (рисунок 5B) элюируется примерно на +0,15 мин позже, чем C12:0-керамид (рисунок 5A). Двойная связь в жирной кислоте часто приводит к сдвигу времени удержания на -0,15, поэтому C16:0-керамид (рисунок 5C) будет иметь время удержания, аналогичное C18:1-керамиду (рисунок 5D). Однако более длинные липиды длиной цепи (т.е. C24:0, C26:0) могут иметь большие сдвиги времени удержания (рисунок 5I,K, соответственно).
Рисунок 1: Сфинголипидные профили аденокарцином легких и прилегающих невовлеченных тканей легких. Ткани были криогенно сохранены в ОКТ, разморожены, обработаны тремя циклами sOCTrP, взвешены и проанализированы LC-ESI-MS / MS. Уровни находятся в пмоле на мг ткани. Указанные виды церамида (А), моногексозилцерамида (В), сфингомиелина (С), лактозилцерамида (D) и сфингозина (Е; Sph), сфингозин-1-фопшат (F; S1P), дигидро-Sph (E) и дигидро-S1P (F) были количественно определены. n = 10 опухолей и n = 10 смежных невовлеченных тканей. Прямоугольные графики показывают медианы (черная линия) и усы от min до max. ns, не значимые; , с≤0.005; , стр ≤ 0,0005. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные изображения извлеченных образцов с ОКТ и без него. Печень мышей гомогенизировали и обрабатывали ультразвуком, разделили на шесть одинаковых образцов: 200 мг ОКТ добавляли в три образца, а воду в остальные три. А) После добавления метанола и хлороформа для достижения соотношения 2:1:0,1 метанол:хлороформ:вода (v:v:v), ночной инкубации при 48°С с последующим центрифугированием супернатанты образцов, содержащих ОКТ, были мутными и не могли быть очищены ультразвуком, вихрем или центрифугированием. (B) После испарения растворителя из образцов, содержащих ОКТ, которые не могли быть полностью восстановлены в 0,5 мл метанола после интенсивной обработки ультразвуком и вихрей, извлечена крупная гранула. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Количественная оценка стандартов сфинголипидов LC-ESI-MS/MS при наличии или отсутствии OCT. Печень мышей гомогенизировали, обрабатывали ультразвуком и разделили на шесть одинаковых образцов. К трем из шести образцов добавляли 200 мг ОКТ, а к трем другим добавляли воду. После добавления внутренних стандартов, метанола и хлороформа образцы обрабатывали идентично, а извлеченные липиды анализировали с помощью LC-ESI-MS/MS. Показаны пары множественного мониторинга реакций (MRM) указанных липидов (A-F) и соответствующие интегрированные пиковые области (G). Сокращения: Sph, сфингозин; S1P, сфингозин-1-фосфат. Черные стрелки указывают на правильную пару MRM для указанного сфинголипида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Относительное время удержания для пар мониторинга множественных реакций LC-ESI-MS/MS стандартов сфинголипидов. Печень мышей гомогенизировалась и обрабатывалась ультразвуком; добавлены внутренние стандарты, метанол и хлороформ; и липиды, извлеченные и проанализированные LC-ESI-MS/MS. Показано время удержания нескольких пар мониторинга реакции указанных липидов (A-F). Обратите внимание на относительный порядок, в котором липиды элюируются во время градиента жидкостной хроматографии. Сокращения: Sph, сфингозин; S1P, сфингозин-1-фосфат; СМ, сфингомиелин. Ось X — это время удержания пары управления записями сообщений в минутах. Ось Y — это интенсивность сигнала для пар управления записями сообщений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Сдвиг времени удержания пар LC-ESI-MS/MS MRM, зависящий от длины ациловой цепи. Печень мышей гомогенизировалась и обрабатывалась ультразвуком; добавлены внутренние стандарты, метанол и хлороформ; и липиды, извлеченные и проанализированные LC-ESI-MS/MS. Показаны время удержания и пары MRM указанных липидов. Обратите внимание на сдвиг времени удержания с увеличением длины ациловой цепи для различных липидов (A-K), что обычно соответствует +0,15 мин времени удержания на 2-углеродное увеличение. Двойная связь приведет к сдвигу времени удержания -0,15 мин (D, H, J). Однако для липидов с более длинной цепью относительное увеличение времени удержания может быть более длительным (G-K). Ось X — это время удержания пары управления записями сообщений в минутах. Ось Y — это интенсивность сигнала для пар управления записями сообщений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Пары МРМ, параметры ионизации и энергии столкновения для анализа LC-ESI-MS/MS. DP, потенциал декастеризации; CE, энергия столкновения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ОКТ является распространенным долгосрочным криосохраняющим агентом, используемым в биорепозиториях. Однако ОКТ может привести к подавлению ионов, когда ткани анализируются различными масс-спектрометрическими платформами 12,13,14,15, или привести к потере сигнала, когда образцы анализируются LC-ESI-MS/MS11. OCT в криоконсервированных тканях также может мешать методам нормализации тканей, таким как взвешивание и количественные анализы белка, такие как Bradford и BCA11. Здесь мы представляем подробный протокол удаления ОКТ из тканей человека и последующего анализа масс-спектрометрией. Протокол может быть модифицирован для использования других тканевых источников, которые не являются легкими, или из тканей мышей, как мы ранее описали11. Кроме того, могут быть использованы и другие стратегии нормализации данных масс-спектрометрии, в том числе описанныенами ранее 11, а также другие валидированные методы.
Важным ограничением этого протокола является то, что он не адекватен для анализа тканей, которые ранее были зафиксированы формальдегидом или другим фиксирующим агентом. Он адекватен только для тканей, которые не были зафиксированы и были криоконсервированы в ОКТ. Кроме того, этот метод не подходит для обработки тканей, которые весят менее 1-2 мг, так как всегда есть некоторая потеря тканей во время этапов sOCTrP и переносов между трубками. Будет трудно взвесить такие мелкие ткани с помощью стандартных аналитических весов, и любой оставшийся PBS, не удаленный на стадии впитывания, внесет большой вклад в экспериментальную ошибку. Ниже приведены другие важные соображения при мытье тканей для удаления ОКТ с помощью этого метода.
Для обеспечения беспрепятственного выполнения этого протокола, особенно если будет обработано много образцов, этапы, описанные в разделе 1, должны быть выполнены заранее, включая предварительную маркировку и предварительное взвешивание трубок объемом 1,5 мл, предварительную маркировку трубок и колпачков с винтовыми колпачками 13 x 100 мм, пробирки для культивирования 13 x 100 мм и флаконы с автоинжектором, подготовку всех фитилей, предварительное укорочение наконечников пипеток 1 мл, и растворы для промывки перед охлаждением. Это предотвратит трудоемкие процедуры, которые должны быть выполнены в день, когда ткани будут промыты, что может привести к задержкам. В целом, мы обнаруживаем, что если многие из этих шагов выполняются накануне, опытный исследователь может вымыть 30-40 образцов в обычный рабочий день. Однако, поскольку первая предлагаемая точка остановки после того, как все ткани были промыты, взвешены и помещены в метанол и сохранены при -80 ° C, невыполнение предварительного взвешивания и маркировки 1,5 мл заранее повлияет на эффективность и увеличит продолжительность времени, необходимого для промывки 30-40 тканей.
Взвешивание тканей является одним из наиболее важных шагов, поскольку ошибки или небрежность будут влиять на качество данных, поскольку они будут перенесены на нормализацию данных. Крайне важно, чтобы аналитические весы, используемые для взвешивания, были откалиброваны, правильно обнулены и запорожены. Соответственно, при использовании фитилей важно удалить как можно больше моющего раствора, особенно для тканей весом менее 5 мг. При этих весах тканей оставшийся раствор для промывки сделает взвешивание неточным на большой процент и перенесет его как ошибку в нормализации данных. При удалении моющего раствора мы обнаруживаем, что ткани можно осторожно касаться фитилем в течение нескольких секунд, чтобы удалить как можно больше моющего раствора, не приводя к значительным потерям ткани путем прилипания к фитилю. Тем не менее, каждый тип промываемой ткани должен быть проверен на адгезию к фитилям, и эти шаги в протоколе скорректированы соответствующим образом.
Для облегчения процесса промывания тканей рекомендуется запрашивать тканевую стружку из биорепозитория в полипропиленовых трубках объемом 15 мл. Это уменьшит обработку тканей перед стиркой.
При промывке тканей, если гелеобразный материал наблюдается на дне трубки после третьего цикла sOCTrP, это свидетельствует о том, что не все OCT были удалены и необходимы дополнительные циклы sOCTrP. Отслеживайте, сколько циклов необходимо, и для обеспечения согласованности выполняйте одинаковое количество циклов sOCTrP во всех образцах в наборе данных. Ранее мы оценили до 9 циклов sOCTrP и не обнаружили влияния на истощение сфинголипидов в тканях11.
При использовании фитилей для удаления моющего раствора, аккуратное смазывание ткани гарантирует, что весь моющий раствор будет удален. Это повышает точность оценки веса ткани. Тем не менее, большую осторожность следует соблюдать с очень маленькими тканями, так как они могут прилипнуть к фитилю и привести к потере образца. Полезно использовать несколько фитилей для одной и той же трубки, чтобы удалить как можно больше раствора. Чтобы предотвратить перекрестное загрязнение образца, всегда используйте новый и чистый фитиль для каждого образца. При изготовлении фитилей используйте ткани лабораторного класса (см. Таблицу материалов), поскольку мы ранее тестировали их и обнаружили, что они содержат незначительное количество загрязняющих сфинголипидов11. Фитили из других материалов могут быть использованы, если они протестированы, как описано11.
При извлечении образцов из пробирок объемом 1,5 мл после взвешивания крайне важно, чтобы вся ткань была восстановлена. В противном случае это приведет к ошибкам в нормализации данных. Если для восстановления всей ткани требуется больше PBS, добавьте эквивалентное количество PBS, используемое ко всем другим пробиркам, чтобы избежать различий в эффективности экстракции, которые могут возникнуть в результате образцов, содержащих различные количества PBS. Отрегулируйте объемы хлороформа и метанола с учетом любого увеличения объема воды для поддержания соотношения метанол:хлороформ:вода 2:1:0,1.
При размораживании образцов важно, чтобы этот шаг был сделан на льду, чтобы избежать деградации лабильных липидов, таких как сфингозин-1-фосфат. Полное размораживание образцов до тех пор, пока OCT не перейдет в жидкое состояние, также облегчит его удаление, поскольку его будет легче растворять в холодном моющем растворе, а не оставаться в виде гранул на ранних этапах промывки.
Иногда, особенно при промывании легочных тканей, будут появляться фрагменты, которые не будут гранулироваться и будут плавать поверх промывного раствора после центрифугирования. С осторожностью погружение аспирационного наконечника под плавающие ткани для удаления моющего раствора может предотвратить потерю во время аспирации.
Не добавляйте хлороформ в образцы перед гомогенизацией, так как одноразовые наконечники гомогенизатора изготовлены из пластика и растворяются в растворах, содержащих хлороформ. Это может значительно повлиять на количественную оценку липидов LC-MS/MS в образцах. Поэтому, в целом, следует избегать использования пластмасс, не устойчивых к растворителям, при дозировании хлороформа и метанола. Эти растворители также токсичны и должны обрабатываться в соответствующем вытяжном шкафу. Изнашивайте соответствующие СИЗ при обращении с растворителями, такими как метанол и хлороформ.
Ткани человека должны обрабатываться в соответствующем шкафу биобезопасности (например, класс II). Пользователи должны быть обучены обращению с биологически опасными материалами и жидкостями человеческого происхождения и соблюдать протоколы безопасности, такие как ношение соответствующих средств индивидуальной защиты и дезактивация любой поверхности или оборудования, которое вступает в контакт с образцами. Пользователи должны тщательно дезинфицировать (см. Таблицу материалов для предлагаемого обеззараживающего средства) любую поверхность или оборудование (центрифуги, центрифужные носители и адаптеры, пипеторы, вихри, поверхности вытяжных шкафов, весы, стеклянную посуду, лотки для льда, компьютерные клавиатуры, компьютерную мышь и т. Д.), Используемые во время процедуры стирки. Члены лаборатории не должны использовать оборудование или вытяжки, используемые для мытья тканей, пока они не будут тщательно продезинфицированы. Избегайте использования отбеливателя на стальных поверхностях и электронике.
При обработке многих образцов соблюдайте осторожность, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение, используя чистые колпачки на этапах повторного укупорки на этапах экстракции липидов. Колпачки также могут быть повторно использованы, если они помечены. Однако на практике мы обнаруживаем, что маркеры плохо выделяются на черных колпачках, а клейкие этикетки падают с трубок во время ночной инкубации при 48 °C.
Сфинголипиды являются важными игроками в этиологии заболеваний и рака человека. Поэтому существует большой интерес к точному определению изменений метаболизма сфинголипидов при этих заболеваниях, поскольку они могут выявить терапевтические цели. Однако многие из тканей, которые легко доступны исследователям, криоконсервированы в ОКТ, что несовместимо с масс-спектрометрическим анализом. Таким образом, подробный протокол, описанный здесь, расширит репертуар тканей, адекватных для количественного сфинголипидомического анализа, и, таким образом, поможет улучшить наше понимание биологии изменений липидного обмена при заболеваниях и раке человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Услуги и поддержка исследовательского проекта были предоставлены VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core и VCU Lipidomics and Metabolomics Core, которые частично поддерживаются финансированием nih-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Эта работа была поддержана Национальными институтами грантов здравоохранения R21CA232234 (Сантьяго Лима).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13x100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13x100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 581300-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13x100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
References
- Maceyka, M., Spiegel, S.
- Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Hla, T., Dannenberg, A. J.
- Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking. The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).
- Lima, S., et al. TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition. Autophagy. , 1-50 (2018).
- Young, M. M., et al. Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking. Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).
- Young, M. M., Wang, H. G. Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking. Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).
- Shen, H., et al. Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment. Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).
- Morad, S. A. F., Cabot, M. C. Advances in Cancer Research. Chalfant, C. E., Fisher, P. B. 140, Academic Press. 235-263 (2018).
- Rohrbach, T. D., et al. A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound. Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).
- Weston, L. A., Hummon, A. B. Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes. Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).
- Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -U., Segersten, U., Lind, S. B. Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods. Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).
- Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS. Methods. 81, 50-55 (2015).
- Shah, P., et al. Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).
