Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Генерация органоидов сетчатки из здоровых плюрипотентных стволовых клеток, вызванных заболеваниями сетчатки человека

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64509
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1, 1,3, 1
1Centre for Ocular Regeneration, Prof. Brien Holden Eye Research Centre, LV Prasad Eye Institute, 2Manipal Academy of Higher Education, 3Schepens Eye Research Institute, Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол описывает эффективный метод дифференциации ИПСК в кластеры глазных полей и получения нейроретинальных органоидов с использованием упрощенных условий культивирования с участием как адгезивных, так и суспензионных систем культивирования. Другие типы глазных клеток, такие как RPE и эпителий роговицы, также могут быть выделены из зрелых глазных полей в культурах сетчатки.

Abstract

Плюрипотентные стволовые клетки могут генерировать сложные тканевые органоиды, которые полезны для исследований моделирования заболеваний in vitro и для разработки регенеративной терапии. Этот протокол описывает более простой, надежный и ступенчатый метод генерации органоидов сетчатки в гибридной системе культивирования, состоящей из адгезивных монослойных культур в течение первых 4 недель дифференцировки сетчатки до появления отчетливых, самоорганизующихся первичных кластеров глазного поля (EFP). Кроме того, круглые и полупрозрачные нейроретинальные островки в форме пончика внутри каждого EFP вручную собирают и культивируют под суспензией с использованием неадгезивных культуральных чашек в среде дифференцировки сетчатки в течение 1-2 недель для получения многослойных 3D-оптических чашек (OC-1M). Эти незрелые органоиды сетчатки содержат пролиферирующие PAX6+ и ChX10+ мультипотентные предшественники сетчатки. Клетки-предшественники линейно самоорганизуются внутри органоидов и выглядят как отдельные радиальные бороздки. Через 4 недели после культивирования суспензии предшественники сетчатки подвергаются постмитотической остановке и дифференцировке линий с образованием зрелых органоидов сетчатки (OC-2M). Предшественники, зафиксированные фоторецепторами, развиваются в самых внешних слоях органоидов сетчатки. Эти фоторецепторные клетки CRX+ и RCVRN+ морфологически созревают, чтобы демонстрировать внутренние сегментоподобные расширения. Этот метод может быть использован для получения органоидов сетчатки с использованием эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). Все шаги и процедуры четко объясняются и демонстрируются для обеспечения воспроизводимости и более широкого применения в фундаментальной науке и трансляционных исследованиях.

Introduction

Сетчатка представляет собой светочувствительную ткань, присутствующую в задней части глаза позвоночных, которая преобразует световые сигналы в нервные импульсы с помощью биохимического явления, известного как путь фототрансдукции. Начальные нервные импульсы, генерируемые в фоторецепторных клетках сетчатки, передаются другим интернейронам сетчатки и ганглиозным клеткам сетчатки (RGC) и достигают зрительной коры головного мозга, что помогает в восприятии изображения и визуальной реакции.

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), примерно 1,5 миллиона детей слепы, из которых 1 миллион находится в Азии. Наследственная дистрофия сетчатки (ВМД) является основным заболеванием, приводящим к слепоте, которое поражает 1 из 4 000 человек во всем мире 1,2,3, в то время как распространенность слепоты, связанной с возрастной макулярной дегенерацией (ВМД), колеблется от 0,6% до 1,1% в развивающихся странах 4. IRD вызваны наследственными генетическими дефектами в более чем 300 различных генах, участвующих в развитии и функционировании сетчатки5. Такие генетические изменения приводят к нарушению нормальных функций сетчатки и постепенной дегенерации клеток сетчатки, а именно фоторецепторных клеток и пигментного эпителия сетчатки (RPE), что приводит к тяжелой потере зрения и слепоте. Огромный прогресс был достигнут в других условиях ослепления, связанных с роговицей, хрусталиком и т. Д. Однако дистрофии сетчатки и атрофии зрительного нерва на сегодняшний день не имеют доказанной терапии. Поскольку сетчатка взрослого человека не имеет стволовых клеток6, альтернативные источники, такие как эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), полученные от пациента, могут обеспечить неограниченный запас желаемых типов клеток и иметь большие перспективы для разработки сложных тканевых органоидов, необходимых для исследований моделирования заболеваний in vitro и для разработки регенеративной терапии7, 8,9,10.

Несколько лет исследований сетчатки привели к лучшему пониманию молекулярных событий, которые организуют раннее развитие сетчатки. Большинство протоколов для получения клеток сетчатки и 3D-органоидов из PSC направлены на повторение этих событий развития in vitro путем культивирования клеток в сложном коктейле факторов роста и малых молекул для поэтапной модуляции известных биологических процессов. Образующиеся таким образом органоиды сетчатки состоят из основных клеток сетчатки: ганглиозных клеток сетчатки (RGCs), интернейронов, фоторецепторов и пигментного эпителия сетчатки (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. Несмотря на успешные попытки моделирования IRD с использованием органоидов сетчатки, потребность в сложном коктейле факторов роста и малых молекул во время дифференцировки и относительно низкая эффективность генерации органоидов сетчатки представляют собой серьезную проблему для большинства протоколов. Они в основном включают образование эмбриоидных тел с последующей их ступенчатой дифференцировкой в линии сетчатки с использованием сложных условий культивирования на разных стадиях развития in vitro 20,21,22.

Здесь сообщается об упрощенном и надежном методе разработки сложных 3D-нейроретинальных органоидов из здоровых контрольных и специфических для заболевания сетчатки ИПСК. Описанный здесь протокол использует прямую дифференциацию почти сливающихся культур hiPSC без необходимости формирования эмбриоидных тел. Кроме того, сложность питательной среды упрощается, что делает ее экономически эффективным и воспроизводимым методом, который может быть легко принят новыми исследователями. Он включает в себя гибридную культуральную систему, состоящую из адгезивных монослойных культур в течение первых 4 недель дифференцировки сетчатки до появления отчетливых, самоорганизующихся первичных кластеров глазного поля (EFP). Кроме того, круглые нейроретинальные островки внутри каждого EFP вручную собирают и выращивают в суспензионных культурах в течение 1-2 недель для получения многослойных 3D-чашек сетчатки или органоидов, состоящих из пролиферирующих предшественников нейроретинальности PAX6+ и CHX10+. Расширенное культивирование органоидов сетчатки в 100 мкМ тауринсодержащей среде в течение еще 4 недель привело к появлению предшественников фоторецепторов RCVRN+ и CRX+ и зрелых клеток с рудиментарными внутренними сегментоподобными расширениями.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты с использованием ИПСК проводились в асептическом режиме, в соответствии со стандартной лабораторной практикой, руководящими принципами по этике и биобезопасности, а также с одобрения регулирующих органов, таких как Институциональный комитет по этике (IEC), Институциональный комитет по исследованиям стволовых клеток (IC-SCR) и Институциональный комитет по биобезопасности (IBSC).

1. Приготовление среды для культивирования ИПСК и дифференцировки сетчатки и реагентов

  1. Среда для культивирования и поддержания ИПСК
    1. Культивируйте и поддерживайте нормальную линиюhiPSC 23 (hiPSC-F2-3F1) и отредактированную CRISPR линию RB1-/- hiPSC (LVIP15-RB1-CS3, с биаллельной делецией со сдвигом рамки 10.н. в экзоне 18 гена RB1 человека) в среде Essential 8 на культуральных планшетах, покрытых матригелем (матричное покрытие базальной мембраны; см. Таблицу материалов) в условиях культивирования без кормушки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол можно сделать полностью свободным от ксено, заменив матрицу базальной мембраны покрытием из рекомбинантного витронектина (VTN-N). Приготовьте полную среду Essential 8, добавив 50-кратную добавку Essential 8 (входит в комплект средств Essential 8; см. Таблицу материалов) и 100 ЕД/мл растворов пенициллина-стрептомицина. В качестве альтернативы, hiPSC также можно культивировать с использованием полной среды mTeSR1.
  2. Раствор для диссоциации клеток (1x CDS)
    1. Для бесферментной диссоциации и пассажирования ИПСК человека приготовьте CDS, содержащий 0,5 мМ ЭДТА, рН 8,0 и 30 мМ NaCl в 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе Дульбекко (DPBS) (см. Таблицу материалов).
    2. Чтобы приготовить 100 мл 1x CDS, добавьте 100 мкл 0,5 М ЭДТА и 1 мл 3 М исходных растворов NaCl к 99 мл 1x DPBS, хорошо перемешайте и стерилизуйте фильтр с помощью фильтра 0,22 мкм.
  3. Дифференциационная индукционная среда (DIM)
    1. Приготовьте DIM, используя базальную среду DMEM-F12 с добавлением 10% заменителя нокаутирующей сыворотки (KOSR), 1x заменимой аминокислоты (NEAA), 2 мМ GlutaMax, 100 ЕД / мл пенициллина-стрептомицина, 200 мкМ L-аскорбиновой кислоты и 1% добавки N2 (см. Таблицу материалов).
  4. Среда дифференцировки сетчатки (RDM)
    1. Приготовьте RDM, используя базальную среду DMEM-F12 с добавлением 10% нокаутирующей сыворотки (KOSR), 1x заменимой аминокислоты (NEAA), 2 мМ глутамакса, 100 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина, 200 мкМ L-аскорбиновой кислоты и 2% добавки B27 (с витамином А) (см. Таблицу материалов).
  5. Поверхности клеточных культур, покрытые внеклеточным матриксом
    1. Разморозьте матрицу базальной мембраны, отвечающую требованиям hESC, на ночь в ведре со льдом, желательно в холодильнике при температуре 4-8 °C. Разбавьте размороженный 100-кратный матричный материал (5 мл) в соотношении 1:5, добавив 20 мл ледяной базальной среды DMEM-F12, и перемешайте путем осторожного закручивания, чтобы получить 20-кратный исходный раствор.
      1. Приготовьте аликвоты объемом 0,5 мл на льду, используя предварительно охлажденные наконечники пипеток и стерильные микроцентрифужные пробирки. Маркируйте флаконы как 20-кратные запасы и храните их в замороженном виде в морозильной камере при температуре -80 °C до 6 месяцев.
    2. Для покрытия поверхностей клеточных культур (культуральных чашек или 6-луночных тарелок) разморозьте аликвоту 20-кратной матрицы на льду и разбавьте ее в соотношении 1:20, используя ледяную базальную среду DMEM-F12, чтобы приготовить 10 мл 1x раствора для покрытия матрицы, чего достаточно для покрытия 100-миллиметровой чашки или 6-луночной пластины (1,5 мл/лунка).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед работой с матричным раствором предварительно охладите пипетки/микронаконечники с помощью аспирации ледяного и стерильного DPBS. Размораживание и вся обработка матрицы должны производиться на льду с использованием предварительно охлажденных пипеток / микронаконечников, чтобы избежать полимеризации и гелеобразования при комнатных температурах.
    3. Добавьте 1,5 мл 1x раствора матричного покрытия в каждую лунку 6-луночного планшета, осторожно перемешайте пластину, чтобы обеспечить равномерное покрытие, и инкубируйте планшеты при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO2 . Оставьте пластины нетронутыми как минимум на 1 час, чтобы обеспечить равномерное покрытие матрицы на поверхностях культуры.
    4. Перед посевом клеток аспирируйте раствор покрытия с помощью стерильной пипетки объемом 5 мл и выбросьте жидкие отходы. Немедленно добавьте свежую питательную среду (2 мл на 6-луночную пластину) и засейте клетки с плотностью 150 000-200 000 клеток в лунку. Не допускайте высыхания пластин во время погрузочно-разгрузочных работ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы покрытие рекомбинантным витронектином (VTN-N) в конечной концентрации 0,5 мкг/мл может быть использовано для протокола культивирования без ксено.

2. Создание человеческих культур iPSC

  1. Размораживание и возрождение ИПСК
    1. Покройте одну лунку 6-луночной пластины раствором 1x мембранной матрицы. Инкубировать при 37 °C в течение 1 ч, чтобы обеспечить полимеризацию и равномерное покрытие поверхности культуры.
    2. После 1 ч инкубации удалите раствор оболочки и добавьте 1 мл предварительно подогретой полной среды Essential 8, содержащей 10 мкМ ингибитора Rho-киназы, Y-27632 (1 мкл / мл 10 мМ запаса; см. Таблицу материалов), прежде чем оживлять клетки.
    3. Извлеките криовальный запас hiPSC (1 x 106 клеток/флакон) из контейнера с жидким азотом. Быстро разморозьте криовиал на водяной бане с температурой 37 °C с легким перемешиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не размораживайте флакон полностью; Запишите номер прохода, простерилизуйте поверхность флакона и вытрите его насухо безворсовым тампоном, содержащим 70% изопропилового спирта.
    4. Используя стерильный наконечник пипетки объемом 1 мл, аспирируйте криовальное содержимое в свежую пробирку объемом 15 мл, состоящую из 2 мл предварительно разогретой полной среды Essential 8 без Y-27632. Центрифугируйте пробирку при 1 000 x g в течение 4 мин при комнатной температуре. Откажитесь от надосадочной жидкости.
    5. Ресуспендировать клеточную гранулу в 1,0 мл полной среды Essential 8, содержащей 10 мкМ Y-27632.
    6. Добавьте эту суспензию ячеек на поверхности, покрытые матрицей, не нарушая матрицу, распределяя ее вдоль стенок. Аккуратно покачайте тарелку крест-накрест, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток.
    7. Инкубируйте планшеты при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO2 , чтобы клетки прилипли и начали размножаться.
    8. Через 12-24 ч замените отработанную среду и выдержите культуры в предварительно подогретой полной среде Essential 8 без Y-27632.
    9. Меняйте культуральную среду каждые 24 часа и проходите через культуры, как только они достигнут слияния 70%-80%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение разделения 1: 6 обычно соблюдается для культур hiPSC и проходит через регулярные промежутки времени в 3-4 дня.
  2. Пассажирование и нанесение ИПСК для инициации дифференцировки линии сетчатки
    1. Аспирируйте отработанную среду из 70%-80% сливающихся культур ИПСК человека в 6-луночные планшеты.
    2. Добавьте по 1 мл CDS (этап 1.2) в каждую лунку и инкубируйте при 37 ° C в течение 5-7 минут до округления клеток. Осторожно удалите CDS, стараясь не отрывать клетки, добавьте 2 мл свежей среды Essential 8 и аккуратно тритуируйте с помощью пипетки.
    3. Соберите клеточную суспензию из одной лунки 6-клеточной пластины в центрифужную пробирку объемом 15 мл и открутите пробирку при 1000 x g в течение 4 мин при комнатной температуре. Откажитесь от надосадочной жидкости.
    4. Ресуспендируют клеточную гранулу в 1,2 мл среды Essential 8 и дозируют 200 мкл ячейки 200 мкл клеточной суспензии (соотношение расщепления 1:6) в каждую лунку 6-луночной пластины с матричным покрытием, содержащей 1,5 мл питательной среды iPSC, содержащей 10 мкМ Y-27632, как описано на этапе 1.5.
    5. Через 12-24 ч замените отработанную среду и выдержите культуры в предварительно подогретой полной среде Essential 8 без Y-27632.
    6. Меняйте питательную среду каждые 24 часа до тех пор, пока культуры не достигнут 70-80% слияния.

3. Дифференциация ИПСК по глазным полям и происхождению сетчатки

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое описание процесса дифференциации показано на рисунке 1.

  1. Инициируйте процедуру дифференцировки, как только культуры hiPSC достигнут слияния 70-80%.
  2. В день 0 замените поддерживающую среду hiPSC на DIM (шаг 1.3), содержащую 1 нг/мл bFGF и 1 нг/мл Noggin. Добавьте 2,0 мл среды на лунку 6-луночного планшета и поддерживайте ячейки при 37 ° C в инкубаторе 5% CO2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Постепенная отмена bFGF индуцирует дифференцировку ПСК, а добавление возрастающих концентраций ноггина (ингибитора нескольких BMP) на начальных стадиях индуцирует дифференцировку и неврализацию эктодермальной линии11,12 и блокирует приверженность мезодермы и энтодермы. В качестве альтернативы Noggin может быть заменен на LDN193189. В отличие от двойной стратегии ингибирования SMAD, о которой сообщалось ранее20,21, этот протокол не требует добавления Activin или SB-431542.
  3. В 1-й день смените отработанную среду и добавьте DIM, содержащий 1 нг/мл bFGF и 10 нг/мл Noggin. Добавьте 2,0 мл на лунку 6-луночного планшета. Инкубируйте и поддерживайте клетки при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 .
  4. На 2-3 день удалите отработанную среду и добавьте DIM, содержащий всего 10 нг/мл Noggin. Добавьте 2,0 мл на лунку 6-луночного планшета и меняйте среду каждые 24 часа. Инкубируйте и поддерживайте клетки при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием всегда предварительно прогревайте питательную среду до 30-37 °C. Избыточные мушки и мертвые клетки могут наблюдаться в ранних культурах дифференцировки. В таких условиях промойте культуры один раз 1x DPBS и добавьте среду для дифференцировки сетчатки. Тесты на стерильность отработанной среды можно проводить еженедельно или по мере необходимости.
  5. На 4-й день удалите отработанный носитель и добавьте RDM (шаг 1.4). Добавьте 2,0 мл на лунку 6-луночного планшета и продолжайте поддерживать культуры в RDM при 37 ° C в инкубаторе 5% CO2 с ежедневной сменой свежей среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы PSC можно выращивать в виде суспензионных культур с 1-3-го дня в неадгезивных и круглодонных 96-луночных планшетах с плотностью клеток 5 x 103 клеток/100 мкл / лунку с образованием эмбриоидных телец (БЭ) в идентичных условиях культивирования в DIM. Хорошо сформированные ЭБ на 4-й день могут быть нанесены на пластины с матричным покрытием, содержащие RDM, и им разрешено прилипать, размножаются и дифференцируются, как описано ниже.
  6. Примерно на 14-18 день наблюдайте за культурами под микроскопом при 10-кратном увеличении на предмет появления нейронных розеточных доменов, состоящих из предшественников раннего глазного поля (рис. 2B).
  7. Примерно на 21-28 день (3-4 недели) наблюдайте культуры под микроскопом при 4-кратном и 10-кратном увеличении, чтобы наблюдать появление самоорганизующихся, отчетливых EFP с центральным островком круглых 3D-нейроретинальных структур, окруженных смежными выростами нейроэпителия и эпителия поверхности глаза (рис. 2C, D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Около 20-30 EFP можно наблюдать на лунку 6-луночной пластины нормальной культуры дифференцировки сетчатки hiPSC. Это число может варьироваться в зависимости от других специфических для заболевания линий hiPSC в зависимости от их генетического фона и потенциала дифференцировки линий сетчатки.

4. Сбор органоидов сетчатки

  1. Вытягивание пламени стеклянных пипеток Пастера для ручного сбора чашек сетчатки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте автоклавные и стерильные стеклянные пипетки Пастера для ковыряния глазного поля.
    1. Включите горелку Бунзена. Возьмите стерильную пипетку Пастера и держите основание в одной руке, а кончик капилляра в другой. Пламя стерилизует и нагревает область около середины кончика капилляра вращательными движениями, пока стекло не станет податливым. Затем отойдите от пламени и быстро вытяните наружу, чтобы создать тонкий капиллярный наконечник с закрытым просветом.
    2. Держите тонкий наконечник горизонтально перед пламенем и быстро пропустите его через пламя движением наружу, чтобы создать гладкий крючок или L-образный капиллярный наконечник.
    3. Используйте гладкую зону внешней кривизны капиллярного крючка в качестве мелкой мерной ложки, чтобы аккуратно поднять и отсоединить неповрежденные нейроретинальные чашки от кластеров EFP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гладкий угол стеклянного капиллярного крючка не вызывает повреждения клеток и не создает царапин на культуральных поверхностях. Этот простой инструмент также может быть эффективно использован для расщепления отдельных колоний hiPSC в сетчатых паттернах и для передачи их в виде небольших клеточных кластеров во время клональной экспансии.
  2. Культивирование и уход за чашками сетчатки для получения 3D-органоидов сетчатки.
    1. На 25-30-й день добавьте 4,0 мл предварительно подогретой среды для дифференцировки сетчатки в чашку с низкой насадкой диаметром 60 мм перед подготовкой к сбору нейроретинальных чашек.
    2. Работайте под стереомикроскопом с увеличением 0,63x-4,5x, чтобы наблюдать и вручную выбирать правильно сформированные нейроретинальные чашки из отдельных EFP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Появление пигментированных клеточных выростов RPE помогает легко идентифицировать EFP и центрально расположенные нейроретинальные чашки. Чашки сетчатки выглядят как круглые и полупрозрачные 3D-структуры в форме пончика с четкими радиальными бороздками, образованными линейно расположенными и самоорганизующимися стволовыми клетками сетчатки, в отличие от плотно упакованных и сферических или нерегулярных кластеров, образованных нейронами ЦНС или клеткаминервного гребня 23.
    3. Используйте крючки для пипеток Pasture с вытягиванием пламени, чтобы аккуратно подтолкнуть и вычерпать центральный нейроретинальный остров в отдельных EFP.
    4. Установите микропипетку объемом 1 мл на аспирацию 100 мкл и используйте микронаконечники объемом 1 мл с широкими отверстиями для аспирации и переноса плавающих чашек сетчатки в свежие чашки с низкой адгезией, приготовленные на шаге 4.2.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование наконечников с меньшим размером отверстия и более высоким давлением всасывания может вызвать сдвиг и повлиять на целостность чашек сетчатки. Примерные размеры чашечек сетчатки составляют около 1-2 мм в диаметре.
    5. Сохраняйте чашки сетчатки в RDM в виде неадгезивных суспензионных культур и инкубируйте их при 37 ° C в инкубаторе 5% CO2 .
    6. День 30-45: Меняйте среду ежедневно, осторожно наклоняя блюдо и позволяя чашкам сетчатки отстояться в течение примерно 30 секунд. Следуйте методу частичной подкормки, удаляя половину объема отработанной среды и заменяя равными объемами свежей среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторной аспирации и переноса, чтобы предотвратить повреждение чашек сетчатки. После 1-2 недель культивирования суспензии чашечки сетчатки немного увеличиваются в размерах (1-3 мм) и превращаются в самоорганизующиеся 3D-органоиды сетчатки (OC-1M), состоящие из линейно расположенных ранних нейроретинальных предшественников, экспрессирующих PAX6 и CHX10 (рис. 3Bi).
    7. День 45-60: Культивируйте органоиды сетчатки в течение следующих 4 недель в RDM, содержащем 100 мкМ таурина (см. Таблицу материалов), чтобы поддержать лучшую выживаемость и дифференцировку линий нейроретинальных предшественников и развитие зрелого типа клеток сетчатки (OC-2M).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Около 70-80% чашек сетчатки или зрительных чашек, отобранных из EFP, остаются нетронутыми, сохраняют свое ламинирование и развиваются в зрелые органоиды сетчатки после 4 недель культивирования суспензии (OC-2M).
    8. Убедитесь, что зрелые органоиды сетчатки через 4 недели суспензионного культивирования показывают появление предшественников фоторецепторов RCVRN+ и CRX+ и зрелых клеток с рудиментарным внутренним сегментоподобным расширением в самых внешних клеточных слоях, тем самым повторяя нормальное развитие сетчатки и процесс созревания in vitro (рис. 3Bii).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После удаления нейроретинальных чашек культуры дифференцировки могут постоянно поддерживаться в RDM. Проксимальные эпителиальные выросты, окружающие нейросетчатку, содержат предшественники клеток пигментированного эпителия сетчатки (RPE), которые в дальнейшем расширяются и созревают, образуя пигментированные монослои RPE с типичной морфологией булыжника (рис. 4). Дистальные выросты преимущественно состоят из поверхностного эпителия глаза, который способствуетэпителию хрусталика и роговицы.Желаемые типы клеток могут быть собраны из различных зон выростов EFP и дополнительно обогащены для создания чистых культур.

5. Характеристика органоидов сетчатки

  1. Морфологическая и молекулярная характеристика
    1. Наблюдайте за адгезивными EFP и плавающими органоидами сетчатки под фазово-контрастным микроскопом при 4-кратном и 10-кратном увеличении и документируйте их морфологию и размеры.
    2. Соберите около 20 органоидов сетчатки на разных стадиях созревания (этапы 4.2.3-4.2.6) в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, используя наконечники широкого диаметра 1000 мкл. Дайте органоидам осесть на дне и аспирировать среду. Вымойте чашки с помощью 1x PBS.
    3. Удалите излишки PBS и добавьте 1,0 мл реагента TRIzol (см. Таблицу материалов). Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Гомогенизируйте ткань с помощью трубчатого пестика и тритурируйте с помощью пипетки объемом 1,0 мл.
    4. Подготовьте общую РНК, следуя стандартному реагентному методу выделения и очистки РНК в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
    5. Проверьте качество РНК на агарозном геле и количественно определите его с помощью спектрофотометра NanoDrop (см. Таблицу материалов).
    6. Преобразуйте 1-2 мкг общей РНК в кДНК с помощью фермента обратной транскриптазы в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). В таблице 1 приведен список геноспецифических праймеров.
    7. Вкратце, приготовьте мастер-смесь РНК-праймер в 10 мкл общего объема, как указано в таблице 2 , и инкубируйте пробирку при 65 ° C в течение 5 минут в термоциклере. Перенесите трубку из термоциклера на лед на 2 мин.
    8. Тем временем приготовьте мастер-микс 2 с реагентами, указанными в таблице 3. Добавьте эту мастер-смесь в пробирку для смеси РНК-праймер, приготовленную на шаге 5.1.7. Аккуратно перемешайте.
    9. Инкубируют образец при 50 °C в течение 50 мин, затем при 85 °C в течение 5 мин, а затем выдерживают при 4 °C, чтобы остановить реакцию.
    10. Используйте синтезированную кДНК в качестве шаблона в ПЦР-реакциях для проверки экспрессии нейроретинального предшественника и маркеров зрелых клеток сетчатки.
    11. Нормализуйте общие шаблоны кДНК каждого образца, а именно F2-UD (hiPSC-F2-3F1; недифференцированные клетки), OC-1M (1-недельная оптическая чашка в суспензионной культуре) и OC-2M (4-недельная оптическая чашка в суспензионной культуре) с помощью полуколичественной ПЦР с использованием генов домашнего хозяйства, таких как hE1fα или GAPDH.
    12. Подготовьте мастер-смесь для полуколичественной ПЦР, как указано в таблице 4, и поместите пробирки с исследуемым образцом для амплификации в термоциклер. Условия амплификации ПЦР приведены в таблице 5.
  2. Гистология и иммуногистохимия
    1. Соберите оптические чашки в микроцентрифужную пробирку объемом 2,0 мл и аспирируйте избыточную среду (этапы 4.2.3-4.2.6). Промойте органоиды 1x PBS, а затем промойте и суспендируйте их в 500 мкл 4% параформальдегида, чтобы закрепить их на ночь при комнатной температуре.
    2. На следующий день вымойте чашки в деионизированной воде. Дайте чашкам постоять в 95% спирте (три смены по 15-20 минут каждая), затем 100% спирт (три смены по 15-20 минут каждая), смесь абсолютного спирта и ксилола 1:1 в течение 15 минут, ксилола (две смены по 15 минут каждая) и парафина (три смены по 15 минут каждая). Вставьте эту ткань, чтобы приготовить парафиновый блок в соответствии со стандартными процедурами. Дайте ему остыть и затвердеть.
    3. Подготовьте тонкие срезы (толщиной ~ 4-5 мкм) с помощью микротома и поместите их на микроскопические предметные стекла с силановым покрытием (см. Таблицу материалов) в соответствии со стандартными гистологическими процедурами.
    4. Для депарафинизации нагрейте предметные стекла при 70 °C на нагревательном блоке в течение 15-20 мин. Как только воск растает, промойте предметные стекла ксилолом (три смены по 3-4 минуты), который полностью удалит парафин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неполное удаление парафина приводит к плохому/пятнистому окрашиванию участков с огромным количеством фонового шума.
    5. Повторно увлажните предметные стекла, используя разное процентное содержание этанола (100%, 90% и 80%) в течение 3 минут каждое. Промойте предметные стекла дистиллированной водой и приступайте к извлечению антигена.
    6. Перед началом извлечения антигена предварительно нагрейте цитратный буфер (pH 6,0) в банке Coplin (см. Таблицу материалов) с помощью микроволновой печи до 95-100 °C.
    7. Погрузите предметные стекла в предварительно разогретый цитратный буфер и прогрейте банку в течение 15 минут в микроволновой печи. Достаньте банку Coplin из духовки и дайте ей остыть при комнатной температуре.
    8. Заблокируйте срезы для эндогенной пероксидазы, добавив смесь метанола и перекиси водорода в соотношении 1:1 в течение 5 мин, а затем трижды промыв срезы 1x PBS.
    9. Пронизывайте срезы 0,5% Triton-X 100 в течение 15 мин. Трижды промойте предметные стекла с помощью 1x PBS.
    10. Блокируйте неспецифическое связывание первичных антител путем инкубации срезов с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) в 1x PBS в течение 1 часа.
    11. Инкубируют срезы с первичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C. Трижды промойте предметные стекла 1x PBS в течение 3-5 минут каждый, чтобы удалить несвязанное антитело.
    12. Добавьте подходящее флуоресцентное вторичное антитело, конъюгированное с красителем, и инкубируйте в течение 45 минут. Трижды промойте предметные стекла 1x PBS по 3-5 минут каждое.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела и их соответствующие разведения указаны в таблице материалов. Срезы органоидов сетчатки были иммуномечены с использованием PAX6 и CHX10 для обнаружения ранних клеток-предшественников нейроретинальности, а также с использованием Recoverin и CRX для обнаружения коммитированных клеток-предшественников сетчатки и фоторецепторов. Аналогичным образом, анти-PAX6 и анти-MITF использовались для обнаружения предшественников RPE, а анти-CRALBP и анти-RPE65 использовались для обнаружения пигментированных зрелых клеток RPE методом иммуноцитохимии 2D-монослойных культур.
    13. Покройте секции DAPI или PI и установите их на предметное стекло с помощью монтажного носителя с защитой от выцветания (см. Таблицу материалов).
    14. Визуализируйте и документируйте иммуномеченные срезы органоидов сетчатки и культур RPE с помощью флуоресцентного или конфокального лазерного сканирующего микроскопа для изучения различных клеточных слоев, экспрессирующих различные маркеры сетчатки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Дифференциация ИПСК в глазные линии достигается путем культивирования клеток в различных коктейлях питательной среды, содержащих добавки и факторы роста, последовательными шагами в разные моменты времени, как описано на рисунке 1. Культуры hiPSC поддерживаются в среде Essential 8, плюрипотентной среде для поддержания стволовых клеток. Как только они достигают слияния 70-80% (рис. 2A), среду заменяют средой для индукции дифференцировки (DIM) на день 0 (см. шаг 3.2), содержащей 1 нг / мл bFGF, 1 нг / мл ноггина и 1% добавки N2. Вместе с нейроиндуцирующей добавкой N2 Noggin, ингибитор передачи сигналов BMP, играет решающую роль в направлении клеток к нейроэктодермальной линии, блокируя мезодермальную и энтодермальную приверженность. На 1-й, 2-й и3-й день концентрация ноггина увеличивается до 10 нг/мл (см. шаги 3.3 и 3.4). С4-го дня DIM заменяется средой для дифференцировки сетчатки (RDM) (шаг 3.5), и посевы выдерживаются непрерывно до 30 дней. B27 в коктейле RDM содержит дополнительные добавки, такие как множественные антиоксиданты и D-галактоза, которая способствует аэробному метаболизму и помогает снизить окислительный стресс, улучшая жизнеспособность дифференцирующих клеток-предшественников. Кроме того, присутствие ретинола ацетата (витамина А) и гормонов роста, таких как трийодо-I-тиронин (Т3), способствует дифференцировке нейронных и сетчаточных линий.

На 14-18-е сутки наблюдается образование невральных розеток, что знаменует собой начало фиксации глазного поля (рис. 2Б). Предшественники глазного поля в нервных розетках далее размножаются и самоорганизуются в отдельные первичные кластеры глазного поля (EFP) с круговыми нейроретинальными структурами в центре. Другие типы клеток, такие как пигментный эпителий сетчатки (RPE), эпителий нервного гребня и те, которые вносят вклад в поверхность глаза, появляются и мигрируют в виде непрерывного эпителия с четко определенными краями. Хорошо сформированные поля глаз, как описано выше, можно наблюдать между 21-м и28-м днем дифференцировки (рис. 2C, D). Центральный островок нейроретинальных чашек собирают между 25-30 днями с помощью стеклянной пипетки Пастера, вытянутой пламенем (рис. 2E), и выдерживают в виде неадгезивных суспензионных культур в RDM еще 1-2 недели, до 45-го дня. Пролиферирующие предшественники сетчатки далее самоорганизуются, образуя многослойные 3D-органоиды сетчатки диаметром около 2-3 мм (рис. 2F, G). С 46-го дня RDM дополняется таурином 100 мкМ для стимулирования нейрогенеза и улучшения выживаемости клеток в долгосрочных органоидных культурах in vitro (рис. 2H).

Органоиды сетчатки характеризуются на разных стадиях созревания экспрессией нескольких маркеров-предшественников сетчатки с помощью ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и иммуногистохимии (ИГХ). Для этого органоиды собирают для полного выделения РНК на 30-й и60-й день дифференцировки. Результаты ОТ-ПЦР подтвердили индукцию и экспрессию нейроретинальных маркеров, таких как NEUROD1, ChX10, CRX, PKCß1, RLBP1, RHOK, OPN1SW, RCVRN, ABCA4, RD3 и PDE6C у органоидов сетчатки 1-недельного возраста (через 4-5 недель после дифференцировки, OC-1M) и 4-недельных органоидов сетчатки 8,12 (через7-8 недель после дифференцировки, OC-2M) (рис. 3A). Иммуногистохимия и флуоресцентная визуализация подтвердили экспрессию ранних маркеров-предшественников сетчатки PAX6, CHX10 и OTX2 в OC-1M и зрелых маркеров сетчатки RCVRN и CRX в OC-2M 8,12 (рис. 3Bi, ii).

В дополнение к центральным нейроретинальным чашкам появляются и мигрируют из EFP другие типы глазных клеток, такие как пигментный эпителий сетчатки (RPE), эпителий нервного гребня и эпителиальные клетки поверхности глаза. Предшественники RPE, полученные из нейроэктодермы, выглядят как компактно расположенные эпителиальные клетки, окружающие EFP, которые постепенно созревают и пигментируются вдоль миграционных краев с 30-45 дня (рис. 4A-C). Таким образом, эти адгезивные культуры дифференцировки после удаления чашек сетчатки могут быть продлены до 45-го дня для сбора пролиферирующих предшественников RPE (рис. 4D), которые могут быть дополнительно обогащены для получения монослойных культур полностью зрелых пигментированных клеток RPE. Зрелый пигментированный RPE можно рассматривать как монослои с типичной морфологией булыжника (рис. 4E). Идентичность клеток RPE дополнительно подтверждается иммуноцитохимией с использованием антител против RPE-специфических маркеров, таких как MITF (маркер-предшественник RPE), PAX6 (маркер-предшественник и маркер зрелого RPE) и RPE65 (маркер зрелого RPE)10,12 (рис. 4F-H).

Таким образом, плюрипотентные органоиды сетчатки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, могут служить моделями in vitro для изучения различных наследственных заболеваний сетчатки 7,8,9. Модели стволовых клеток, специфичные для конкретного заболевания, разрабатываются либо путем создания специфических для пациента линий ИПСК, либо путем введения специфических для заболевания мутаций в здоровые контрольные линии ИПСК с использованием подхода к редактированию геновна основе CRISPR 7,8. Мутантные ИПСК могут эффективно дифференцироваться или не дифференцироваться в типы клеток сетчатки в зависимости от вовлеченных генных мутаций. В то время как большинство здоровых контрольных клеточных линий следовали временной шкале, описанной выше, в случае специфических для заболевания ИПСК могут быть отклонения с точки зрения сроков дифференцировки, морфологии EFP, размера чашки сетчатки, ламинирования и созревания. Был исследован потенциал дифференцировки сетчатки линии RB1-/- hiPSC (LVIP15-RB1-CS3), которая несет биаллельную делецию 10.н. в экзоне 18 гена RB1 человека, что приводит к сдвигу рамки и полной потере экспрессии белка RB1. Было замечено, что потеря экспрессии RB1 не влияла на дифференцировку глазной и ранней линии сетчатки мутантной линии hiPSC. Однако наблюдалось заметное запаздывание сроков и снижение эффективности формирования EFP. Возникшие атипичные EFP имели аномальные агрегаты предшественников сетчатки, которые не смогли ламинироваться и самоорганизоваться в надлежащие чашки сетчатки (рис. 5A, B) или не имели окружающей зоны RPE и эпителия глазной поверхности (OSE) (рис. 5C). При сборе и хранении в качестве суспензионных культур эти кластеры-предшественники сетчатки образовывали нерегулярные нейроретинальные агрегаты (рис. 5D).

Figure 1
Рисунок 1: Временная шкала, представляющая дифференциацию ИПСК в органоиды сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Самоорганизующаяся 3D-генерация органоидов сетчатки . (A) Выращивание культур ИПСК в условиях, свободных от корма. (B) Развитие розеток нейронов на 14-й день дифференцировки (звездочка). (С,Д) Первичные скопления глазного поля (EFP), содержащие центральную нейроретинальную чашеобразную структуру (черные стрелки), окруженную мигрирующей зоной эпителия (белые стрелки) на 21-28 день дифференцировки. (E) Стеклянная пипетка Пастера с пламенем и крючковатым наконечником. Плавный изгиб в области шарнира используется для подталкивания и подъема чашек сетчатки (стрелка). (Ф,Г) Чашки сетчатки, собранные на 25-й день и культивируемые под суспензией для создания самоорганизующихся 3D-органоидов сетчатки. (H) Зрелые органоиды сетчатки в культуре суспензии на 45-й день. Масштабные линейки: 100 мкм (A, B, D, G); 200 мкм (C, F, H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Характеристика органоидов сетчатки. (A) Профилирование экспрессии генов сетчатки с помощью ОТ-ПЦР недифференцированной нормальной линииhiPSC 23 (hiPSC-F2-3F1) (F2-UD) и дифференцированных нормальных зрительных чашек, отобранных на 3-4 неделе дифференцировки и созревающих далее в культуре суспензии в течение 1 недели (OC-1M) и 4 недель (OC-2M) соответственно. КДНК всех испытуемых образцов нормализовали с использованием eEF1a в качестве контроля нагрузки. (B) Конфокальные изображения иммуномеченных участков (i) незрелых органоидов сетчатки (OC-1M) с использованием антител против нейроретинальных маркеров-предшественников CHX10, PAX6 и OTX2 (красным цветом) и (ii) зрелых органоидов сетчатки (OC-2M) с использованием антител против маркеров-предшественников фоторецепторов Recoverin и CRX (красный). Отмеченный самый внешний слой органоидов сетчатки с дифференцирующимися фоторецепторными клетками (коробкой) на левых панелях увеличен и показан на правых панелях. В качестве противостояния был использован DAPI (синего цвета). Рудиментарные внутренние сегментообразные расширения отмечены белыми стрелками. Масштабная линейка: 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Появление различных типов глазных клеток. (A) Кластеры EFP с нейроретинальной чашечкой в центре и мигрирующими выростами RPE, демонстрирующими пигментацию вдоль передних краев (белая стрелка). (B) Хорошо дифференцированные пигментные эпителиальные выросты из нескольких EFP по всему нейроретинальному островку. (C) Более высокое увеличение EFP показывает миграционную зону предшественников RPE (белая стрелка) и эпителий поверхности глаза (звездочка), окружающий нейроретинальную чашечку. (D) Расширенные адгезивные культуры, в которых развивались монослои незрелых клеток RPE, содержащих как пигментированные, так и непигментированные клетки. (E) Монослойные культуры полностью зрелых и пигментированных клеток RPE с морфологией булыжника на 60-й день. (Ф-Н) Клетки RPE, экспрессирующие PAX6, MITF и RPE65 зеленого цвета. Масштабная линейка: 200 мкм (A, B); 100 мкм (С-Э); 20 мкм (F-H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Аномальное формирование чашечки сетчатки в RB1-/- мутантных ИПСК. (A, B) EFP с аномальными агрегатами предшественников сетчатки с искаженным расслоением и отсутствием борозд. (C) EFP с миниатюрной нейроретинальной чашечкой, но без окружающей зоны RPE и эпителия поверхности глаза (стрелка). (D) Нерегулярные нейроретинальные агрегаты, образующиеся в культуре суспензии. Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Название букваря Простая последовательность (5'-3') Размер ремешка (bp) Ссылка ID
1 heEF1α F: GAAGTGGTGATGCTGCCATTGT 198 NM_001402
R: TTCTGAGCTTTCTGGGCAGACTTG
2 hNeuroD1 F: CGCGCTTAGCATCACTAACT 349 NM_002500
R: GCGTCTCTTGGGCTTTTGAT
3 hCHX10 F: CAAGTCAGCCAAGGATGGCA 382 NM_182894
R: CTTGACCTAAGCCATGTCCT
4 hCRX F: TCAACGCCTTGGCCCTAAGT 357 NM_000554
R: ACACATCTGTGGAGGGTCTT
5 hPKC-β1 F: AAAGGCAGCTTTGGCAAGGT 376 NM_212535
R: CGAGCATCACGTTGTCAAGT
6 РЛБП1 F: TGCACCATTGAAGCTGGCTA 361 NM_000326
R: AGAAGGGCTTGACCACATTG
7 РХОК F: CAAGCTGTATGCCTGCAAGA 360 NM_002929
R: ATCCGGACATTGCCGTCATT
8 hOPN1SW F: TGCTTCATTGTGCCTCTCTC 373 NM_001708
R: AGCTGCATGTGTCGGATTCA
9 РЦВРН F: AGACCAACCAGAAGCTGGAGT 367 NM_002903
R: ACGGGTGTCATGTGAGTGGTA
10 hABCA4 F: CACCGTAGCAGGCAAGAGTATT 271 NG_009073
R: AATGAGTGCGATGGCTGTGGAGA
11 hRD3 F: ATGGTGCTGGAGACGCTTAT 328 NM_183059
R: CTTCCTGCTTCATCCTCTCCA
12 hPDE6C F: GTTGATGCCTGTGAACAAATGC 351 NM_006204
R: ACCACTCAGCATAGGTGTGAT

Таблица 1: Список геноспецифических праймеров для ОТ-ПЦР.

Компоненты для смеси РНК-праймер Объем (в мкл)
РНК (1-2 мкг) n
10 мМ dNTP 1
10 мМ Oligo dT 1
Вода, очищенная DEPC до 10
Общий объем реакции 10

Таблица 2: Мастер-микс РНК-праймер для конверсии кДНК.

Компоненты для Mastermix 2 Объем (в мкл)
10-кратный буфер RT 2
25 мМ MgCl2 4
0,1 М DTT 2
SuperScript III Обратная транскриптаза 1
РНКазаАУТ 1
Общий объем реакции 10

Таблица 3: Мастер-микс 2 для конверсии кДНК.

Компоненты ПЦР Объем (в мкл)/реакция
10-кратный буфер для ПЦР 2
2 мМ dNTP 2
Прямой праймер (5 мкМ) 1
Обратный праймер (5 мкМ) 1
Так-полимераза 0.2
Матрица кДНК (50-100 нг) 1
Стерильная вода Milli-Q 12.8
Общий объем реакции 20
 

Таблица 4: Мастер-микс для полуколичественной ПЦР.

Температура Время Количество циклов
Денатурация 95 °С 5 мин х 1
Денатурация 95 °С 30 с х 35
Отжиг 50-60 °С 30 с
Расширение 72 °С 30 с
Окончательное расширение 72 °С 10 мин х 1

Таблица 5: Условия ПЦР-амплификации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ИПСК являются мощным инструментом для изучения развития органов и тканей in vitro. Повторение фенотипа заболевания путем дифференциации здоровых и специфических для заболевания ИПСК в сторону линии сетчатки может помочь получить новое представление о патофизиологии различных форм наследственных дистрофий сетчатки. Было описано и принято несколько протоколов для дифференцировки ПСК in vitro в типы клеток сетчатки. Большинство из них связано с использованием питательной среды, содержащей сложные коктейли рекомбинантных факторов роста, добавок, малых молекул и реагентов, таких как: добавки N1, N2 и B27; блокираторы сигналов BMP и TGFβ, такие как Noggin, SB431542, LDN193189 и Follistatin, или индукторы, такие как Activin A, Lefty и IDE1; канонические блокираторы сигналов Wnt, такие как DKK1, SFRP, IWP-2 и IWR-1-endo, или индукторы, такие как CHIR99021, SB216763 и CKI-7; блокаторы сигналов рецептора FGF, такие как PD0325901 и PD173074, или индукторы, такие как bFGF; ингибиторы передачи сигналов надрезов, такие как DAPT; другие сигнальные молекулы, такие как инсулиноподобный фактор роста (IGF-1); ретиноевая кислота; гормоны роста, такие как трийодтиронин (Т3) и гидрокортизон; а также антиоксиданты и другие факторы, способствующие выживанию, такие как аскорбиновая кислота, никотинамид, таурин, докозагексаеновая кислота, 1-тиоглицерин и т. Д. Эти компоненты включаются в питательную среду на разных стадиях дифференцировки стволовых клеток для стимуляции или модуляции различных сигнальных каскадов, чтобы индуцировать приверженность линии глаза и сетчатки 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22.

Здесь описан более простой, надежный и эффективный метод генерации органоидов сетчатки непосредственно из почти сливающихся, адгезивных культур hiPSCs. Упрощенный протокол включает в себя использование меньшего количества добавок, факторов роста и малых молекул, которые в первую очередь вызывают первоначальную дифференцировку ПСК в нейроэктодермальную линию. Последующие этапы дифференцировки опираются на врожденную способность ПСК синхронно дифференцироваться в клеточный тип родственных линий, которые затем самоорганизуются и взаимно регулируют развитие и пространственную организацию нескольких типов клеток, которые способствуют образованию сложных тканей. Постепенная отмена bFGF и добавление Ноггина помогают в успешной индукции ранней нейроэктодермальной судьбы в течение 3 дней после дифференцировки. Постоянное поддержание культур дифференцировки в нейроиндуцирующем RDM без добавления каких-либо факторов роста или малых молекул приводит к индукции первичных структур поля глаза (EFP) с четкими краями в течение 3-4 недель после дифференцировки. EFP содержат мультипотентные клетки-предшественники, которые при ненарушенном и постоянном поддержании приводят к многолинейной дифференцировке и самосборке с образованием сложных EFP, состоящих из центрально расположенных нейроретинальных чашек или оптических чашек (OC), окруженных другими родственными типами глазных клеток, такими как пигментный эпителий сетчатки (RPE), эпителий нервного гребня и эпителий поверхности глаза. В качестве альтернативы ПСК можно выращивать в виде суспензионных культур с 1-3 дня до образования ЭБ в идентичных условиях культивирования. ЭБ могут быть дополнительно нанесены на 4-й день и выращены в виде адгезивных культур на поверхностях с матричным покрытием в RDM, чтобы инициировать дифференцировку линии сетчатки, как описано выше. Здоровые дифференцирующие культуры обычно дают около 20-30 EFP на лунку 6-луночной пластины. ОК могут быть собраны из EFP через 3-4 недели дифференцировки сетчатки и выдерживаются в суспензионных культурах в течение следующих 30-60 дней, чтобы обеспечить дифференцировку предшественников нейроретинальности и образование зрелых органоидов сетчатки. После 4 недель культивирования суспензии около 70-80% оптических чашек, отобранных из EFP, остаются нетронутыми, сохраняют свое ламинирование и развиваются в зрелые органоиды сетчатки (OC-2M) с фоторецепторными клетками, коммитированными RCVRN+ и CRX+, и внутренними сегментообразными расширениями в самых внешних слоях.

Слияние растущих культур iPSC имеет решающее значение во время начала дифференциации и перевода культур в DIM. Культуры с меньшими колониями и слиянием ниже 60%, а также те, которые преждевременно дифференцируются, приводят к значительному снижению численности EFP. Когда появляются скопления глазных полей, центральный островок нейроретинальных чашек должен быть собран в течение 1 недели. Это можно сделать, осторожно подталкивая и поднимая неповрежденные чашки, используя угол или изогнутую область стеклянного капиллярного наконечника, вытянутого пламенем, как описано в разделе протокола. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить чашки. Дальнейшие задержки в сборе приведут к уплощению и потере 3D-организации из-за пролиферации и миграции нейроретинальных клеток-предшественников, что затрудняет сбор урожая и приводит к атипичным органоидам сетчатки.

Эффективность индукции глазного поля и созревания чашек сетчатки варьируется между различными заболеваниями или специфическими для пациента линиями hiPSC, в зависимости от основных генетических дефектов. Например, приверженность линии сетчатки и эффективность формирования EFP специфической для заболевания RP линии были идентичны таковой у здоровых контрольных клеток, тогда как нулевая линия RB1 не смогла сформировать EFP (данные не показаны). Некоторые линии, несущие мутации, связанные с врожденным амаврозом Лебера, сформировали атипичные EFP с дефектами в их размере, самосборке, расслоении и созревании предшественников сетчатки (данные не показаны). Для понимания патофизиологии заболевания потребуются дальнейшие молекулярные проверки и профилирование экспрессии генов специфических для пациента органоидов сетчатки по сравнению со здоровыми контрольными тканями. Учитывая изменчивость геномов пациентов и участие мультигенных сетей в проявлениях заболевания, также может быть важно изучить органоиды сетчатки, полученные из изогенных линий iPSC, чтобы установить абсолютную корреляцию генотипа и фенотипа в исследованиях моделирования заболеваний. Такие изогенные линии могут быть созданы либо путем целевых нокаутов генов в здоровых контрольных линиях, либо путем коррекции патогенных мутаций в специфических для пациента ИПСК с использованием передовых методов редактирования генома 8,9.

Такие интактные органоиды сетчатки, полученные из нормальных или специфических для заболевания линий ИПСК, могут быть использованы для скрининга и тестирования новых лекарств. Предшественники фоторецепторов в органоидах сетчатки и других типах глазных клеток, таких как RPE и эпителий роговицы в выростах EFP, могут быть дополнительно выделены и обогащены для их применения в фундаментальных исследованиях и регенеративной медицине. Описанный здесь протокол может быть легко адаптирован к GMP-совместимым процессам подготовки клеток клинического класса, предназначенных для доклинических и клинических испытаний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все авторы не имеют конфликта интересов или раскрытия финансовой информации.

Acknowledgments

Авторы выражают признательность за научно-техническую поддержку со стороны д-ра Читры Каннабиран, генетика; Д-р Субхадра Джалали, консультант по сетчатке; Доктор Милинд Найк, окулопластический хирург; и д-р Свати Калики, офтальмолог-онколог из Глазного института LV Prasad, Хайдарабад, к созданию нормальных и специфических для пациента линий ИПСК. Авторы признают гранты на исследования и разработки от Совета по научным и инженерным исследованиям, Департамента науки и технологий (IM), (SB/SO/HS/177/2013), Департамента биотехнологии (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019) и старших научных стипендий от ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) и CSIR (V.K.P.), правительство Индии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Syringe filters TPP 99722 
15 mL centrifuge tube TPP 91015
50 mL centrifuge tube TPP 91050
6 well plates TPP 92006
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal Santa Cruz SC365519 1:50 dilution
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal Abcam ab140603 1:300 dilution
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal Abcam ab3201 1:250 dilution
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal      Millipore AB5585 1:300 dilution
B-27 Supplement (50x), serum free Thermo Fisher 17504044
Basic Fibroblast growth factor (bFGF) Sigma Aldrich F0291
Centrifuge 5810R Eppendorf
Coplin Jar (50 mL) Tarson
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix Corning 354277
CryoTubes Thermo Fisher V7884
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) Thermo Fisher 10565-018
DreamTaq DNA polymerase Thermo Fisher EP0709
Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 14190144
Essential 8 medium kit Thermo Fisher A1517001
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma Aldrich E5134
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm  Corning 351007
Fetal Bovine Serum, qualified, United States  Gibco 26140079
GelDocXR+ with Image lab software BIO-RAD Agarose Gel documentation system 
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher 35050061
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 1:300 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 Invitrogen A11030 1:300 dilution
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 Invitrogen A11035 1:300 dilution
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 1:300 dilution
HistoCore MULTICUT Leica For sectioning
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher 10828028
L-Acsorbic acid Sigma Aldrich A92902
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher 11140-050
N2 supplement (100x) Thermo Fisher 17502048
NanoDrop 2000 Thermo Fisher To quantify RNA
Paraformaldehyde Qualigens 23995
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged Corning 7095D-9
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher 15140-122
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal Abcam ab183951 1:300 dilution
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal Abcam ab195045 1:300 dilution
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal Abcam ab231782 1:300 dilution
Recombinant Human Noggin Protein R&D Systems 6057-NG
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
Serological pipettes 10 mL TPP 94010
Serological pipettes 5 mL TPP 94005
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Sodium Citrate Tribasic dihydrate Sigma Aldrich S4641
Starfrost (silane coated) microscopic slides Knittel
SuperScript III First-Strand Synthesis System Thermo Fisher 18080051
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Invitrogen 18080051
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
TRIzol Reagent Invitrogen 15596026
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI  Vector laboratories H-1200 
Vitronectin Thermo Fisher A27940
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) Sigma Aldrich Y0503
Zeiss LSM 880 Zeiss Confocal microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
  2. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  3. Sen, P., et al. Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years. Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).
  4. Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. Trend of retinal diseases in developing countries. Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).
  5. RetNet - Retinal Information Network. , Available from: https://sph.uth.edu/retnet/ (2022).
  6. Cicero, S. A., et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).
  7. Guo, Y., et al. Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361 (2019).
  8. Lane, A., et al. Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids. Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).
  9. Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).
  10. Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
  11. Meyer, J. S., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).
  12. Zhu, J., Lamba, D. A. Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (12), 2882 (2018).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  14. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  15. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
  16. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
  17. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  18. Chichagova, V., et al. Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95 (2019).
  19. Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal. STAR Protocols. 1 (1), 100033 (2020).
  20. Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
  21. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  22. Mellough, C. B., et al. IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).
  23. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).

Tags

Биология развития выпуск 190 стволовые клетки ИПСК дифференцировка сетчатки зачаток глазного поля органоиды сетчатки пигментный эпителий сетчатки
Генерация органоидов сетчатки из здоровых плюрипотентных стволовых клеток, вызванных заболеваниями сетчатки человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mahato, S., Agrawal, T., Pidishetty, … More

Mahato, S., Agrawal, T., Pidishetty, D., Maddileti, S., Pulimamidi, V. K., Mariappan, I. Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (190), e64509, doi:10.3791/64509 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter