Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Differenzierung von hiPS-Zellen in Augenfeld-Cluster und zur Erzeugung neuro-retinaler Organoide unter Verwendung vereinfachter Kulturbedingungen, die sowohl adhärente als auch Suspensionskultursysteme umfassen. Auch andere Augenzelltypen, wie das RPE und das Hornhautepithel, können aus reifen Augenfeldern in Netzhautkulturen isoliert werden.
Abstract
Pluripotente Stammzellen können komplexe Gewebeorganoide erzeugen, die für In-vitro-Studien zur Modellierung von Krankheiten und für die Entwicklung regenerativer Therapien nützlich sind. Dieses Protokoll beschreibt eine einfachere, robuste und schrittweise Methode zur Erzeugung retinaler Organoide in einem hybriden Kultursystem, das aus adhärenten Monolayerkulturen besteht, während der ersten 4 Wochen der Netzhautdifferenzierung bis zum Auftreten von ausgeprägten, selbstorganisierten Augenfeld-Primordialclustern (EFPs). Darüber hinaus werden die Donut-förmigen, kreisförmigen und transluzenten neuro-retinalen Inseln innerhalb jedes EFP manuell gepflückt und unter Verwendung von nicht-adhärenten Kulturschalen in einem retinalen Differenzierungsmedium für 1-2 Wochen kultiviert, um mehrschichtige 3D-Optikschalen (OC-1M) zu erzeugen. Diese unreifen retinalen Organoide enthalten PAX6+ und ChX10+ proliferierende, multipotente retinale Vorläufer. Die Vorläuferzellen sind innerhalb der Organoide linear selbstorganisiert und erscheinen als ausgeprägte radiale Streifen. 4 Wochen nach der Suspensionskultur durchlaufen die retinalen Vorläuferzellen einen postmitotischen Arrest und eine Abstammungsdifferenzierung, um reife retinale Organoide (OC-2M) zu bilden. Die Vorläufer der Photorezeptorlinie entwickeln sich in den äußersten Schichten der retinalen Organoide. Diese CRX+- und RCVRN+-Photorezeptorzellen reifen morphologisch heran und zeigen innere segmentartige Fortsätze. Diese Methode kann zur Erzeugung retinaler Organoide unter Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) eingesetzt werden. Alle Schritte und Verfahren werden klar erklärt und demonstriert, um die Replizierbarkeit zu gewährleisten und für breitere Anwendungen in der Grundlagenforschung und translationalen Forschung zu sorgen.
Introduction
Die Netzhaut ist ein lichtempfindliches Gewebe im hinteren Teil des Wirbeltierauges, das Lichtsignale durch ein biochemisches Phänomen, das als Phototransduktionsweg bekannt ist, in Nervenimpulse umwandelt. Die anfänglichen Nervenimpulse, die in den Photorezeptorzellen der Netzhaut erzeugt werden, werden an andere retinale Interneuronen und retinale Ganglienzellen (RGCs) weitergeleitet und erreichen den visuellen Kortex des Gehirns, was bei der Bildwahrnehmung und der visuellen Reaktion hilft.
Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) sind schätzungsweise 1,5 Millionen Kinder blind, davon 1 Million in Asien. Die erbliche Netzhautdystrophie (IRD) ist eine schwere Erblindungserkrankung, von der weltweit 1 von 4.000 Personen betroffen ist 1,2,3, während die Prävalenz der Erblindung im Zusammenhang mit altersbedingter Makuladegeneration (AMD) in Entwicklungsländern zwischen 0,6 % und 1,1 % liegt 4. IRDs werden durch vererbte genetische Defekte in über 300 verschiedenen Genen verursacht, die an der Entwicklung und Funktion der Netzhaut beteiligt sind5. Solche genetischen Veränderungen führen zu einer Störung der normalen Netzhautfunktionen und einer allmählichen Degeneration der Netzhautzellen, nämlich der Photorezeptorzellen und des retinalen Pigmentepithels (RPE), was zu schwerem Sehverlust und Erblindung führt. Enorme Fortschritte wurden bei anderen Erblindungszuständen erzielt, die die Hornhaut, die Linse usw. betreffen. Für Netzhautdystrophien und Sehnervenatrophien gibt es bisher jedoch keine bewährte Therapie. Da eine erwachsene menschliche Netzhaut keine Stammzellenbesitzt 6, können alternative Quellen wie embryonale Stammzellen (ES-Zellen) und patienteneigene induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) einen unbegrenzten Vorrat an gewünschten Zelltypen bereitstellen und sind vielversprechend für die Entwicklung komplexer Gewebeorganoide, die für In-vitro-Studien zur Modellierung von Krankheiten und für die Entwicklung regenerativer Therapien erforderlich sind7. 8,9,10.
Mehrere Jahre Netzhautforschung haben zu einem besseren Verständnis der molekularen Ereignisse geführt, die die frühe Entwicklung der Netzhaut orchestrieren. Die meisten Protokolle zur Erzeugung von Netzhautzellen und 3D-Organoiden aus PSCs zielen darauf ab, diese Entwicklungsereignisse in vitro zu rekapitulieren, indem die Zellen in einem komplexen Cocktail aus Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen kultiviert werden, um die bekannten biologischen Prozesse schrittweise zu modulieren. Die so erzeugten retinalen Organoide bestehen aus den wichtigsten Netzhautzellen: retinalen Ganglienzellen (RGCs), Interneuronen, Photorezeptoren und retinalem pigmentiertem Epithel (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Trotz erfolgreicher Versuche, IRDs mit retinalen Organoiden zu modellieren, stellt die Notwendigkeit des komplexen Cocktails aus Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen während der Differenzierung und die relativ geringe Effizienz der retinalen Organoidgenerierung eine große Herausforderung für die meisten Protokolle dar. Sie beinhalten hauptsächlich die Bildung von Embryoidkörpern, gefolgt von ihrer schrittweisen Differenzierung in retinale Linien unter Verwendung komplexer Kulturbedingungen in verschiedenen Stadien der In-vitro-Entwicklung 20,21,22.
In dieser Arbeit wird über eine vereinfachte und robuste Methode zur Entwicklung komplexer 3D-Neuro-Retina-Organoide aus gesunden Kontroll- und Netzhauterkrankungs-spezifischen hiPS-Zellen berichtet. Das hier beschriebene Protokoll nutzt die direkte Differenzierung von nahezu konfluenten hiPSC-Kulturen, ohne dass eine Embryoidkörperbildung erforderlich ist. Außerdem wird die Komplexität des Nährmediums vereinfacht, was es zu einer kostengünstigen und reproduzierbaren Technik macht, die von neuen Forschern leicht übernommen werden kann. Es handelt sich um ein hybrides Kultursystem, das aus adhärenten Monolayer-Kulturen während der ersten 4 Wochen der Netzhautdifferenzierung bis zur Entstehung von ausgeprägten, selbstorganisierten Augenfeld-Primordial-Clustern (EFPs) besteht. Darüber hinaus werden die zirkulären neuro-retinalen Inseln innerhalb jedes EFP manuell gepflückt und für 1-2 Wochen in Suspensionskulturen gezüchtet, um mehrschichtige 3D-Netzhautschalen oder Organoide herzustellen, die aus PAX6+ und CHX10+ proliferierenden neuroretinalen Vorläufern bestehen. Eine ausgedehnte Kultivierung von retinalen Organoiden in 100 μM taurinhaltigem Medium für weitere 4 Wochen führte zur Entstehung von RCVRN+ und CRX+ Photorezeptorvorläufern und reifen Zellen mit rudimentären inneren segmentartigen Fortsätzen.
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Protocol
Alle Experimente mit hiPS-Zellen wurden aseptisch, unter Einhaltung der Standardlaborpraktiken, ethischen und biologischen Sicherheitsrichtlinien und mit den Genehmigungen von Aufsichtsbehörden wie dem Institutional Ethics Committee (IEC), dem Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR) und dem Institutional Bio-Safety Committee (IBSC) durchgeführt.
1. Präparation der iPSC-Kultur und des retinalen Differenzierungsmediums und der Reagenzien
- iPSC-Kultur und Erhaltungsmedium
- Kultivieren und erhalten Sie die normale hiPSC-Linie23 (hiPSC-F2-3F1) und eine CRISPR-editierte, RB1-/- hiPSC-Linie (LVIP15-RB1-CS3, mit biallelischer Frameshift-Deletion von 10 bp innerhalb des Exons 18 des humanen RB1-Gens) in Essential 8 Medium auf matrigelbeschichteten (Basalmembranmatrix beschichtet; siehe Materialtabelle) Kulturplatten unter feederfreien Kulturbedingungen.
HINWEIS: Dieses Protokoll kann vollständig xenofrei gemacht werden, indem die Basalmembranmatrix durch die rekombinante Vitronektinbeschichtung (VTN-N) ersetzt wird. Bereiten Sie das komplette Essential 8 Medium vor, indem Sie 50x Essential 8 Supplement (im Lieferumfang des Essential 8 Medium Kits; siehe Materialtabelle) und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin-Lösungen hinzufügen. Alternativ können die hiPSCs auch mit dem kompletten mTeSR1-Medium kultiviert werden.
- Kultivieren und erhalten Sie die normale hiPSC-Linie23 (hiPSC-F2-3F1) und eine CRISPR-editierte, RB1-/- hiPSC-Linie (LVIP15-RB1-CS3, mit biallelischer Frameshift-Deletion von 10 bp innerhalb des Exons 18 des humanen RB1-Gens) in Essential 8 Medium auf matrigelbeschichteten (Basalmembranmatrix beschichtet; siehe Materialtabelle) Kulturplatten unter feederfreien Kulturbedingungen.
- Zelldissoziationslösung (1x CDS)
- Für eine enzymfreie Dissoziation und Passage von humanen iPS-Zellen wird das CDS mit 0,5 mM EDTA, pH 8,0 und 30 mM NaCl in 1x Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) hergestellt (siehe Materialtabelle).
- Um 100 ml 1x CDS herzustellen, geben Sie 100 μl 0,5 M EDTA und 1 ml 3 M NaCl-Stammlösungen zu 99 mL 1x DPBS, mischen Sie gut und filtern Sie es mit einem 0,22 μm-Filter.
- Differenzierungs-Induktionsmedium (DIM)
- Bereiten Sie DIM mit DMEM-F12 Basalmedium vor, ergänzt mit 10 % Knockout-Serumersatz (KOSR), 1x nicht-essentieller Aminosäure (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin, 200 μM L-Ascorbinsäure und 1 % N2-Supplement (siehe Materialtabelle).
- Retinales Differenzierungsmedium (RDM)
- Bereiten Sie RDM mit DMEM-F12 Basalmedium zu, ergänzt mit 10 % Knockout-Serum (KOSR), 1x nicht-essentieller Aminosäure (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin, 200 μM L-Ascorbinsäure und 2 % B27-Ergänzung (mit Vitamin A) (siehe Materialtabelle).
- Extrazelluläre Matrix-beschichtete Zellkulturoberflächen
- Tauen Sie die hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix über Nacht in einem Eiskübel, vorzugsweise im Kühlschrank bei 4-8 °C, auf. Verdünnen Sie das aufgetaute 100-fache Matrixmaterial (5 ml) im Verhältnis 1:5 durch Zugabe von 20 ml eiskaltem DMEM-F12-Basalmedium und mischen Sie es durch leichtes Schwenken, um eine 20-fache Stammlösung herzustellen.
- Bereiten Sie 0,5-ml-Aliquots auf Eis mit vorgekühlten Pipettenspitzen und sterilen Mikrozentrifugenröhrchen vor. Beschriften Sie die Fläschchen als 20x Vorräte und lagern Sie sie gefroren in einem -80 °C Gefrierschrank für bis zu 6 Monate.
- Für die Beschichtung der Zellkulturoberflächen (Kulturschalen oder 6-Well-Platten) wird ein Aliquot von 20x Matrix auf Eis aufgetaut und im Verhältnis 1:20 mit eiskaltem DMEM-F12 Basalmedium verdünnt, um 10 mL 1x Matrix-Coating-Lösung herzustellen, was ausreicht, um eine 100-mm-Schale oder eine 6-Well-Platte (1,5 mL/Well) zu beschichten.
Anmerkungen: Kühlen Sie die Pipetten/Mikrospitzen vor, indem Sie eiskaltes und steriles DPBS absaugen, bevor Sie die Matrixlösung anfassen. Das Auftauen und die gesamte Handhabung der Matrix muss auf Eis erfolgen, wobei vorgekühlte Pipetten/Mikrospitzen verwendet werden, um eine Polymerisation und Gelierung bei Raumtemperatur zu vermeiden. - Geben Sie 1,5 ml 1x Matrix-Beschichtungslösung in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte, schwenken Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Beschichtung zu gewährleisten, und inkubieren Sie die Platten bei 37 °C in einem 5%igen CO2 - Inkubator. Lassen Sie die Platten mindestens 1 h ungestört, um eine gleichmäßige Beschichtung der Matrix auf den Kulturoberflächen zu gewährleisten.
- Vor dem Aussäen der Zellen saugen Sie die Beschichtungslösung mit einer sterilen 5-ml-Pipette ab und entsorgen Sie die flüssigen Abfälle. Fügen Sie sofort frisches Nährmedium hinzu (2 ml/Well einer 6-Well-Platte) und besäen Sie die Zellen mit einer Dichte von 150.000-200.000 Zellen/Well. Lassen Sie die Platten während der Handhabung nicht trocknen.
HINWEIS: Alternativ kann eine rekombinante Vitronektinbeschichtung (VTN-N) mit einer Endkonzentration von 0,5 μg/ml für ein xenofreies Kulturprotokoll verwendet werden.
- Tauen Sie die hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix über Nacht in einem Eiskübel, vorzugsweise im Kühlschrank bei 4-8 °C, auf. Verdünnen Sie das aufgetaute 100-fache Matrixmaterial (5 ml) im Verhältnis 1:5 durch Zugabe von 20 ml eiskaltem DMEM-F12-Basalmedium und mischen Sie es durch leichtes Schwenken, um eine 20-fache Stammlösung herzustellen.
2. Etablierung humaner iPSC-Kulturen
- Auftauen und Wiederbelebung hiPS-Zellen
- Eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 1x Membranmatrixlösung bestreichen. Bei 37 °C 1 h inkubieren, um eine Polymerisation und eine gleichmäßige Beschichtung der Kulturoberfläche zu ermöglichen.
- Entfernen Sie nach 1 Stunde Inkubation die Überzugslösung und fügen Sie 1 ml vorgewärmtes komplettes Essential 8-Medium hinzu, das 10 μM Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 (1 μl/ml 10 mM Stamm; siehe Materialtabelle) enthält, bevor die Zellen wiederbelebt werden.
- Nehmen Sie einen hiPSC-Kryovorrat (1 x 10,6 Zellen/Durchstechflasche) aus dem Flüssigstickstoffbehälter. Tauen Sie das Kryoial in einem 37 °C warmen Wasserbad unter leichtem Schwenken schnell auf.
Anmerkungen: Tauen Sie die Durchstechflasche nicht vollständig auf. Notieren Sie sich die Durchgangsnummer, sterilisieren Sie die Durchstechflasche auf der Oberfläche und wischen Sie sie mit einem fusselfreien Tupfer trocken, der 70 % Isopropylalkohol enthält. - Saugen Sie den Kryoinhalt mit einer sterilen 1-ml-Pipettenspitze in ein frisches 15-ml-Röhrchen auf, das aus 2 ml vorgewärmtem Essential 8-Medium ohne Y-27632 besteht. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1.000 x g für 4 min bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1,0 ml des kompletten Essential 8-Mediums, das 10 μM Y-27632 enthält.
- Geben Sie diese Zellsuspension auf die matrixbeschichteten Oberflächen, ohne die Matrix zu stören, indem Sie sie entlang der Wände dosieren. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig über Kreuz, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.
- Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 -Gehalt, damit die Zellen anhaften und mit der Vermehrung beginnen können.
- Ersetzen Sie nach 12-24 Stunden das verbrauchte Medium und bewahren Sie die Kulturen in vorgewärmtem Essential 8-Medium ohne Y-27632 auf.
- Wechseln Sie das Nährmedium alle 24 Stunden und durchlaufen Sie die Kulturen, sobald sie eine Konfluenz von 70%-80% erreicht haben.
HINWEIS: Ein Split-Verhältnis von 1:6 wird routinemäßig für hiPSC-Kulturen befolgt und in regelmäßigen Abständen von 3-4 Tagen durchgeführt.
- Passage und Plattierung von hiPS-Zellen zur Initiierung der Differenzierung der retinalen Abstammungslinie
- Aspirieren Sie das verbrauchte Medium aus 70%-80% konfluenten humanen iPSC-Kulturen in 6-Well-Platten.
- 1 ml CDS (Schritt 1.2) in jede Vertiefung geben und bei 37 °C 5-7 min inkubieren, bis sich die Zellen aufgerundet haben. Entfernen Sie das CDS vorsichtig und achten Sie darauf, dass sich die Zellen nicht lösen, und fügen Sie 2 ml frisches Essential 8-Medium hinzu und verreiben Sie es vorsichtig mit einer Pipette.
- Sammeln Sie die Zellsuspension aus einer Vertiefung einer 6-Zell-Platte in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und schleudern Sie das Röhrchen bei 1.000 x g für 4 Minuten bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1,2 ml des Mediums Essential 8 und geben Sie 200 μl der 200 μl der Zellsuspension (Teilungsverhältnis 1:6) in jede Vertiefung einer matrixbeschichteten 6-Well-Platte, die 1,5 ml iPSC-Nährmedium enthält, das 10 μM Y-27632 enthält, wie in Schritt 1.5 beschrieben.
- Ersetzen Sie nach 12-24 Stunden das verbrauchte Medium und bewahren Sie die Kulturen in vorgewärmtem Essential 8-Medium ohne Y-27632 auf.
- Wechseln Sie das Nährmedium alle 24 Stunden, bis die Kulturen eine Konfluenz von 70%-80% erreicht haben.
3. Differenzierung von hiPS-Zellen in Augenfelder und Netzhautlinie
HINWEIS: Eine schematische Darstellung des Differenzierungsprozesses ist in Abbildung 1 dargestellt.
- Leiten Sie das Differenzierungsverfahren ein, sobald die hiPSC-Kulturen eine Konfluenz von 70%-80% erreicht haben.
- Wechseln Sie an Tag 0 das hiPSC-Erhaltungsmedium auf DIM (Schritt 1.3), das 1 ng/ml bFGF und 1 ng/ml Noggin enthält. Fügen Sie 2,0 ml Medium pro Well einer 6-Well-Platte hinzu und halten Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5%igen CO2 -Inkubator.
ANMERKUNG: Der allmähliche Entzug von bFGF induziert die Differenzierung von PSCs, und die Zugabe steigender Konzentrationen von Noggin (Inhibitor mehrerer BMPs) während der Anfangsstadien induziert eine ektodermale Differenzierung und Neuralisierung11,12 und blockiert die Bindung von Mesoderm und Endoderm. Alternativ kann Noggin durch LDN193189 ersetzt werden. Im Gegensatz zu der zuvor berichteten dualen SMAD-Inhibitionsstrategie20,21 erfordert dieses Protokoll nicht die Zugabe von Activin oder SB-431542. - Wechseln Sie an Tag 1 das verbrauchte Medium und fügen Sie DIM hinzu, das 1 ng/ml bFGF und 10 ng/ml Noggin enthält. Fügen Sie 2,0 ml pro Well einer 6-Well-Platte hinzu. Inkubieren und halten Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator.
- Entfernen Sie am 2. und 3. Tag das verbrauchte Medium und fügen Sie DIM hinzu, das nur 10 ng/ml Noggin enthält. Fügen Sie 2,0 ml pro Well einer 6-Well-Platte hinzu und wechseln Sie das Medium alle 24 h. Inkubieren und halten Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator.
HINWEIS: Erwärmen Sie das Nährmedium vor Gebrauch immer auf 30-37 °C. Überschüssige Floater und tote Zellen können in frühen Differenzierungskulturen beobachtet werden. Waschen Sie die Kulturen unter solchen Bedingungen einmal mit 1x DPBS und fügen Sie das retinale Differenzierungsmedium hinzu. Sterilitätstests auf dem verbrauchten Medium können wöchentlich oder nach Bedarf durchgeführt werden. - Entfernen Sie an Tag 4 das verbrauchte Medium und fügen Sie das RDM hinzu (Schritt 1.4). Fügen Sie 2,0 ml pro Well einer 6-Well-Platte hinzu und halten Sie die Kulturen in RDM bei 37 °C in einem 5%igen CO2 -Inkubator mit täglichem Wechsel des frischen Mediums weiter.
HINWEIS : Alternativ können die PSCs von Tag 1-3 als Suspensionskulturen in nicht adhärenten 96-Well-Platten mit rundem Boden bei einer Zelldichte von 5 x 103 Zellen/100 μL/Well gezüchtet werden, um Embryoid Bodies (EBs) unter identischen Kulturbedingungen in DIM zu bilden. Wohlgeformte EBs an Tag 4 können auf matrixbeschichtete Platten mit RDM plattiert werden und haften vermehren und differenzieren wie unten beschrieben. - Etwa an Tag 14-18 werden die Kulturen unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung auf das Entstehen von neuronalen rosettenartigen Domänen beobachtet, die aus frühen Vorläuferzellen des Augenfeldes bestehen (Abbildung 2B).
- Etwa am 21. und 28. Tag (3-4 Wochen) werden Kulturen unter dem Mikroskop bei 4- und 10-facher Vergrößerung beobachtet, um die Entstehung selbstorganisierter, unterschiedlicher EFPs zu beobachten, mit einer zentralen Insel aus kreisförmigen 3D-neuro-retinalen Strukturen, die von zusammenhängenden Auswüchsen des Neuroepithels und des Augenoberflächenepithels umgeben sind (Abbildung 2C, D).
HINWEIS: Etwa 20-30 EFPs können pro Well einer 6-Well-Platte einer normalen hiPSC-Netzhautdifferenzierungskultur beobachtet werden. Diese Zahl kann mit anderen krankheitsspezifischen hiPSC-Linien variieren, basierend auf ihrem genetischen Hintergrund und dem Differenzierungspotenzial der Netzhaut.
4. Gewinnung von Netzhaut-Organoiden
- Flammenziehen von Pasteurpipetten aus Glas zur manuellen Entnahme von Netzhautbechern.
Anmerkungen: Verwenden Sie autoklavierte und sterile Pasteurpipetten aus Glas für die Augenfeldentnahme.- Schalten Sie einen Bunsenbrenner ein. Nehmen Sie eine sterile Pasteurpipette und halten Sie die Basis in der einen Hand und die Kapillarspitze in der anderen. Flammsterilisieren und erhitzen Sie den Bereich nahe der Mitte der Kapillarspitze mit Rotationsbewegungen, bis das Glas biegsam wird. Entfernen Sie sich dann von der Flamme und ziehen Sie sie schnell nach außen, um eine feine Kapillarspitze mit geschlossenem Lumen zu erzeugen.
- Halten Sie die feine Spitze waagerecht vor die Flamme und führen Sie sie schnell in einer nach außen gerichteten Bewegung durch die Flamme, um einen glatten Haken oder eine L-förmige Kapillarspitze zu erzeugen.
- Verwenden Sie die glatte äußere Krümmungszone des Kapillarhakens als feine Schaufel, um die intakten neuroretinalen Schalen sanft anzuheben und von den EFP-Clustern zu lösen.
Anmerkungen: Der glatte Winkel des Glaskapillarhakens verursacht weder Schäden an den Zellen noch Kratzer auf den Kulturoberflächen. Dieses einfache Werkzeug kann auch effektiv für die Aufspaltung einzelner hiPSC-Kolonien in Gittermustern und für die Weitergabe als kleine Zellcluster während der klonalen Expansion verwendet werden.
- Kultivierung und Pflege von Netzhautschalen zur Erzeugung von 3D-Netzhautorganoiden.
- An Tag 25-30 werden 4,0 ml vorgewärmtes retinales Differenzierungsmedium in eine 60-mm-Schale mit niedrigem Ansatz gegeben, bevor Sie sich auf die Ernte der neuroretinalen Becher vorbereiten.
- Arbeiten Sie unter einem Stereomikroskop mit 0,63- bis 4,5-facher Vergrößerung, um wohlgeformte neuroretinale Schalen von einzelnen EFPs zu beobachten und manuell zu entnehmen.
HINWEIS: Das Auftreten von pigmentierten RPE-Zellauswüchsen hilft bei der einfachen Identifizierung von EFPs und den zentral platzierten Neuro-Retinal-Cups. Die Netzhautschalen erscheinen als Donut-förmige, kreisförmige und durchscheinende 3D-Strukturen mit deutlichen radialen Streifen, die von den linear angeordneten und selbstorganisierten Netzhautstammzellen gebildet werden, im Gegensatz zu den dicht gepackten und kugelförmigen oder unregelmäßigen Clustern, die von den ZNS-Neuronen oder den Neuralleistenzellengebildet werden 23. - Verwenden Sie die flammengezogenen Pasture-Pipettenhaken, um die zentrale neuroretinale Insel in den einzelnen EFPs vorsichtig anzustoßen und auszuschöpfen.
- Stellen Sie eine 1-ml-Mikropipette auf 100 μl ein und verwenden Sie 1-ml-Mikrospitzen mit breiten Bohrungsöffnungen, um die schwimmenden Netzhautbecher anzusaugen und in die frischen, niedrig anhaftenden Kulturschalen zu überführen, die in Schritt 4.2.1 zubereitet wurden.
Anmerkungen: Die Verwendung von Spitzen mit einer kleineren Bohrung und einem höheren Saugdruck kann zu Scherung führen und die Integrität der Netzhautschalen beeinträchtigen. Die ungefähren Abmessungen der Netzhautschalen betragen etwa 1-2 mm im Durchmesser. - Bewahren Sie die Netzhautschalen als nicht-adhärente Suspensionskulturen in RDM auf und inkubieren Sie sie bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator.
- Tag 30-45: Wechseln Sie das Medium täglich, indem Sie die Schale vorsichtig kippen und die Netzhautbecher etwa 30 Sekunden lang ruhen lassen. Befolgen Sie eine Teilzufuhrmethode, bei der die Hälfte des verbrauchten Mediums entfernt und durch gleiche Mengen des Frischmediums ersetzt wird.
Anmerkungen: Vermeiden Sie wiederholtes Absaugen und Übertragen, um Schäden an den Netzhautschalen zu vermeiden. Nach 1-2 Wochen Suspensionskultur wachsen die Netzhautschalen leicht an Größe (1-3 mm) und entwickeln sich zu selbstorganisierten 3D-Netzhautorganoiden (OC-1M), die aus linear angeordneten, frühen neuroretinalen Vorläuferzellen bestehen, die PAX6 und CHX10 exprimieren (Abbildung 3Bi). - Tag 45-60: Kultivieren Sie die retinalen Organoide für weitere 4 Wochen in RDM mit 100 μM Taurin (siehe Materialtabelle), um ein besseres Überleben und eine bessere Abstammungsdifferenzierung der neuroretinalen Vorläuferzellen und die Entwicklung eines reifen Netzhautzelltyps (OC-2M) zu unterstützen.
HINWEIS: Etwa 70%-80% der Netzhaut- oder Sehschalen, die von EFPs entnommen werden, bleiben intakt, behalten ihre Laminierung bei und entwickeln sich nach 4 Wochen Suspensionskultur (OC-2M) zu reifen Netzhautorganoiden. - Vergewissern Sie sich, dass die reifen Netzhautorganoide nach 4 Wochen Suspensionskultur das Auftreten von RCVRN+- und CRX+-Photorezeptorvorläufern und reifen Zellen mit einer rudimentären inneren segmentartigen Ausdehnung in den äußersten Zellschichten zeigen, wodurch der normale Entwicklungs- und Reifungsprozess der Netzhaut in vitro rekapituliert wird (Abbildung 3Bii).
HINWEIS: Nach der Entnahme der neuroretinalen Schalen können die Differenzierungskulturen im RDM kontinuierlich aufrechterhalten werden. Die proximalen Epithelauswüchse, die die Neuroretina umgeben, enthalten Vorläufer von retinalen pigmentierten Epithelzellen (RPE), die sich weiter ausdehnen und zu pigmentierten RPE-Monoschichten mit typischer Kopfsteinpflastermorphologie heranreifen (Abbildung 4). Die distalen Auswüchse bestehen überwiegend aus Augenoberflächenepithel, das zur Linse und zumHornhautepithel beiträgt. Gewünschte Zelltypen können aus verschiedenen Zonen von EFP-Auswüchsen geerntet und weiter angereichert werden, um Reinkulturen zu etablieren.
5. Charakterisierung retinaler Organoide
- Morphologische und molekulare Charakterisierung
- Beobachten Sie die adhärenten EFPs und schwimmenden Netzhautorganoide unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 4- und 10-facher Vergrößerung und dokumentieren Sie ihre Morphologie und Dimensionen.
- Sammeln Sie etwa 20 retinale Organoide in verschiedenen Reifungsstadien (Schritte 4.2.3-4.2.6) in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 1.000-μl-Spitzen mit breiter Bohrung. Lassen Sie die Organoide am Boden absetzen und saugen Sie das Medium ab. Waschen Sie die Tassen mit 1x PBS.
- Entfernen Sie das überschüssige PBS und fügen Sie 1,0 ml TRIzol-Reagenz hinzu (siehe Materialtabelle). Bei Raumtemperatur 5 min inkubieren. Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem Röhrchenstößel und verreiben Sie es mit einer 1,0-ml-Pipette.
- Bereiten Sie die Gesamt-RNA vor, indem Sie die Standard-Reagenzienmethode der RNA-Isolierung und -Aufreinigung gemäß den Anweisungen des Herstellers befolgen (siehe Materialtabelle).
- Überprüfen Sie die RNA-Qualität des Agarosegels und quantifizieren Sie diese mit dem NanoDrop-Spektralphotometer (siehe Materialtabelle).
- Wandeln Sie 1-2 μg Gesamt-RNA mit dem Reverse-Transkriptase-Enzym gemäß den Anweisungen des Herstellers in cDNA um (siehe Materialtabelle). In Tabelle 1 finden Sie eine Liste der genspezifischen Primer.
- Kurz wird der RNA-Primer-Mastermix in 10 μl Gesamtvolumen wie in Tabelle 2 beschrieben vorbereitet und das Röhrchen bei 65 °C für 5 min in einem Thermocycler inkubiert. Übertragen Sie den Schlauch aus dem Thermocycler für 2 Minuten auf Eis.
- Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Mastermischung 2 mit den in Tabelle 3 genannten Reagenzien vor. Diese Mastermischung wird in das in Schritt 5.1.7 hergestellte RNA-Primer-Mischungsröhrchen gegeben. Vorsichtig mischen.
- Inkubieren Sie die Probe 50 Minuten lang bei 50 °C, dann 5 Minuten lang bei 85 °C und halten Sie sie dann bei 4 °C, um die Reaktion zu stoppen.
- Verwenden Sie die synthetisierte cDNA als Matrize für PCR-Reaktionen, um die Expression von neuro-retinalen Vorläuferzellen und reifen Netzhautzellmarkern zu überprüfen.
- Normalisieren Sie die gesamten cDNA-Templates jeder Probe, nämlich F2-UD (hiPSC-F2-3F1; undifferenzierte Zellen), OC-1M (1 Woche alter optischer Becher in Suspensionskultur) und OC-2M (4 Wochen alter optischer Becher in Suspensionskultur) durch semiquantitative PCR unter Verwendung der Housekeeping-Gene wie hE1fα oder GAPDH.
- Bereiten Sie den Mastermix für die semiquantitative PCR vor, wie in Tabelle 4 erwähnt, und legen Sie die Probenröhrchen zur Amplifikation in einen Thermocycler. Die Bedingungen für die PCR-Amplifikation sind in Tabelle 5 aufgeführt.
- Histologie und Immunhistochemie
- Die optischen Becher werden in einem 2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt und das überschüssige Medium abgesaugt (Schritte 4.2.3-4.2.6). Spülen Sie die Organoide mit 1x PBS ab und waschen und suspendieren Sie sie dann in 500 μL 4% Paraformaldehyd, um sie über Nacht bei Raumtemperatur zu fixieren.
- Waschen Sie die Tassen am nächsten Tag in deionisiertem Wasser. Lassen Sie die Becher in 95 % Alkohol stehen (drei Wechsel à 15-20 Minuten), gefolgt von 100 % Alkohol (drei Wechsel à 15-20 Minuten), einer 1:1-Mischung aus absolutem Alkohol und Xylol für 15 Minuten, Xylol (zwei Wechsel à 15 Minuten) und Paraffin (drei Wechsel à 15 Minuten). Betten Sie dieses Gewebe ein, um einen Paraffinblock nach Standardverfahren herzustellen. Abkühlen und erstarren lassen.
- Präparation von Dünnschliffen (~4-5 μm Dicke) mit einem Mikrotom und Platzierung auf silanbeschichteten Objektträgern (siehe Materialtabelle) nach histologischen Standardverfahren.
- Zur Entparaffinierung erhitzen Sie die Objektträger bei 70 °C auf einem Heizblock für 15-20 min. Sobald das Wachs geschmolzen ist, waschen Sie die Objektträger mit Xylol (drei Wechsel à 3-4 Minuten), wodurch das Paraffin vollständig entfernt wird.
HINWEIS: Eine unvollständige Entfernung von Paraffin führt zu einer schlechten/fleckigen Färbung von Abschnitten mit einer großen Menge an Hintergrundgeräuschen. - Rehydrieren Sie die Objektträger mit unterschiedlichen Anteilen an Ethanol (100 %, 90 % und 80 %) für jeweils 3 Minuten. Spülen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser ab und fahren Sie mit der Antigenentnahme fort.
- Bevor Sie mit der Antigenentnahme beginnen, erhitzen Sie den Citratpuffer (pH 6,0) in einem Coplin-Glas (siehe Materialtabelle) mit einem Mikrowellenherd, bis er 95-100 °C erreicht hat.
- Tauchen Sie die Objektträger in vorgeheizten Citratpuffer und erhitzen Sie das Glas 15 Minuten lang in der Mikrowelle. Nehmen Sie das Coplin-Glas aus dem Ofen und lassen Sie es bei Raumtemperatur abkühlen.
- Blockieren Sie die Abschnitte für endogene Peroxidase, indem Sie eine 1:1-Mischung aus Methanol und Wasserstoffperoxid für 5 Minuten hinzufügen, gefolgt von dreimaligem Waschen der Abschnitte mit 1x PBS.
- Permeabilisieren Sie die Abschnitte mit 0,5% Triton-X 100 für 15 min. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit 1x PBS.
- Blockieren Sie die unspezifische Bindung des Primärantikörpers, indem Sie die Schnitte mit 10% fötalem Kälberserum (FBS) in 1x PBS für 1 h inkubieren.
- Inkubieren Sie die Schnitte mit Primärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit 1x PBS für jeweils 3-5 min, um den ungebundenen Antikörper zu entfernen.
- Fügen Sie geeignete Fluoreszenzfarbstoff-konjugierte Sekundärantikörper hinzu und inkubieren Sie sie für 45 min. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit 1x PBS für jeweils 3-5 Minuten.
HINWEIS: Die Antikörper und ihre jeweiligen Verdünnungen sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die retinalen Organoidschnitte wurden mit PAX6 und CHX10 immunmarkiert, um frühe neuroretinale Vorläuferzellen zu detektieren, und mit Recoverin und CRX, um engagierte Netzhaut- und Photorezeptorvorläuferzellen zu detektieren. In ähnlicher Weise wurden anti-PAX6 und anti-MITF verwendet, um RPE-Vorläufer zu detektieren, und anti-CRALBP und anti-RPE65 wurden verwendet, um pigmentierte reife RPE-Zellen durch Immunzytochemie von 2D-Monolayerkulturen zu detektieren. - Die Profile mit DAPI oder PI gegenfärben und mit dem Eindeckmittel auf einem Glasobjektträger montieren (siehe Materialtabelle).
- Bildgebung und Dokumentation der immunmarkierten Schnitte von Netzhautorganoiden und RPE-Kulturen mit einem Fluoreszenz- oder konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, um verschiedene Zellschichten zu untersuchen, die unterschiedliche Netzhautmarker exprimieren.
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Representative Results
Die Differenzierung von hiPS-Zellen in Augenlinien wird erreicht, indem die Zellen in verschiedenen Cocktails von Nährmedien, die Nahrungsergänzungsmittel und Wachstumsfaktoren enthalten, in aufeinanderfolgenden Schritten zu verschiedenen Zeitpunkten kultiviert werden, wie in Abbildung 1 beschrieben. Die hiPSC-Kulturen werden in Essential 8 Medium, dem pluripotenten Stammzellerhaltungsmedium, gehalten. Sobald sie eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht haben (Abbildung 2A), wird das Medium an Tag 0 (siehe Schritt 3.2) durch ein Differenzierungs-Induktionsmedium (DIM) ersetzt, das 1 ng/ml bFGF, 1 ng/ml Noggin und 1 % N2-Supplement enthält. Zusammen mit dem neural-induzierenden N2-Präparat spielt Noggin, der BMP-Signalinhibitor, eine entscheidende Rolle bei der Ausrichtung der Zellen auf die neuroektodermale Linie, indem es die mesodermale und endodermale Bindung blockiert. Am 1., 2. und 3. Tag wird die Konzentration von Noggin auf 10 ng/ml erhöht (siehe Schritt 3.3 und3.4). Ab dem 4. Tag wird das DIM durch Retinal Differentiation Medium (RDM) ersetzt (Schritt 3.5), und die Kulturen werden bis zu 30 Tage lang kontinuierlich gepflegt. Das B27 im RDM-Cocktail enthält zusätzliche Nahrungsergänzungsmittel wie mehrere Antioxidantien und D-Galactose, die den aeroben Stoffwechsel fördert und bei der Reduzierung von oxidativem Stress hilft, wodurch die Lebensfähigkeit differenzierender Vorläuferzellen verbessert wird. Darüber hinaus fördert das Vorhandensein von Retinolacetat (Vitamin A) und Wachstumshormonen wie Trijod-I-Thyronin (T3) die Differenzierung von neuronalen und retinalen Linien.
Am 14. bis 18. Tag wird die Bildung von Neuralrosetten beobachtet, die den Beginn der Augenfeldbindung markieren (Abbildung 2B). Die Augenfeldvorläufer innerhalb der neuronalen Rosetten proliferieren weiter und organisieren sich selbst zu unterschiedlichen Augenfeld-Primordial-Clustern (EFPs) mit zirkulären neuro-retinalen Strukturen im Zentrum. Andere Zelltypen wie das retinale pigmentierte Epithel (RPE), das Neuralleistenepithel und diejenigen, die zur Augenoberfläche beitragen, entstehen und wandern als zusammenhängendes Epithel mit gut definierten Rändern aus. Wohlgeformte Augenfelder, wie oben beschrieben, können zwischen dem 21. und 28. Tag der Differenzierung beobachtet werden (Abbildung 2C,D). Die zentrale Insel der neuroretinalen Becher wird zwischen dem 25. und 30. Tag mit einer flammengezogenen Pasteurpipette aus Glas entnommen (Abbildung 2E) und als nicht-adhärente Suspensionskulturen in RDM für weitere 1-2 Wochen, bis zum 45. Tag, aufbewahrt. Die proliferierenden retinalen Vorläuferzellen organisieren sich weiter selbst, um mehrschichtige 3D-Netzhautorganoide mit einem Durchmesser von etwa 2-3 mm zu bilden (Abbildung 2F,G). Ab Tag 46 wird das FDM mit 100 μM Taurin ergänzt, um die Neurogenese zu fördern und das Zellüberleben in Langzeit-Organoidkulturen in vitro zu verbessern (Abbildung 2H).
Retinale Organoide werden in verschiedenen Reifungsstadien für die Expression mehrerer retinaler Vorläufermarker mittels reverser Transkriptions-PCR (RT-PCR) und Immunhistochemie (IHC) charakterisiert. Dazu werden die Organoide am 30. und 60. Tag der Differenzierung zur vollständigen RNA-Isolierung geerntet. Die RT-PCR-Ergebnisse bestätigten die Induktion und Expression von neuro-retinalen Markern wie NEUROD1, ChX10, CRX, PKCß1, RLBP1, RHOK, OPN1SW, RCVRN, ABCA4, RD3 und PDE6C in 1 Woche alten Netzhautorganoiden (4-5 Wochen nach Differenzierung, OC-1M) und 4 Wochen alten Netzhautorganoiden 8,12 (7-8 Wochen nach Differenzierung, OC-2M) (Abbildung 3A). Immunhistochemie und Fluoreszenzbildgebung haben die Expression der frühen retinalen Vorläufermarker PAX6, CHX10 und OTX2 in OC-1M und der reifen retinalen Marker RCVRN und CRX in OC-2Mbestätigt 8,12 (Abbildung 3Bi,ii).
Zusätzlich zu den zentralen neuroretinalen Schalen treten die anderen okulären Zelltypen, wie das retinale pigmentierte Epithel (RPE), das Neuralleistenepithel und die Augenoberflächenepithelzellen, aus den EFPs hervor und wandern aus. Die vom Neuroektoderm abgeleiteten RPE-Vorläuferzellen erscheinen als kompakt angeordnete Epithelzellen, die die EFPs umgeben, die allmählich reifen und entlang der Migrationsränder zwischen dem 30. und 45. Tag pigmentiert werden (Abbildung 4A-C). Diese adhärenten Differenzierungskulturen können daher nach der Entfernung der Netzhautschalen bis zum 45. Tag verlängert werden, um proliferierende RPE-Vorläufer zu ernten (Abbildung 4D), die weiter angereichert werden können, um Monolayerkulturen voll ausgereifter pigmentierter RPE-Zellen herzustellen. Reife pigmentierte RPE können als Monoschichten mit typischer Kopfsteinpflastermorphologie angesehen werden (Abbildung 4E). Die Identität der RPE-Zellen wird außerdem durch Immunzytochemie unter Verwendung von Antikörpern gegen RPE-spezifische Marker wie MITF (RPE-Vorläufermarker), PAX6 (Vorläufer und reifer RPE-Marker) und RPE65 (reifer RPE-Marker) bestätigt10,12 (Abbildung 4F-H).
Aus pluripotenten Stammzellen gewonnene Netzhautorganoide können daher als In-vitro-Modelle für die Untersuchung verschiedener erblicher Netzhauterkrankungen dienen 7,8,9. Krankheitsspezifische Stammzellmodelle werden entweder durch die Generierung patientenspezifischer iPSC-Linien oder durch die Einführung krankheitsspezifischer Mutationen in gesunde Kontroll-iPSC-Linien unter Verwendung des CRISPR-basierten Gen-Editing-Ansatzes entwickelt 7,8. Die mutierten iPS-Zellen können sich je nach den beteiligten Genmutationen effizient in retinale Zelltypen differenzieren oder auch nicht. Während die meisten gesunden Kontrollzelllinien dem oben beschriebenen Zeitplan folgten, kann es bei krankheitsspezifischen iPS-Zellen zu Abweichungen in Bezug auf die Differenzierungszeiträume, die EFP-Morphologie, die Netzhautschalengröße, die Laminierung und die Reifung kommen. Das retinale Differenzierungspotential einer RB1-/- hiPSC-Linie (LVIP15-RB1-CS3), die eine biallelische Deletion von 10 bp im Exon 18 des humanen RB1-Gens trägt, wurde untersucht, was zu einer Frameverschiebung und einem vollständigen Verlust der RB1-Proteinexpression führt. Es wurde beobachtet, dass der Verlust der RB1-Expression keinen Einfluss auf das Auge und die frühe Differenzierung der retinalen Linie der mutierten hiPSC-Linie hatte. Es wurde jedoch eine deutliche Verzögerung der Zeitpläne und eine Verringerung der EFP-Umformeffizienz beobachtet. Die atypischen EFPs, die auftraten, wiesen abnorme Aggregate von retinalen Vorläuferzellen auf, die sich nicht laminieren und sich selbst in richtige Netzhautschalen laminieren und organisieren konnten (Abbildung 5A,B) oder denen die umgebende Zone von RPE und Augenoberflächenepithel (OSE) fehlte (Abbildung 5C). Wenn diese retinalen Vorläuferzellen als Suspensionskulturen gepflückt und gepflegt wurden, bildeten sie unregelmäßige neuroretinale Aggregate (Abbildung 5D).
Abbildung 1: Zeitleiste der Differenzierung von iPS-Zellen in retinale Organoide. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Selbstorganisierte 3D-Generierung retinaler Organoide. (A) Züchtung von hiPS-Kulturen unter feederfreien Bedingungen. (B) Entwicklung neuronaler Rosetten am 14. Tag der Differenzierung (Sternchen). (C,D) Eye Field primordial (EFP) Cluster mit einer zentralen neuro-retinalen schalenartigen Struktur (schwarze Pfeile), die von der wandernden Zone des Epithels (weiße Pfeile) am Tag 21-28 der Differenzierung umgeben sind. (E) Pasteurpipette aus flammengezogenem Glas mit Hakenspitze. Die glatte Krümmung im Scharnierbereich dient zum Anstoßen und Anheben der Netzhautschalen (Pfeil). (F,G) Netzhautbecher, die am Tag 25 geerntet und unter Suspension kultiviert wurden, um selbstorganisierte 3D-Netzhautorganoide zu erzeugen. (H) Reife Netzhautorganoide in Suspensionskultur an Tag 45. Maßstabsbalken: 100 μm (A,B,D,G); 200 μm (C,F,H). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Charakterisierung retinaler Organoide. (A) Retinale Genexpressionsprofilierung mittels RT-PCR der undifferenzierten normalen hiPSC-Linie 23 (hiPSC-F2-3F1) (F2-UD) und der differenzierten normalen optischen Pfannen, die nach 3-4 Wochen Differenzierung ausgewählt und in Suspensionskultur für 1 Woche (OC-1M) bzw. 4 Wochen (OC-2M) weiter gereift sind. Die cDNAs aller Testproben wurden mit eEF1a als Beladungskontrolle normalisiert. (B) Konfokale Aufnahmen von immunmarkierten Schnitten von (i) unreifen retinalen Organoiden (OC-1M) mit Antikörpern gegen die neuroretinalen Vorläufermarker CHX10, PAX6 und OTX2 (in rot) und (ii) reifen retinalen Organoiden (OC-2M) mit Antikörpern gegen die Photorezeptor-Vorläufermarker Recoverin und CRX (in rot). Die markierte äußerste Schicht der Netzhautorganoide mit differenzierenden Photorezeptorzellen (Kasten) in den linken Panels wird gezoomt und in den rechten Panels dargestellt. DAPI wurde als Gegenfärbung (in blau) verwendet. Die rudimentären inneren segmentartigen Fortsätze sind durch weiße Pfeile markiert. Maßstabsleiste: 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Entstehung verschiedener Augenzelltypen. (A) EFP-Cluster mit der neuroretinalen Schale in der Mitte und migrierenden RPE-Auswüchsen mit Pigmentierung entlang der Vorderkanten (weißer Pfeil). (B) Gut differenzierte pigmentierte Epithelauswüchse von mehreren EFPs rund um die neuro-retinale Insel. (C) Eine höhere Vergrößerung eines EFP zeigt die Wanderzone der RPE-Vorläuferzellen (weißer Pfeil) und des Augenoberflächenepithels (Sternchen), das eine neuroretinale Tasse umgibt. (D) Ausgedehnte adhärente Kulturen, die Monoschichten unreifer RPE-Zellen entwickelten, die sowohl pigmentierte als auch nicht-pigmentierte Zellen enthielten. (E) Monolayer-Kulturen von voll ausgereiften und pigmentierten RPE-Zellen, die eine Kopfsteinpflastermorphologie an Tag 60 zeigen. (F-H) RPE-Zellen, die PAX6, MITF und RPE65 exprimieren, sind grün. Maßstabsleiste: 200 μm (A,B); 100 μm (C-E); 20 μm (F-H). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Abnorme Netzhautpfannenbildung in RB1-/- mutierten iPS-Zellen (A,B) EFPs mit abnormen Aggregaten retinaler Vorläuferzellen mit verzerrter Laminierung und fehlenden Streifen. (C) EFP mit der Miniatur-Neuro-Retina-Schale, aber ohne die umgebende Zone von RPE und Augenoberflächenepithel (Pfeil). (D) Irreguläre neuro-retinale Aggregate, die in Suspensionskultur gebildet werden. Maßstabsleiste: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Name des Primers | Primzahl (5'-3') | Bandgröße (bp) | Ref-ID | |||
| 1 | heEF1α | F: GAAGTCTGGTGATGCTGCCATTGT | 198 | NM_001402 | ||
| R: TTCTGAGCTTTCTGGGCAGACTTG | ||||||
| 2 | hNeuroD1 | F: CGCGCTTAGCATCACTAACT | 349 | NM_002500 | ||
| R: GCGTCTCTTGGGCTTTTGAT | ||||||
| 3 | hCHX10 | F: CAAGTCAGCCAAGGATGGCA | 382 | NM_182894 | ||
| R: CTTGACCTAAGCCATGTCCT | ||||||
| 4 | hCRX | F: TCAACGCCTTGGCCCTAAGT | 357 | NM_000554 | ||
| R: ACACATCTGTGGAGGGTCTT | ||||||
| 5 | hPKC-β1 | F: AAAGGCAGCTTTGGCAAGGT | 376 | NM_212535 | ||
| R: CGAGCATCACGTTGTCAAGT | ||||||
| 6 | RLBP1 | F: TGCACCATTGAAGCTGGCTA | 361 | NM_000326 | ||
| R: AGAAGGGCTTGACCACATTG | ||||||
| 7 | RHOK | F: CAAGCTGTATGCCTGCAAGA | 360 | NM_002929 | ||
| R: ATCCGGACATTGCCGTCATT | ||||||
| 8 | hOPN1SW | F: TGCTTCATTGTGCCTCTCTC | 373 | NM_001708 | ||
| R: AGCTGCATGTGTCGGATTCA | ||||||
| 9 | RCVRN | F: AGACCAACCAGAAGCTGGAGAGT | 367 | NM_002903 | ||
| R: ACGGGTGTCATGTGAGTGGTA | ||||||
| 10 | hABCA4 | F: CACCGTAGCAGGCAAGAGTATT | 271 | NG_009073 | ||
| R: AATGAGTGCGATGGCTGTGGAGA | ||||||
| 11 | hRD3 | F: ATGGTGCTGGAGACGCTTAT | 328 | NM_183059 | ||
| R: CTTCCTGCTTCATCCTCTCCA | ||||||
| 12 | hPDE6C | F: GTTGATGCCTGTGAACAAATGC | 351 | NM_006204 | ||
| R: ACCACTCAGCATAGGTGTGAT | ||||||
Tabelle 1: Liste genspezifischer Primer für die RT-PCR.
| Komponenten für RNA-Primer-Mix | Volumen (in μL) |
| RNA (1-2 μg) | n |
| 10 mM dNTP | 1 |
| 10 mM Oligo dT | 1 |
| DEPC-behandeltes Wasser | bis zu 10 |
| Gesamtes Reaktionsvolumen | 10 |
Tabelle 2: RNA-Primer-Mastermix für die cDNA-Konversion.
| Komponenten für Mastermix 2 | Volumen (in μL) |
| 10x RT-Puffer | 2 |
| 25 mM MgCl2 | 4 |
| 0,1 M DVB-T | 2 |
| SuperScript III Reverse Transkriptase | 1 |
| RNaseOUT | 1 |
| Gesamtes Reaktionsvolumen | 10 |
Tabelle 3: Mastermix 2 für die cDNA-Konversion.
| Bestandteile der PCR | Volumen (in μL)/Reaktion |
| 10x PCR-Puffer | 2 |
| 2 mM dNTP | 2 |
| Vorwärts-Primer (5 μM) | 1 |
| Reverser Primer (5 μM) | 1 |
| Taq-Polymerase | 0.2 |
| cDNA-Vorlage (50-100 ng) | 1 |
| Steriles Milli-Q Wasser | 12.8 |
| Gesamtes Reaktionsvolumen | 20 |
Tabelle 4: Mastermix für semiquantitative PCR.
| Temperatur | Zeit | Anzahl der Zyklen | |
| Denaturierung | 95 °C | 5 Minuten | x 1 |
| Denaturierung | 95 °C | 30 s | x 35 |
| Glühen | 50-60 °C | 30 s | |
| Erweiterung | 72 °C | 30 s | |
| Endgültige Verlängerung | 72 °C | 10 Minuten | x 1 |
Tabelle 5: PCR-Amplifikationsbedingungen.
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Discussion
hiPS-Zellen sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Entwicklung von Organen und Geweben in vitro zu untersuchen. Die Rekapitulation des Krankheitsphänotyps durch die Unterscheidung gesunder und krankheitsspezifischer hiPS-Zellen gegenüber der Netzhautlinie kann dazu beitragen, neuere Einblicke in die Pathophysiologie verschiedener Formen vererbter Netzhautdystrophien zu gewinnen. Für die in vitro Differenzierung von PSCs in retinale Zelltypen wurden mehrere Protokolle beschrieben und angewendet. Die meisten von ihnen beinhalten die Verwendung von Nährmedien, die komplexe Cocktails aus rekombinanten Wachstumsfaktoren, Nahrungsergänzungsmitteln, kleinen Molekülen und Reagenzien enthalten, wie z. B.: N1-, N2- und B27-Ergänzungen; BMP- und TGFβ-Signalblocker wie Noggin, SB431542, LDN193189 und Follistatin oder Induktoren wie Activin A, Lefty und IDE1; kanonische Wnt-Signalblocker wie DKK1, SFRP, IWP-2 und IWR-1-endo oder Induktoren wie CHIR99021, SB216763 und CKI-7; FGF-Rezeptor-Signalblocker wie PD0325901 und PD173074 oder Induktoren wie bFGF; Notch-Signal-Inhibitoren wie DAPT; andere Signalmoleküle wie der insulinähnliche Wachstumsfaktor (IGF-1); Retinsäure; Wachstumshormone wie Trijodthyronin (T3) und Hydrocortison; und Antioxidantien und andere überlebensfördernde Faktoren wie Ascorbinsäure, Nicotinamid, Taurin, Docosahexaensäure, 1-Thioglycerin usw. Diese Komponenten werden in verschiedenen Stadien der Stammzelldifferenzierung in das Nährmedium aufgenommen, um verschiedene Signalkaskaden zu stimulieren oder zu modulieren, um die Bindung der Augen- und Netzhautlinie zu induzieren 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22.
In dieser Arbeit wird eine einfachere, robustere und effizientere Methode zur Erzeugung retinaler Organoide direkt aus nahezu konfluenten, adhärenten Kulturen von hiPS-Zellen beschrieben. Das vereinfachte Protokoll beinhaltet die Verwendung von weniger Nahrungsergänzungsmitteln, Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen, die in erster Linie die anfängliche Differenzierung von PSCs in die neuroektodermale Linie auslösen. Nachfolgende Differenzierungsschritte beruhen auf der inhärenten Fähigkeit von PSCs, sich synchron in den Zelltyp verwandter Linien zu differenzieren, die sich dann selbst organisieren und gegenseitig die Entwicklung und räumliche Organisation mehrerer Zelltypen regulieren, die zur Bildung komplexer Gewebe beitragen. Der allmähliche Rückzug von bFGF und die Zugabe von Noggin helfen bei der erfolgreichen Induktion einer frühen neuroektodermalen Schicksalsbindung innerhalb von 3 Tagen nach der Differenzierung. Die fortgesetzte Aufrechterhaltung von Differenzierungskulturen im neural-induzierenden RDM, ohne Zugabe von Wachstumsfaktoren oder kleinen Molekülen, führt innerhalb von 3-4 Wochen nach der Differenzierung zur Induktion von Eye Field Primordial (EFP) Strukturen mit deutlichen Rändern. Die EFPs enthalten multipotente Vorläuferzellen, die bei ungestörter und fortgesetzter Aufrechterhaltung zu einer Differenzierung mehrerer Linien und zur Selbstorganisation führen, um komplexe EFPs zu bilden, die aus zentral positionierten neuroretinalen Schalen oder optischen Schalen (OCs) bestehen, die von anderen verwandten Augenzelltypen wie dem retinalen pigmentierten Epithel (RPE), dem Neuralleistenepithel und dem Augenoberflächenepithel umgeben sind. Alternativ können die PSCs von Tag 1-3 als Suspensionskulturen gezüchtet werden, um unter identischen Kulturbedingungen EBs zu bilden. Die EBs können an Tag 4 weiter plattiert und als adhärente Kulturen auf matrixbeschichteten Oberflächen im RDM gezüchtet werden, um die Differenzierung der Netzhautlinie zu initiieren, wie oben beschrieben. Gesunde differenzierende Kulturen führen routinemäßig zu etwa 20-30 EFPs pro Well einer 6-Well-Platte. Die OCs können nach 3-4 Wochen der Netzhautdifferenzierung aus den EFPs entnommen werden und werden für weitere 30-60 Tage in Suspensionskulturen aufbewahrt, um die Differenzierung neuro-retinaler Vorläuferzellen zu ermöglichen und reife retinale Organoide zu erzeugen. Nach 4-wöchiger Suspensionskultur bleiben etwa 70%-80% der aus EFPs entnommenen optischen Schalen intakt, behalten ihre Laminierung bei und entwickeln sich zu reifen retinalen Organoiden (OC-2M) mit RCVRN+- und CRX+-gebundenen Photorezeptorzellen und inneren segmentartigen Fortsätzen innerhalb der äußersten Schichten.
Das Zusammenfließen wachsender iPSC-Kulturen ist zum Zeitpunkt der Initiierung der Differenzierung und der Umstellung der Kulturen auf DIM von entscheidender Bedeutung. Kulturen mit kleineren Kolonien und einer Konfluenz von weniger als 60% und solche, die sich frühzeitig differenzieren, führen zu signifikant reduzierten EFP-Zahlen. Wenn die Augenfeldgruppen entstehen, sollte die zentrale Insel der neuroretinalen Becher innerhalb von 1 Woche geerntet werden. Dies kann durch sanftes Anstoßen und Anheben der intakten Becher unter Verwendung des Winkels oder des gekrümmten Bereichs der flammengezogenen Glaskapillarspitze erfolgen, wie im Protokollabschnitt beschrieben. Es ist darauf zu achten, dass die Becher nicht beschädigt werden. Weitere Verzögerungen bei der Ernte würden aufgrund der Proliferation und Migration von neuroretinalen Vorläuferzellen zu einer Abflachung und einem Verlust der 3D-Organisation führen, was die Ernte erschwert und zu atypischen retinalen Organoiden führt.
Die Effizienz der Augenfeldinduktion und der Reifung von Netzhautschalen variiert zwischen verschiedenen krankheits- oder patientenspezifischen hiPSC-Linien, abhängig von den zugrunde liegenden genetischen Defekten. Zum Beispiel war die retinale Linienbindung und die EFP-Bildungseffizienz einer RP-krankheitsspezifischen Linie identisch mit der der gesunden Kontrollzellen, während eine RB1-Nulllinie keine EFPs bilden konnte (Daten nicht gezeigt). Einige Linien, die Mutationen trugen, die mit der kongenitalen Leber-Amaurose in Verbindung gebracht wurden, bildeten atypische EFPs mit Defekten in ihrer Größe, Selbstorganisation, Laminierung und Reifung von retinalen Vorläuferzellen (Daten nicht gezeigt). Weitere molekulare Validierungen und Genexpressionsprofile von patientenspezifischen Netzhautorganoiden im Vergleich zu gesunden Kontrollgeweben wären notwendig, um die Pathophysiologie eines Krankheitszustands zu verstehen. In Anbetracht der Variabilität in den Genomen von Patienten und der Beteiligung von Multi-Gen-Netzwerken an Krankheitsmanifestationen kann es auch wichtig sein, retinale Organoide zu untersuchen, die von isogenen iPSC-Linien abgeleitet sind, um eine absolute Genotyp-Phänotyp-Korrelation in Studien zur Krankheitsmodellierung herzustellen. Solche isogenen Linien können entweder durch gezielte Gen-Knockouts in gesunden Kontrolllinien oder durch Korrektur der pathogenen Mutationen in patientenspezifischen iPS-Zellen unter Verwendung fortschrittlicher Genom-Editierungstechniken erzeugt werden 8,9.
Solche intakten Netzhautorganoide, die aus normalen oder krankheitsspezifischen iPSC-Linien stammen, können für neuartige Wirkstoffuntersuchungen und -tests verwendet werden. Photorezeptor-Vorläufer in den retinalen Organoiden und anderen okulären Zelltypen, wie dem RPE und dem Hornhautepithel in den EFP-Auswüchsen, können weiter isoliert und für ihre Anwendungen in der Grundlagenforschung und der regenerativen Medizin angereichert werden. Das hier beschriebene Protokoll kann leicht auf GMP-konforme Prozesse zur Herstellung klinischer Zellen für präklinische und klinische Studienauswertungen übertragen werden.
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Disclosures
Alle Autoren haben keine Interessenkonflikte oder finanzielle Offenlegungen.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich für die wissenschaftliche und technische Unterstützung durch Dr. Chitra Kannabiran, Genetiker; Dr. Subhadra Jalali, Fachärztin für Netzhaut; Dr. Milind Naik, Okuloplastischer Chirurg; und Dr. Swathi Kaliki, Augenonkologe am LV Prasad Eye Institute, Hyderabad, bei der Erzeugung normaler und patientenspezifischer iPSC-Leitungen. Die Autoren würdigen die F&E-Zuschüsse des Science and Engineering Research Board, des Department of Science and Technology (IM), (SB/SO/HS/177/2013), des Department of Biotechnology (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019) sowie die Senior Research Fellowships von ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) und CSIR (V.K.P.), der indischen Regierung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
| 15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
| Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
| Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
| Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
| Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
| GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
| HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
| Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
| Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
| Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
| Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
| Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
| Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |
References
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