Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

توليد عضويات الشبكية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان وأمراض الشبكية الصحية والخاصة بأمراض الشبكية

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64509
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1, 1,3, 1
1Centre for Ocular Regeneration, Prof. Brien Holden Eye Research Centre, LV Prasad Eye Institute, 2Manipal Academy of Higher Education, 3Schepens Eye Research Institute, Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة للتمييز بين hiPSCs إلى مجموعات مجال العين وتوليد عضويات عصبية شبكية باستخدام ظروف ثقافة مبسطة تتضمن أنظمة ثقافة ملتصقة ومعلقة. يمكن أيضا عزل أنواع خلايا العين الأخرى ، مثل RPE وظهارة القرنية ، من حقول العين الناضجة في مزارع الشبكية.

Abstract

يمكن للخلايا الجذعية متعددة القدرات أن تولد عضويات أنسجة معقدة مفيدة لدراسات نمذجة الأمراض في المختبر ولتطوير علاجات تجديدية. يصف هذا البروتوكول طريقة أبسط وقوية وتدريجية لتوليد عضويات شبكية العين في نظام مزرعة هجين يتكون من ثقافات أحادية الطبقة ملتصقة خلال أول 4 أسابيع من تمايز الشبكية حتى ظهور مجموعات أولية متميزة ومنظمة ذاتيا لمجال العين (EFPs). علاوة على ذلك ، يتم اختيار الجزر العصبية الشبكية الدائرية والشفافة على شكل دونات داخل كل EFP يدويا واستزراعها تحت التعليق باستخدام أطباق استزراع غير ملتصقة في وسط تمايز الشبكية لمدة 1-2 أسابيع لتوليد أكواب بصرية ثلاثية الأبعاد متعددة الطبقات (OC-1M). تحتوي هذه الكائنات العضوية غير الناضجة في شبكية العين على سلائف شبكية متعددة القدرات تتكاثر PAX6+ و ChX10 +. يتم تجميع خلايا السلائف خطيا ذاتيا داخل الكائنات العضوية وتظهر على شكل تشققات شعاعية متميزة. في 4 أسابيع بعد زراعة التعليق ، يخضع أسلاف الشبكية للتوقف بعد الانقسام وتمايز النسب لتشكيل عضويات شبكية ناضجة (OC-2M). تتطور السلائف الملتزم بها من سلالة المستقبلات الضوئية داخل الطبقات الخارجية من عضويات الشبكية. تنضج خلايا مستقبلات الضوء CRX + و RCVRN + هذه شكليا لعرض امتدادات تشبه الجزء الداخلي. يمكن اعتماد هذه الطريقة لتوليد عضويات شبكية العين باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs). يتم شرح جميع الخطوات والإجراءات بوضوح وإثباتها لضمان إمكانية التكرار وللتطبيقات الأوسع في العلوم الأساسية والبحوث الانتقالية.

Introduction

شبكية العين هي نسيج حساس للضوء موجود في الجزء الخلفي من عين الفقاريات يحول إشارات الضوء إلى نبضات عصبية من خلال ظاهرة كيميائية حيوية تعرف باسم مسار نقل الضوء. يتم نقل النبضات العصبية الأولية المتولدة في الخلايا المستقبلة للضوء في شبكية العين إلى الخلايا العصبية الشبكية الأخرى وخلايا العقدة الشبكية (RGCs) وتصل إلى القشرة البصرية للدماغ ، مما يساعد في إدراك الصورة والاستجابة البصرية.

وفقا لمنظمة الصحة العالمية (WHO) ، يقدر أن 1.5 مليون طفل مصابون بالعمى ، منهم مليون طفل في آسيا. ضمور الشبكية الوراثي (IRD) هو مرض رئيسي يسبب العمى يصيب 1 من كل 4000 فرد في جميع أنحاء العالم 1،2،3 ، في حين أن انتشار العمى المرتبط بالضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD) يتراوح بين 0.6٪ -1.1٪ في البلدان النامية4. تحدث IRDs بسبب عيوب وراثية موروثة في أكثر من 300 جين مختلف يشارك في نمو الشبكية ووظيفتها5. تؤدي هذه التغيرات الجينية إلى تعطيل وظائف الشبكية الطبيعية والتنكس التدريجي لخلايا الشبكية ، وهي الخلايا المستقبلة للضوء وظهارة الشبكية المصطبغة (RPE) ، مما يؤدي إلى فقدان البصر الشديد والعمى. تم إحراز تقدم هائل في حالات العمى الأخرى التي تشمل القرنية والعدسة وما إلى ذلك. ومع ذلك ، فإن ضمور الشبكية وضمور العصب البصري ليس لديهم أي علاج مثبت حتى الآن. نظرا لأن شبكية العين البشرية البالغة لا تحتوي على خلايا جذعية6 ، فإن المصادر البديلة مثل الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من المريض (iPSCs) يمكن أن توفر إمدادات غير محدودة من أنواع الخلايا المرغوبة وتحمل وعدا كبيرا لتطوير عضويات الأنسجة المعقدة المطلوبة لدراسات نمذجة الأمراض في المختبر ولتطوير العلاجات التجديدية7 ، 8,9,10.

أدت عدة سنوات من أبحاث الشبكية إلى فهم أفضل للأحداث الجزيئية التي تنظم تطور الشبكية المبكر. تهدف معظم البروتوكولات لتوليد خلايا شبكية العين وعضويات 3D من PSCs إلى تلخيص هذه الأحداث التنموية في المختبر ، عن طريق زراعة الخلايا في مزيج معقد من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة لتعديل العمليات البيولوجية المعروفة بطريقة تدريجية. تتكون عضويات الشبكية المتولدة على هذا النحو من خلايا الشبكية الرئيسية: خلايا العقدة الشبكية (RGCs) ، والخلايا العصبية البينية ، والمستقبلات الضوئية ، وظهارة الشبكية المصطبغة (RPE)11،12،13،14،15،16،17،18،19. على الرغم من المحاولات الناجحة لنمذجة IRDs باستخدام عضويات الشبكية ، فإن متطلبات المزيج المعقد من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة أثناء التمايز والكفاءة المنخفضة نسبيا لتوليد عضويات الشبكية تشكل تحديا كبيرا مع معظم البروتوكولات. وهي تشمل بشكل رئيسي تكوين الأجسام الجنينية ، يليها تمايزها التدريجي إلى سلالات شبكية باستخدام ظروف الثقافة المعقدة في مراحل مختلفة من التطور في المختبر 20،21،22.

هنا ، تم الإبلاغ عن طريقة مبسطة وقوية لتطوير عضويات شبكية العين العصبية 3D المعقدة من التحكم الصحي و hiPSCs الخاصة بأمراض الشبكية. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا التمايز المباشر لثقافات hiPSC شبه المتقاربة دون الحاجة إلى تكوين جسم جنيني. أيضا ، يتم تبسيط تعقيد وسيط الاستزراع ، مما يجعله تقنية فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكرار يمكن اعتمادها بسهولة من قبل الباحثين الجدد. وهو ينطوي على نظام ثقافة هجين يتكون من ثقافات أحادية الطبقة ملتصقة خلال الأسابيع ال 4 الأولى من تمايز الشبكية حتى ظهور مجموعات أولية متميزة ومنظمة ذاتيا لمجال العين (EFPs). علاوة على ذلك ، يتم اختيار الجزر العصبية الشبكية الدائرية داخل كل EFP يدويا وزراعتها في مزارع معلقة لمدة 1-2 أسابيع لإعداد أكواب شبكية ثلاثية الأبعاد متعددة الطبقات أو عضويات تتكون من سلائف الشبكية العصبية الشبكية المتكاثرة PAX6 + و CHX10 +. أدت الزراعة الممتدة لعضويات الشبكية في وسط يحتوي على 100 ميكرومتر من التورين لمدة 4 أسابيع أخرى إلى ظهور سلائف مستقبلات الضوء RCVRN + و CRX + والخلايا الناضجة ذات امتدادات بدائية تشبه الجزء الداخلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب التي تنطوي على hiPSCs بشكل معقم ، وفقا للممارسات المختبرية القياسية ، والمبادئ التوجيهية الأخلاقية والسلامة البيولوجية ، وبموافقات الهيئات التنظيمية مثل لجنة الأخلاقيات المؤسسية (IEC) ، واللجنة المؤسسية لأبحاث الخلايا الجذعية (IC-SCR) ، ولجنة السلامة البيولوجية المؤسسية (IBSC).

1. تحضير مستنبتة iPSC ووسط تمايز الشبكية والكواشف

  1. ثقافة iPSC ووسط الصيانة
    1. استزراع والحفاظ على خط hiPSC العادي23 (hiPSC-F2-3F1) وخط RB1-/- hiPSC المحرر بتقنية كريسبر (LVIP15-RB1-CS3 ، مع حذف ثنائي الإطار لإزاحة الإطار بمقدار 10 نقاط أساس داخل exon 18 لجين RB1 البشري) في وسط Essential 8 على ألواح الاستزراع المغلفة ب matrigel (مصفوفة الغشاء القاعدي المغلفة ؛ انظر جدول المواد) تحت ظروف الاستزراع الخالية من التغذية.
      ملاحظة: يمكن جعل هذا البروتوكول خاليا تماما من xeno عن طريق استبدال مصفوفة الغشاء القاعدي بطلاء vitronectin المؤتلف (VTN-N). قم بإعداد وسيط Essential 8 الكامل عن طريق إضافة مكمل 50x Essential 8 (مرفق مع مجموعة Essential 8 المتوسطة ؛ انظر جدول المواد) و 100 U / mL من محاليل البنسلين والستربتومايسين. بالتناوب ، يمكن أيضا استزراع hiPSCs باستخدام وسيط mTeSR1 الكامل.
  2. حل تفكك الخلايا (1x CDS)
    1. من أجل تفكك خال من الإنزيمات وتمرير iPSCs البشرية ، قم بإعداد CDS التي تحتوي على 0.5 mM EDTA و pH 8.0 و 30 mM NaCl في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) (انظر جدول المواد).
    2. لتحضير 100 مل من 1x CDS ، أضف 100 ميكرولتر من 0.5M EDTA و 1 مل من 3 M NaCl محاليل الأسهم إلى 99 مل من 1x DPBS ، واخلطها جيدا ، وقم بتعقيمها باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
  3. وسيط تحريض التمايز (DIM)
    1. تحضير DIM باستخدام الوسط القاعدي DMEM-F12 المكمل باستبدال مصل الضربة القاضية بنسبة 10٪ (KOSR) ، 1x حمض أميني غير أساسي (NEAA) ، 2 مللي متر جلوتا ماكس ، 100 وحدة / مل بنسلين-ستربتومايسين ، 200 ميكرومتر حمض الأسكوربيك ، ومكمل N2 1٪ (انظر جدول المواد).
  4. وسط تمايز الشبكية (RDM)
    1. قم بإعداد RDM باستخدام وسط DMEM-F12 القاعدي المكمل بمصل خروج المغلوب بنسبة 10٪ (KOSR) ، 1x حمض أميني غير أساسي (NEAA) ، 2 mM GlutaMax ، 100 U / mL Penicillin-Streptomycin ، 200 μM حمض L-Ascorbic ، و 2٪ مكمل B27 (مع فيتامين A) (انظر جدول المواد).
  5. أسطح زراعة الخلايا المغلفة بالمصفوفة خارج الخلية
    1. قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي المؤهلة ل hESC طوال الليل في دلو ثلج ، ويفضل أن يكون ذلك داخل الثلاجة عند 4-8 درجات مئوية. قم بتخفيف مخزون المصفوفة المذاب 100x (5 مل) بنسبة 1: 5 عن طريق إضافة 20 مل من الوسط القاعدي DMEM-F12 المثلج البارد واخلطه عن طريق الدوران اللطيف لتحضير محلول مخزون 20x.
      1. قم بإعداد 0.5 مل من القسامات على الثلج باستخدام أطراف ماصة مبردة مسبقا وأنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة. قم بتسمية القوارير على أنها مخزون 20x وقم بتخزينها مجمدة في فريزر -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    2. لطلاء أسطح زراعة الخلايا (أطباق الاستزراع أو أطباق 6 آبار) ، قم بإذابة حصة من مصفوفة 20x على الجليد وقم بتخفيفها بنسبة 1:20 باستخدام وسط قاعدي DMEM-F12 بارد لتحضير 10 مل من محلول طلاء مصفوفة 1x ، وهو ما يكفي لطلاء طبق 100 مم أو لوحة 6 آبار (1.5 مل / بئر).
      ملاحظة: قم بتبريد الماصات / الأطراف الدقيقة مسبقا عن طريق شفط DPBS المثلج والمعقم قبل التعامل مع محلول المصفوفة. يجب أن يتم الذوبان وجميع عمليات معالجة المصفوفة على الجليد ، باستخدام ماصات / أطراف دقيقة مبردة مسبقا لتجنب البلمرة والتبلور في درجات حرارة الغرفة.
    3. أضف 1.5 مل من محلول طلاء مصفوفة 1x إلى كل بئر من لوحة 6 آبار ، وقم بتدوير اللوحة برفق لضمان طلاء متساو ، واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪. اترك الألواح دون إزعاج لمدة لا تقل عن 1 ساعة لضمان طلاء موحد للمصفوفة على أسطح الاستزراع.
    4. قبل بذر الخلايا ، قم بشفط محلول الطلاء باستخدام ماصة معقمة سعة 5 مل وتخلص من النفايات السائلة. أضف وسط استزراع طازج على الفور (2 مل / بئر من صفيحة 6 آبار) وقم بزرع الخلايا بكثافة 150000-200000 خلية / بئر. لا تدع الألواح تجف أثناء المناولة.
      ملاحظة: بالتناوب ، يمكن استخدام طلاء الفيترونيكتين المؤتلف (VTN-N) بتركيز نهائي قدره 0.5 ميكروغرام / مل لبروتوكول استزراع خال من الأجانب.

2. إنشاء ثقافات iPSC البشرية

  1. ذوبان وإحياء hiPSCs
    1. قم بتغطية بئر واحد من لوحة 6 آبار بمحلول مصفوفة غشاء 1x. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة للسماح بالبلمرة والطلاء الموحد لسطح الاستزراع.
    2. بعد ساعة واحدة من الحضانة ، قم بإزالة محلول الطلاء وإضافة 1 مل من الوسط الأساسي 8 الكامل المسخن مسبقا الذي يحتوي على 10 ميكرومتر من مثبط Rho-kinase ، Y-27632 (1 ميكرولتر / مل من مخزون 10 mM ؛ انظر جدول المواد) ، قبل إحياء الخلايا.
    3. قم بإزالة مخزون التبريد hiPSC (1 × 106 خلايا / قارورة) من حاوية النيتروجين السائل. قم بإذابة الجليد بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع تحريك لطيف.
      ملاحظة: لا تذوب القارورة تماما. قم بتدوين رقم المقطع ، وقم بتعقيم القارورة على السطح ، وامسحها حتى تجف باستخدام مسحة خالية من النسالة تحتوي على 70٪ من كحول الأيزوبروبيل.
    4. باستخدام طرف ماصة معقم سعة 1 مل ، قم بشفط محتويات cryovial في أنبوب جديد سعة 15 مل يتكون من 2 مل من وسيط Essential 8 الكامل المسخن مسبقا بدون Y-27632. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 1000 × جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية.
    5. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1.0 مل من الوسط الأساسي 8 الكامل الذي يحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632.
    6. أضف تعليق الخلية هذا على الأسطح المطلية بالمصفوفة دون إزعاج المصفوفة عن طريق توزيعها على طول الجدران. هز اللوحة برفق بالعرض لضمان التوزيع المتساوي للخلايا.
    7. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ للسماح للخلايا بالالتصاق والبدء في التكاثر.
    8. بعد 12-24 ساعة ، استبدل الوسط المستهلك وحافظ على الثقافات في وسط أساسي 8 كامل التسخين بدون Y-27632.
    9. قم بتغيير وسط الثقافة كل 24 ساعة ومرور الثقافات بمجرد وصولها إلى التقاء 70٪ -80٪.
      ملاحظة: يتم اتباع نسبة تقسيم 1: 6 بشكل روتيني لثقافات hiPSC ويتم تمريرها على فترات منتظمة من 3-4 أيام.
  2. تمرير وطلاء hiPSCs لبدء تمايز نسب الشبكية
    1. استنشاق الوسط المستهلك من 70٪ -80٪ من ثقافات iPSC البشرية المتقاربة في ألواح ذات 6 آبار.
    2. أضف 1 مل من CDS (الخطوة 1.2) إلى كل بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5-7 دقائق حتى تتقارب الخلايا. قم بإزالة CDS بعناية ، مع الحرص على عدم فصل الخلايا ، وإضافة 2 مل من وسط Essential 8 الطازج وسحنه برفق باستخدام ماصة.
    3. اجمع تعليق الخلية من بئر واحد من لوحة مكونة من 6 خلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وقم بتدوير الأنبوب عند 1000 × جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية.
    4. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1.2 مل من الوسط الأساسي 8 وقم بتوزيع 200 ميكرولتر من الخلية 200 ميكرولتر من معلق الخلية (نسبة الانقسام 1: 6) في كل بئر من صفيحة 6 آبار مغلفة بالمصفوفة تحتوي على 1.5 مل من وسط استزراع iPSC يحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 ، كما هو موضح في الخطوة 1.5.
    5. بعد 12-24 ساعة ، استبدل الوسط المستهلك وحافظ على الثقافات في وسط أساسي 8 كامل التسخين بدون Y-27632.
    6. قم بتغيير وسط الثقافة كل 24 ساعة حتى تصل الثقافات إلى التقاء 70٪ -80٪.

3. تمايز hiPSCs في مجالات العين ونسب الشبكية

ملاحظة: يظهر مخطط تخطيطي لعملية التمايز في الشكل 1.

  1. ابدأ إجراء التمايز بمجرد أن تصل ثقافات hiPSC إلى التقاء 70٪ -80٪.
  2. في اليوم 0 ، قم بتغيير وسيط صيانة hiPSC إلى DIM (الخطوة 1.3) التي تحتوي على 1 نانوغرام / مل bFGF و 1 نانوغرام / مل Noggin. أضف 2.0 مل من الوسط لكل بئر من صفيحة 6 آبار وحافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
    ملاحظة: يؤدي الانسحاب التدريجي ل bFGF إلى تمايز PSCs ، وإضافة تركيزات متزايدة من Noggin (مثبط للعديد من BMPs) خلال المراحل الأولية يؤدي إلى تمايز نسب الأديم الظاهر والعصبية11،12 ويمنع التزام الأديم المتوسط والأديم الباطن. بدلا من ذلك ، يمكن استبدال Noggin ب LDN193189. على عكس استراتيجية تثبيط SMAD المزدوجة التي تم الإبلاغ عنها سابقا20,21 ، لا يتطلب هذا البروتوكول إضافة Activin أو SB-431542.
  3. في اليوم الأول ، قم بتغيير الوسيط المستهلك وإضافة DIM الذي يحتوي على 1 نانوغرام / مل bFGF و 10 نانوغرام / مل Noggin. أضف 2.0 مل لكل بئر من لوحة 6 آبار. احتضان الخلايا والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
  4. في اليوم 2-3 ، قم بإزالة الوسيط المستهلك وإضافة DIM الذي يحتوي على 10 نانوغرام / مل فقط Noggin. أضف 2.0 مل لكل بئر من لوحة 6 آبار وقم بتغيير الوسط كل 24 ساعة. احتضان الخلايا والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
    ملاحظة: قم دائما بتسخين وسط الاستزراع مسبقا إلى 30-37 درجة مئوية قبل الاستخدام. يمكن ملاحظة العوائم الزائدة والخلايا الميتة في مزارع التمايز المبكرة. في ظل هذه الظروف ، اغسل الثقافات مرة واحدة باستخدام 1x DPBS وأضف وسط تمايز الشبكية. يمكن إجراء اختبارات العقم على الوسط المستهلك أسبوعيا أو حسب الحاجة.
  5. في اليوم الرابع ، قم بإزالة الوسيط المستهلك وإضافة RDM (الخطوة 1.4). أضف 2.0 مل لكل بئر من صفيحة 6 آبار واستمر في الحفاظ على الثقافات في RDM عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ ، مع تغيير متوسط جديد كل يوم.
    ملاحظة: بالتناوب ، يمكن زراعة PSCs كمزارع معلقة من اليوم 1-3 ، في صفائح 96 بئرا غير ملتصقة ومستديرة القاع ، بكثافة خلية تبلغ 5 × 103 خلايا / 100 ميكرولتر / بئر لتشكيل أجسام جنينية (EBs) في ظل ظروف استزراع مماثلة في DIM. يمكن طلاء EBs جيدة التكوين في اليوم 4 على ألواح مغلفة بالمصفوفة تحتوي على RDM ويسمح لها بالالتصاق ، تتكاثر ، وتميز كما هو موضح أدناه.
  6. في حوالي اليوم 14-18 ، راقب الثقافات تحت المجهر عند تكبير 10x لظهور مجالات شبيهة بالوردة العصبية تتكون من أسلاف مجال العين المبكر (الشكل 2 ب).
  7. في حوالي اليوم 21-28 (3-4 أسابيع) ، راقب الثقافات تحت المجهر عند تكبير 4x و 10x لمراقبة ظهور EFPs ذاتية التنظيم ومتميزة ، مع جزيرة مركزية من الهياكل العصبية الشبكية ثلاثية الأبعاد الدائرية المحاطة بنواتج متجاورة من ظهارة عصبية وظهارة سطح العين (الشكل 2C ، D).
    ملاحظة: يمكن ملاحظة حوالي 20-30 عبوة ناسفة مفخخة لكل بئر من صفيحة 6 آبار من ثقافة تمايز الشبكية hiPSC الطبيعية. يمكن أن يختلف هذا الرقم مع خطوط hiPSC الأخرى الخاصة بالمرض ، بناء على خلفيتها الجينية وإمكانية تمايز نسب الشبكية.

4. حصاد عضويات الشبكية

  1. سحب اللهب من ماصات باستور الزجاجية للقطف اليدوي لأكواب الشبكية.
    ملاحظة: استخدم ماصات باستور الزجاجية المعقمة والمعقمة لاختيار مجال العين.
    1. قم بتشغيل موقد بنسن. خذ ماصة باستور معقمة وأمسك القاعدة بيد واحدة والطرف الشعري في اليد الأخرى. تعقيم اللهب وتسخين المنطقة بالقرب من منتصف الطرف الشعري ، مع حركات دورانية حتى يصبح الزجاج مرنا. ثم ابتعد عن اللهب واسحب للخارج بسرعة لإنشاء طرف شعري ناعم مع تجويف مغلق.
    2. أمسك الطرف الرفيع أفقيا أمام اللهب وقم بتمريره بسرعة عبر اللهب بحركة خارجية لإنشاء خطاف أملس أو طرف شعري على شكل حرف L.
    3. استخدم منطقة الانحناء الخارجي الأملس للخطاف الشعري كمغرفة دقيقة لرفع وفصل أكواب الشبكية العصبية السليمة برفق عن مجموعات EFP.
      ملاحظة: لا تتسبب الزاوية الملساء للخطاف الشعري الزجاجي في تلف الخلايا ولا تخلق خدوشا على أسطح الثقافة. يمكن أيضا استخدام هذه الأداة البسيطة بشكل فعال لتقسيم مستعمرة hiPSC الفردية في أنماط الشبكة ولتمريرها كمجموعات خلايا صغيرة أثناء التوسع النسيلي.
  2. ثقافة وصيانة أكواب الشبكية لتوليد عضويات الشبكية 3D.
    1. في اليوم 25-30 ، أضف 4.0 مل من وسط تمايز الشبكية المسخن مسبقا في طبق منخفض التعلق 60 مم قبل التحضير لحصاد أكواب الشبكية العصبية.
    2. اعمل تحت مجهر ستيريو عند تكبير 0.63x-4.5x لمراقبة واختيار أكواب الشبكية العصبية جيدة التكوين يدويا من EFPs الفردية.
      ملاحظة: يساعد ظهور نتوءات خلايا RPE المصطبغة في التعرف بسهولة على العبوات الناسفة الخارقة والأكواب العصبية الشبكية الموضوعة مركزيا. تظهر أكواب الشبكية على شكل دونات ، دائرية ، وهياكل 3D شفافة ، مع تشققات شعاعية واضحة ، تتكون من الخلايا الجذعية الشبكية المرتبة خطيا والمجمعة ذاتيا ، على عكس المجموعات المعبأة بإحكام والكروية أو غير المنتظمة التي تشكلها الخلايا العصبية للجهاز العصبي المركزي أو خلايا القمة العصبية23.
    3. استخدم خطافات ماصة المراعي التي يتم سحبها باللهب لدفع الجزيرة العصبية الشبكية المركزية وإخراجها برفق داخل العبوات الناسفة الخارقة الفردية.
    4. اضبط ماصة صغيرة سعة 1 مل لشفط 100 ميكرولتر واستخدم 1 مل ميكروتيبس مع فتحات واسعة التجويف لشفط ونقل أكواب الشبكية العائمة إلى أطباق الثقافة الطازجة منخفضة الالتصاق المعدة في الخطوة 4.2.1.
      ملاحظة: قد يؤدي استخدام أطراف ذات حجم تجويف أصغر وضغط شفط أعلى إلى القص ويؤثر على سلامة أكواب الشبكية. يبلغ قطر الأبعاد التقريبية لأكواب الشبكية حوالي 1-2 مم.
    5. الحفاظ على أكواب الشبكية في RDM كمزارع تعليق غير ملتصقة واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
    6. اليوم 30-45: قم بتغيير الوسط يوميا عن طريق إمالة الطبق برفق والسماح لأكواب الشبكية بالاستقرار لمدة 30 ثانية تقريبا. اتبع طريقة التغذية الجزئية ، وإزالة نصف كميات من الوسط المستهلك واستبدالها بكميات متساوية من الوسط الطازج.
      ملاحظة: تجنب الشفط المتكرر والتحويلات لمنع أي ضرر لأكواب الشبكية. بعد 1-2 أسابيع من ثقافة التعليق ، تنمو أكواب الشبكية قليلا في الحجم (1-3 مم) وتتطور إلى عضويات شبكية ثلاثية الأبعاد ذاتية التنظيم (OC-1M) تتكون من أسلاف شبكية عصبية مبكرة مرتبة خطيا تعبر عن PAX6 و CHX10 (الشكل 3Bi).
    7. اليوم 45-60: استزراع عضويات الشبكية لمدة 4 أسابيع أخرى في RDM تحتوي على 100 ميكرومتر توراين (انظر جدول المواد) لدعم بقاء أفضل وتمايز النسب لأسلاف الشبكية العصبية وتطوير نوع خلايا الشبكية الناضجة (OC-2M).
      ملاحظة: حوالي 70٪ -80٪ من أكواب الشبكية أو البصرية التي تم التقاطها من EFPs تظل سليمة ، وتحتفظ بتصفيحها ، وتتطور إلى عضويات شبكية ناضجة بعد 4 أسابيع من زراعة التعليق (OC-2M).
    8. تأكد من أن عضويات الشبكية الناضجة في 4 أسابيع من ثقافة التعليق تظهر ظهور سلائف مستقبلات الضوء RCVRN + و CRX + والخلايا الناضجة ذات امتداد بدائي يشبه الجزء الداخلي في طبقات الخلايا الخارجية ، وبالتالي تلخيص نمو الشبكية الطبيعي وعملية النضج في المختبر (الشكل 3Bii).
      ملاحظة: بعد إزالة الكؤوس العصبية الشبكية ، يمكن الحفاظ على ثقافات التمايز بشكل مستمر في RDM. تحتوي النتوءات الظهارية القريبة المحيطة بالشبكية العصبية على سلائف الخلايا الظهارية المصطبغة بالشبكية (RPE) ، والتي تتوسع وتنضج بشكل أكبر لتشكيل طبقات أحادية RPE مصطبغة مع مورفولوجيا حصوية نموذجية (الشكل 4). تتكون النتوءات البعيدة في الغالب من ظهارة سطح العين التي تساهم في العدسةوظهارة القرنية.يمكن حصاد أنواع الخلايا المرغوبة من مناطق مختلفة من نواتج العبوات الناسفة الخارقة وإثرائها بشكل أكبر لإنشاء مزارع نقية.

5. توصيف عضويات الشبكية

  1. التوصيف المورفولوجي والجزيئي
    1. راقب العبوات الناسفة الخارقة الملتصقة وعضويات الشبكية العائمة تحت مجهر تباين الطور عند تكبير 4x و 10x وتوثيق مورفولوجيتها وأبعادها.
    2. اجمع حوالي 20 عضويا في شبكية العين في مراحل مختلفة من النضج (الخطوات 4.2.3-4.2.6) في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل باستخدام أطراف عريضة التجويف 1000 ميكرولتر. دع المواد العضوية تستقر في القاع وتستنشق الوسط. اغسل الكؤوس باستخدام 1x PBS.
    3. قم بإزالة PBS الزائد وأضف 1.0 مل من كاشف TRIzol (انظر جدول المواد). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. تجانس الأنسجة باستخدام مدقة أنبوبية وسحنها باستخدام ماصة سعة 1.0 مل.
    4. قم بإعداد إجمالي الحمض النووي الريبي باتباع طريقة الكاشف القياسية لعزل الحمض النووي الريبي وتنقيته ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    5. تحقق من جودة الحمض النووي الريبي على هلام الأغاروز وقم بتحديده باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop (انظر جدول المواد).
    6. قم بتحويل 1-2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي إلى cDNA باستخدام إنزيم النسخ العكسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). انظر الجدول 1 للحصول على قائمة بالبادئات الخاصة بالجينات.
    7. باختصار ، قم بإعداد المزيج الرئيسي للحمض النووي الريبي التمهيدي في 10 ميكرولتر من الحجم الكلي كما هو مذكور في الجدول 2 واحتضان الأنبوب عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في دورة حرارية. انقل الأنبوب من جهاز التدوير الحراري إلى الثلج لمدة 2 دقيقة.
    8. في هذه الأثناء ، قم بإعداد المزيج الرئيسي 2 مع الكواشف المذكورة في الجدول 3. أضف هذا المزيج الرئيسي إلى أنبوب مزيج RNA-primer المحضر في الخطوة 5.1.7. تخلط بلطف.
    9. احتضان العينة عند 50 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة ، ثم 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم امسكها عند 4 درجات مئوية لإيقاف التفاعل.
    10. استخدم cDNA المركب كقالب في تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل للتحقق من التعبير عن السلف العصبي الشبكي وعلامات خلايا الشبكية الناضجة.
    11. تطبيع قوالب cDNA الإجمالية لكل عينة ، وهي F2-UD (hiPSC-F2-3F1 ؛ خلايا غير متمايزة) ، OC-1M (كوب بصري عمره أسبوع واحد في ثقافة التعليق) ، و OC-2M (كوب بصري عمره 4 أسابيع في ثقافة التعليق) عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي باستخدام جينات التدبير المنزلي مثل hE1fα أو GAPDH.
    12. قم بإعداد المزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي ، كما هو مذكور في الجدول 4 ، وضع أنابيب عينة الاختبار للتضخيم في دورة حرارية. شروط تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل مذكورة في الجدول 5.
  2. علم الأنسجة والكيمياء المناعية
    1. اجمع الأكواب البصرية في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2.0 مل واشطب الوسط الزائد (الخطوات 4.2.3-4.2.6). شطف المواد العضوية مع 1x PBS ثم غسلها وتعليقها في 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد لتثبيتها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
    2. في اليوم التالي ، اغسل الكؤوس في ماء منزوع الأيونات. اترك الأكواب تحتوي على 95٪ كحول (ثلاثة تغييرات ، 15-20 دقيقة لكل منها) ، متبوعة بالكحول بنسبة 100٪ (ثلاثة تغييرات ، 15-20 دقيقة لكل منها) ، مزيج 1: 1 من الكحول المطلق والزيلين لمدة 15 دقيقة ، الزيلين (تغييران ، 15 دقيقة لكل منهما) ، والبارافين (ثلاثة تغييرات ، 15 دقيقة لكل منهما). قم بتضمين هذا النسيج لتحضير كتلة البارافين باتباع الإجراءات القياسية. دعها تبرد وتصلب.
    3. قم بإعداد مقاطع رقيقة (~ سمك 4-5 ميكرومتر) باستخدام ميكروتوم ووضعها على شرائح مجهرية مغلفة بالسيلان (انظر جدول المواد) باتباع إجراءات الأنسجة القياسية.
    4. لإزالة البارافين ، سخني الشرائح على حرارة 70 درجة مئوية على كتلة تسخين لمدة 15-20 دقيقة. بمجرد ذوبان الشمع ، اغسل الشرائح بالزيلين (ثلاثة تغييرات ، 3-4 دقائق لكل منها) ، والتي ستزيل البارافين تماما.
      ملاحظة: تؤدي الإزالة غير الكاملة للبارافين إلى تلطيخ ضعيف / غير مكتمل للأقسام مع كمية هائلة من ضوضاء الخلفية.
    5. أعد ترطيب الشرائح باستخدام نسب مختلفة من الإيثانول (100٪ و 90٪ و 80٪) لمدة 3 دقائق لكل منها. شطف الشرائح بالماء المقطر والمضي قدما في استرجاع المستضد.
    6. قبل البدء في استرجاع المستضد ، قم بتسخين المخزن المؤقت للسيترات مسبقا (الرقم الهيدروجيني 6.0) في وعاء كوبلين (انظر جدول المواد) باستخدام فرن ميكروويف حتى يصل إلى 95-100 درجة مئوية.
    7. اغمر الشرائح في محلول سترات مسخن مسبقا وقم بتسخين البرطمان لمدة 15 دقيقة في فرن الميكروويف. أخرج برطمان كوبلين من الفرن واتركه يبرد في درجة حرارة الغرفة.
    8. قم بسد أقسام البيروكسيديز الداخلي عن طريق إضافة خليط 1: 1 من الميثانول وبيروكسيد الهيدروجين لمدة 5 دقائق ، متبوعا بغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام 1x PBS.
    9. تخلل الأقسام باستخدام 0.5٪ Triton-X 100 لمدة 15 دقيقة. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام 1x PBS.
    10. منع الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة الأولية عن طريق احتضان الأقسام بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) في 1x PBS لمدة 1 ساعة.
    11. احتضان الأقسام بالأجسام المضادة الأولية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام 1x PBS لمدة 3-5 دقائق لكل منها لإزالة الجسم المضاد غير المرتبط.
    12. أضف جسما مضادا ثانويا مناسبا مقترنا بالصبغة الفلورية واحتضانه لمدة 45 دقيقة. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام 1x PBS لمدة 3-5 دقائق لكل منها.
      ملاحظة: الأجسام المضادة والتخفيفات الخاصة بها مذكورة في جدول المواد. تم تصنيف أقسام الشبكية العضوية المناعية باستخدام PAX6 و CHX10 للكشف عن خلايا السلائف العصبية الشبكية المبكرة ، واستخدام Recoverin و CRX للكشف عن خلايا السلائف الشبكية والمستقبلات الضوئية الملتزمة. وبالمثل ، تم استخدام anti-PAX6 و anti-MITF للكشف عن سلائف RPE ، وتم استخدام anti-CRALBP و anti-RPE65 للكشف عن خلايا RPE الناضجة المصطبغة عن طريق الكيمياء الخلوية المناعية لمزارع أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد.
    13. قم بتلطيخ الأقسام باستخدام DAPI أو PI وقم بتثبيتها على شريحة زجاجية باستخدام وسيط التثبيت المضاد للتلاشي (انظر جدول المواد).
    14. قم بتصوير وتوثيق الأقسام ذات العلامات المناعية لعضويات الشبكية ومزارع RPE باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر الفلوري أو متحد البؤر لفحص طبقات الخلايا المختلفة التي تعبر عن علامات شبكية مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم تحقيق تمايز hiPSCs إلى سلالات العين عن طريق زراعة الخلايا في مجموعات مختلفة من وسط الثقافة الذي يحتوي على مكملات وعوامل نمو في خطوات متسلسلة في نقاط زمنية مختلفة ، كما هو موضح في الشكل 1. يتم الحفاظ على ثقافات hiPSC في الوسط الأساسي 8 ، وسط صيانة الخلايا الجذعية متعدد القدرات. بمجرد وصولها إلى التقاء 70٪ -80٪ (الشكل 2A) ، يتم استبدال الوسط بوسط تحريض التمايز (DIM) في اليوم 0 (راجع الخطوة 3.2) التي تحتوي على 1 نانوغرام / مل bFGF ، 1 نانوغرام / مل Noggin ، و 1٪ N2 ملحق. جنبا إلى جنب مع ملحق N2 المحفز للأعصاب ، يلعب Noggin ، مثبط إشارات BMP ، دورا حاسما في توجيه الخلايا نحو سلالة الأديم الظاهر العصبي عن طريق منع التزام الأديم المتوسط والأديم الباطن. فياليوم الأول و 2 و 3 ، يزداد تركيز Noggin إلى 10 نانوغرام / مل (راجع الخطوة 3.3و 3.4). مناليوم الرابع ، يتم استبدال DIM بوسط تمايز الشبكية (RDM) (الخطوة 3.5) ، ويتم الحفاظ على الثقافات بشكل مستمر لمدة تصل إلى 30 يوما. يحتوي B27 في كوكتيل RDM على مكملات إضافية مثل مضادات الأكسدة المتعددة و D-Galactose ، الذي يعزز التمثيل الغذائي الهوائي ويساعد في تقليل الإجهاد التأكسدي ، وتحسين صلاحية الخلايا السلفية المتميزة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن وجود أسيتات الريتينول (فيتامين أ) وهرمونات النمو مثل ثلاثي يودو-I-thyronine (T3) يعزز تمايز النسب العصبية والشبكية.

فياليوم من 14إلى 18 ، لوحظ تكوين وريدات عصبية ، مما يمثل بدء التزام مجال العين (الشكل 2 ب). تتكاثر سلائف مجال العين داخل الوريدات العصبية وتنظم نفسها ذاتيا في مجموعات بدائية مميزة لمجال العين (EFPs) مع هياكل شبكية عصبية دائرية في المركز. تظهر أنواع الخلايا الأخرى مثل ظهارة الشبكية المصطبغة (RPE) ، وظهارة القمة العصبية ، وتلك التي تساهم في سطح العين وتهاجر كظهارة متجاورة ذات هوامش محددة جيدا. يمكن ملاحظة حقول العين جيدة التكوين ، كما هو موضح أعلاه ،بين اليوم 21إلى 28 من التمايز (الشكل 2C ، D). يتم حصاد الجزيرة المركزية من أكواب الشبكية العصبية بين اليوم 25-30 باستخدام ماصة باستور الزجاجية المسحوبة باللهب (الشكل 2E) ويتم الاحتفاظ بها كمزارع تعليق غير ملتصقة في RDM لمدة 1-2 أسابيع أخرى ، حتى اليوم 45. تقوم أسلاف الشبكية المتكاثرة بتنظيم نفسها ذاتيا لتشكيل عضويات شبكية ثلاثية الأبعاد متعددة الطبقات يبلغ قطرها حوالي 2-3 مم (الشكل 2F ، G). من اليوم 46 ، يتم استكمال RDM ب 100 ميكرومتر توراين لتعزيز تكوين الخلايا العصبية وتحسين بقاء الخلايا في الثقافات العضوية طويلة الأجل في المختبر (الشكل 2H).

تتميز عضويات الشبكية في مراحل مختلفة من النضج للتعبير عن العديد من علامات السلف الشبكية باستخدام النسخ العكسي PCR (RT-PCR) والكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC). لهذا ، يتم حصاد المواد العضوية لعزل الحمض النووي الريبي الكليفي اليوم 30و 60 من التمايز. أكدت نتائج RT-PCR تحريض والتعبير عن علامات الشبكية العصبية مثل NEUROD1 و ChX10 و CRX و PKCß1 و RLBP1 و RHOC و OPN1SW و RCVRN و ABCA4 و RD3 و PDE6C في عضويات الشبكية البالغة من العمر أسبوعا واحدا (4-5 أسابيع بعد التمايز ، OC-1M) وعضويات الشبكية البالغة من العمر 4 أسابيع 8,12 (7-8 أسابيع بعد التمايز ، OC-2M) (الشكل 3A). أكدت الكيمياء الهيستولوجية المناعية والتصوير الفلوري التعبير عن علامات السلف المبكرة للشبكية PAX6 و CHX10 و OTX2 في OC-1M وعلامات الشبكية الناضجة RCVRN و CRX في OC-2M 8,12 (الشكل 3Bi ، ii).

بالإضافة إلى الكؤوس العصبية الشبكية المركزية ، تظهر أنواع خلايا العين الأخرى ، مثل ظهارة الشبكية المصطبغة (RPE) ، وظهارة القمة العصبية ، والخلايا الظهارية لسطح العين ، وتهاجر من EFPs. تظهر أسلاف RPE المشتقة من الأديم الظاهر العصبي كخلايا ظهارية مرتبة بشكل مضغوط تحيط بالعبوات الناسفة الخارقة ، والتي تنضج تدريجيا وتصبغ على طول هوامش الهجرة من اليوم 30-45 (الشكل 4A-C). وبالتالي يمكن تمديد ثقافات التمايز الملتصقة هذه ، بعد إزالة أكواب الشبكية ، حتى اليوم 45 ، لحصاد سلائف RPE المتكاثرة (الشكل 4D) ، والتي يمكن إثراؤها بشكل أكبر لإعداد مزارع أحادية الطبقة لخلايا RPE المصطبغة الناضجة تماما. يمكن رؤية RPE المصطبغ الناضج على أنه أحادي الطبقات مع مورفولوجيا حصوية نموذجية (الشكل 4E). يتم تأكيد هوية خلية RPE بشكل أكبر من خلال الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد علامات خاصة ب RPE مثل MITF (علامة السلف RPE) ، PAX6 (علامة السلف و RPE الناضجة) ، و RPE65 (علامة RPE الناضجة) 10,12 (الشكل 4F-H).

وبالتالي يمكن أن تكون عضويات الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات بمثابة نماذج في المختبر لدراسة أمراض الشبكية الوراثية المختلفة7،8،9. يتم تطوير نماذج الخلايا الجذعية الخاصة بالمرض إما عن طريق توليد خطوط iPSC خاصة بالمريض أو عن طريق إدخال طفرات خاصة بالمرض في خطوط iPSC للتحكم الصحي باستخدام نهج تحرير الجينات القائم على كريسبر 7,8. قد تتمايز أو لا تتمايز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات الطافرة بكفاءة إلى أنواع خلايا الشبكية اعتمادا على الطفرات الجينية المعنية. في حين أن معظم خطوط خلايا التحكم السليمة اتبعت الجدول الزمني الموصوف أعلاه ، يمكن أن يكون هناك انحرافات في حالة iPSCs الخاصة بالمرض من حيث الجداول الزمنية للتمايز ، ومورفولوجيا EFP ، وحجم كوب الشبكية ، والتصفيح ، والنضج. تم فحص إمكانية تمايز الشبكية لخط RB1-/- hiPSC (LVIP15-RB1-CS3) الذي يحمل حذفا ثنائي الأليل قدره 10 bp داخل exon 18 لجين RB1 البشري ، مما يؤدي إلى إزاحة الإطار وفقدان كامل لتعبير بروتين RB1. لوحظ أن فقدان تعبير RB1 لم يؤثر على العين وتمايز نسب الشبكية المبكر لخط hiPSC الطافر. ومع ذلك ، لوحظ تأخير ملحوظ في الجداول الزمنية وانخفاض في كفاءة تشكيل العبوات الناسفة الخارقة. كانت العبوات الناسفة الخارقة غير النمطية التي ظهرت تحتوي على مجاميع غير طبيعية من أسلاف الشبكية التي فشلت في التصفيح والتنظيم الذاتي في أكواب شبكية مناسبة (الشكل 5 أ ، ب) أو تفتقر إلى المنطقة المحيطة من RPE وظهارة سطح العين (OSE) (الشكل 5C). عند اختيارها والحفاظ عليها كمزارع معلقة ، شكلت مجموعات السلف الشبكية هذه مجاميع شبكية عصبية غير منتظمة (الشكل 5 د).

Figure 1
الشكل 1: الجدول الزمني الذي يمثل تمايز iPSCs إلى عضويات شبكية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: توليد عضوي ثلاثي الأبعاد ثلاثي الأبعاد منظم ذاتيا . (أ) زراعة ثقافات hiPSCs في ظل ظروف خالية من التغذية. ب: ظهور وريدات عصبية في اليوم 14 من التمايز (العلامة النجمية). (ج، د) مجموعات حقل العين البدائية (EFP) التي تحتوي على بنية مركزية تشبه كأس الشبكية العصبية (الأسهم السوداء) محاطة بمنطقة الهجرة للظهارة (الأسهم البيضاء) في اليوم 21-28 من التمايز. (ه) ماصة باستور زجاجية مسحوبة باللهب بطرف معقوف. يستخدم المنحنى الأملس في منطقة المفصلة لدفع ورفع أكواب الشبكية (السهم). (و ، ز) أكواب الشبكية التي يتم حصادها في اليوم 25 وزراعتها تحت التعليق لتوليد عضويات شبكية 3D ذاتية التنظيم. (H) عضويات الشبكية الناضجة في مزرعة التعليق في اليوم 45. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر (أ ، ب ، د ، ز) ؛ 200 ميكرومتر (C ، F ، H). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: توصيف عضويات الشبكية. (أ) توصيف التعبير الجيني للشبكية بواسطة RT-PCR لخط hiPSC الطبيعي غير المتمايز23 (hiPSC-F2-3F1) (F2-UD) والأكواب البصرية العادية المتمايزة التي تم التقاطها في 3-4 أسابيع من التمايز ونضجت أكثر في ثقافة التعليق لمدة أسبوع واحد (OC-1M) و 4 أسابيع (OC-2M) على التوالي. تم تطبيع cDNAs لجميع عينات الاختبار باستخدام eEF1a كعنصر تحكم في التحميل. (ب) صور متحدة البؤر لأقسام ذات علامات مناعية من (i) عضويات الشبكية غير الناضجة (OC-1M) باستخدام الأجسام المضادة ضد علامات السلف العصبي الشبكي CHX10 و PAX6 و OTX2 (باللون الأحمر) و (ii) عضويات الشبكية الناضجة (OC-2M) باستخدام الأجسام المضادة ضد علامات السلائف للمستقبلات الضوئية Recoverin و CRX (باللون الأحمر). يتم تكبير الطبقة الخارجية الملحوظة من عضويات الشبكية مع خلايا مستقبلات الضوء المتمايزة (المربع) في اللوحات اليسرى وتظهر في اللوحات اليمنى. تم استخدام DAPI كمضاد (باللون الأزرق). يتم تمييز الامتدادات البدائية التي تشبه الجزء الداخلي بأسهم بيضاء. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: ظهور أنواع مختلفة من خلايا العين. (أ) مجموعات EFP مع كأس الشبكية العصبية في المركز ونتوءات RPE المهاجرة التي تظهر تصبغا على طول الحواف الأمامية (سهم أبيض). ب: نتوءات طلائية مصطبغة جيدة التمايز من عدة عبوات ناسفة مفكككة في جميع أنحاء الجزيرة العصبية الشبكية. (ج) يظهر التكبير الأعلى للعبوة الناسفة الخارقة المنطقة المهاجرة لأسلاف RPE (السهم الأبيض) وظهارة سطح العين (علامة النجمة) المحيطة بكأس الشبكية العصبية. (د) الثقافات الملتصقة الممتدة التي طورت طبقات أحادية من خلايا RPE غير الناضجة التي تحتوي على خلايا مصطبغة وغير مصطبغة. (ه) مزارع أحادية الطبقة لخلايا RPE الناضجة تماما والمصطبغة التي تظهر مورفولوجيا الحصاة في اليوم 60. (ف-ح) خلايا RPE تعبر عن PAX6 و MITF و RPE65 باللون الأخضر. شريط المقياس: 200 ميكرومتر (أ ، ب) ؛ 100 ميكرومتر (C-E) ؛ 20 ميكرومتر (F-H). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تكوين كأس الشبكية غير الطبيعي في RB1-/- iPSCs الطافرة. (أ ، ب) العبوات الناسفة الخارقة مع مجاميع غير طبيعية من أسلاف الشبكية مع تصفيح مشوه ونقص التشققات. (C) EFP مع كأس الشبكية العصبية المصغرة ولكن تفتقر إلى المنطقة المحيطة من RPE وظهارة سطح العين (السهم). (د) المجاميع العصبية الشبكية غير المنتظمة المتكونة في مزرعة المعلق. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

اسم التمهيدي التسلسل الأولي (5'-3') حجم الفرقة (bp) رقم العقار
1 heEF1α F: GAAGTCTGGTGATGCTGCCATTGT 198 NM_001402
R: TTCTGAGCTTTCTGGGCAGACTTG
2 hNeuroD1 F: CGCGCTTAGCATCACTAACT 349 NM_002500
R: GCGTCTCTTGGGCTTTTTGAT
3 هتش إكس 10 F: CAAGTCAGCCAAGGATGGCA 382 NM_182894
R: CTTGACCTAAGCCATGTCCT
4 hCRX F: TCAACGCCTTGGCCCTAAGT 357 NM_000554
R: ACACATCTGTGGAGGGTCTT
5 hPKC-β1 F: AAAGGCAGCTTTGGCAAGGT 376 NM_212535
R: CGAGCATCACGTTGTCAAGT
6 RLBP1 F: TGCACCATTGAAGCTGGCTA 361 NM_000326
R: AGAAGGGCTTGACCACATTG
7 روك F: CAAGCTGTATGCCTGCAAGA 360 NM_002929
R: ATCCGGACATTGCCGTCATT
8 hOPN1SW F: TGCTTCATTGTGCCTCTCTC 373 NM_001708
R: AGCTGCATGTGTCGGATTCA
9 آر سي في آر إن آر إن F: AGACCAACCAGAAGCTGGAGT 367 NM_002903
R: ACGGGTGTCATGTGAGTGGTA
10 hABCA4 F: CACCGTAGCAGGCAAGAGTATT 271 NG_009073
R: AATGAGTGCGATGGCTGTGGAGA
11 hRD3 F: ATGGTGCTGGAGACGCTTAT 328 NM_183059
R: CTTCCTGCTTCATCCTCTCCA
12 hPDE6C F: GTTGATGCCTGTGAACAAATGC 351 NM_006204
R: ACCACTCAGCATAGGTGTGAT

الجدول 1: قائمة البادئات الخاصة بالجينات ل RT-PCR.

مكونات لمزيج الحمض النووي الريبي التمهيدي الحجم (بالميكرولتر)
الحمض النووي الريبي (1-2 ميكروغرام) n
10 مللي متر dNTP 1
10 مللي متر أوليغو dT 1
المياه المعالجة ب DEPC حتى 10
إجمالي حجم التفاعل 10

الجدول 2: المزيج الرئيسي للحمض النووي الريبي التمهيدي لتحويل cDNA.

مكونات ماسترمكس 2 الحجم (بالميكرولتر)
10x RT العازلة 2
25 مللي متر مغسل2 4
0.1 م DTT 2
SuperScript III النسخ العكسي 1
رناساوت 1
إجمالي حجم التفاعل 10

الجدول 3: المزيج الرئيسي 2 لتحويل cDNA.

مكونات PCR الحجم (بالميكرولتر) / التفاعل
10x PCR العازلة 2
2 مللي متر dNTP 2
التمهيدي الأمامي (5 ميكرومتر) 1
التمهيدي العكسي (5 ميكرومتر) 1
تاك بوليميراز 0.2
قالب cDNA (50-100 نانوغرام) 1
ماء Milli-Q معقم 12.8
إجمالي حجم التفاعل 20
 

الجدول 4: المزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي.

درجة الحرارة الوقت رقم الدورات
تمسخ 95 درجة مئوية 5 دقائق × 1
تمسخ 95 درجة مئوية 30 ثانية س 35
الصلب 50-60 درجة مئوية 30 ثانية
امتداد 72 درجة مئوية 30 ثانية
التمديد النهائي 72 درجة مئوية 10 دقائق × 1

الجدول 5: ظروف تضخيم PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

hiPSCs هي أداة قوية لدراسة تطور الأعضاء والأنسجة في المختبر. يمكن أن يساعد تلخيص النمط الظاهري للمرض من خلال التمييز بين hiPSCs الصحية مقابل hiPSCs الخاصة بالمرض تجاه سلالة الشبكية في اكتساب رؤى أحدث حول الفيزيولوجيا المرضية لأشكال مختلفة من ضمور الشبكية الموروث. تم وصف العديد من البروتوكولات واعتمادها للتمايز في المختبر ل PSCs إلى أنواع خلايا الشبكية. معظمها ينطوي على استخدام وسط استزراع يحتوي على كوكتيلات معقدة من عوامل النمو المؤتلفة ، والمكملات الغذائية ، والجزيئات الصغيرة ، والكواشف ، مثل: مكملات N1 و N2 و B27. حاصرات إشارات BMP و TGFβ مثل Noggin و SB431542 و LDN193189 و Follistatin أو المحرضات مثل Activin A و Lefty و IDE1 ؛ حاصرات إشارات Wnt المتعارف عليها مثل DKK1 و SFRP و IWP-2 و IWR-1-endo ، أو المحرضات مثل CHIR99021 و SB216763 و CKI-7 ؛ حاصرات إشارات مستقبلات FGF مثل PD0325901 و PD173074 أو محرضات مثل bFGF ؛ مثبطات إشارات الشق مثل DAPT ؛ جزيئات إشارات أخرى مثل عامل النمو الشبيه بالأنسولين (IGF-1) ؛ حمض الريتينويك هرمونات النمو مثل ثلاثي يودوثيرونين (T3) وهيدروكورتيزون. ومضادات الأكسدة وغيرها من العوامل المؤيدة للبقاء على قيد الحياة مثل حمض الأسكوربيك ، نيكوتيناميد ، توراين ، حمض دوكوساهيكسانويك ، 1-ثيوجلسرين ، إلخ. يتم تضمين هذه المكونات في وسط المزرعة في مراحل مختلفة من تمايز الخلايا الجذعية لتحفيز أو تعديل شلالات الإشارات المختلفة للحث على الالتزام بنسب العين والشبكية11،12،13،14،15،16،17،18،19،20،21،22.

هنا ، يتم وصف طريقة أبسط وقوية وفعالة لتوليد عضويات شبكية العين مباشرة من الثقافات شبه المتقاربة والملتصقة من hiPSCs. يتضمن البروتوكول المبسط استخدام عدد أقل من المكملات الغذائية وعوامل النمو والجزيئات الصغيرة التي تؤدي في المقام الأول إلى التمايز الأولي ل PSCs في سلالة الأديم الظاهر العصبي. تعتمد خطوات التمايز اللاحقة على القدرة المتأصلة ل PSCs على التمايز بشكل متزامن في نوع الخلية من السلالات ذات الصلة ، والتي تقوم بعد ذلك بالتنظيم الذاتي والتنظيم المتبادل للتطور والتنظيم المكاني لأنواع الخلايا المتعددة التي تساهم في تكوين الأنسجة المعقدة. يساعد الانسحاب التدريجي ل bFGF وإضافة Noggin في الحث الناجح للالتزام المبكر بمصير الأديم العصبي الظاهر في غضون 3 أيام من التمايز. يؤدي الحفاظ المستمر على ثقافات التمايز في RDM المحفز للأعصاب ، دون إضافة أي عوامل نمو أو جزيئات صغيرة ، إلى تحريض الهياكل البدائية لمجال العين (EFP) بهوامش واضحة ، في غضون 3-4 أسابيع من التمايز. تحتوي العبوات الناسفة الخارقة على خلايا سلفية متعددة القدرات ، والتي عند الصيانة المستمرة وغير المضطربة ، تؤدي إلى تمايز متعدد السلالات وتجميع ذاتي لتشكيل EFPs معقدة تتكون من أكواب شبكية عصبية مركزية أو أكواب بصرية (OCs) ، محاطة بأنواع خلايا العين الأخرى ذات الصلة مثل ظهارة الشبكية المصطبغة (RPE) ، ظهارة القمة العصبية ، وظهارة سطح العين. بالتناوب ، يمكن تنمية PSCs كثقافات تعليق من اليوم 1-3 لتشكيل EBs في ظل ظروف ثقافة متطابقة. يمكن طلاء EBs بشكل أكبر في اليوم 4 وتنميتها كمزارع ملتصقة على الأسطح المطلية بالمصفوفة في RDM لبدء تمايز نسب الشبكية ، كما هو موضح أعلاه. تؤدي الثقافات المتمايزة الصحية بشكل روتيني إلى حوالي 20-30 EFPs لكل بئر من صفيحة 6 آبار. يمكن حصاد OCs من EFPs في 3-4 أسابيع من تمايز الشبكية ويتم الاحتفاظ بها في مزارع معلقة لمدة 30-60 يوما أخرى ، لتمكين تمايز أسلاف الشبكية العصبية وتوليد عضويات شبكية ناضجة. بعد 4 أسابيع من زراعة التعليق ، يظل حوالي 70٪ -80٪ من الأكواب البصرية الملتقطة من العبوات الناسفة الخارقة سليمة ، وتحتفظ بتصفيحها ، وتتطور إلى عضويات شبكية ناضجة (OC-2M) ، مع خلايا مستقبلات ضوئية ملتزمة RCVRN + و CRX + وامتدادات تشبه الجزء الداخلي داخل الطبقات الخارجية.

يعد التقاء ثقافات iPSC المتنامية أمرا بالغ الأهمية في وقت بدء التمايز وتحويل الثقافات إلى DIM. الثقافات ذات المستعمرات الأصغر والالتقاء أقل من 60٪ ، وتلك التي تتمايز مبكرا ، تؤدي إلى انخفاض كبير في أعداد العبوات الناسفة الخارقة. عندما تظهر مجموعات حقل العين ، يجب حصاد الجزيرة المركزية من الكؤوس العصبية الشبكية في غضون 1 أسبوع. يمكن القيام بذلك عن طريق دفع ورفع الأكواب السليمة برفق باستخدام الزاوية أو المنطقة المنحنية للطرف الشعري الزجاجي المسحوب باللهب ، كما هو موضح في قسم البروتوكول. يجب الحرص على عدم إتلاف الكؤوس. مزيد من التأخير في اختيار من شأنه أن يؤدي إلى تسطيح وفقدان تنظيم 3D بسبب انتشار وهجرة الخلايا السلفية العصبية الشبكية، مما يجعل الحصاد صعبا ويؤدي إلى عضويات شبكية غير نمطية.

تختلف كفاءة تحريض مجال العين ونضج الكؤوس الشبكية بين أمراض مختلفة أو خطوط hiPSC الخاصة بالمريض ، اعتمادا على العيوب الوراثية الأساسية. على سبيل المثال ، كان التزام نسب الشبكية وكفاءة تشكيل EFP لخط خاص بمرض RP مطابقا لخلايا التحكم السليمة ، في حين فشل خط RB1 الفارغ في تكوين EFPs (البيانات غير معروضة). شكلت بعض الخطوط التي تحمل طفرات مرتبطة بداء ليبر الخلقي الخارقة غير النمطية مع عيوب في حجمها ، والتجميع الذاتي ، والتصفيح ، ونضج أسلاف الشبكية (البيانات غير معروضة). سيكون من الضروري إجراء المزيد من عمليات التحقق الجزيئي وتوصيف التعبير الجيني لعضويات الشبكية الخاصة بالمريض مقارنة بأنسجة التحكم السليمة لفهم الفيزيولوجيا المرضية لحالة المرض. بالنظر إلى التباين في جينومات المريض ومشاركة الشبكات متعددة الجينات في مظاهر المرض ، قد يكون من المهم أيضا دراسة عضويات الشبكية المشتقة من خطوط iPSC متساوية المنشأ لإنشاء ارتباط مطلق بين النمط الجيني والنمط الظاهري في دراسات نمذجة المرض. يمكن إنشاء مثل هذه الخطوط المتجانسة إما عن طريق الضربات القاضية الجينية المستهدفة في خطوط التحكم الصحية أو عن طريق تصحيح الطفرات المسببة للأمراض في iPSCs الخاصة بالمريض ، باستخدام تقنيات تحرير الجينوم المتقدمة 8,9.

يمكن استخدام هذه العضويات الشبكية السليمة المشتقة من خطوط iPSC العادية أو الخاصة بالمرض في فحص واختبار الأدوية الجديدة. يمكن عزل سلائف المستقبلات الضوئية داخل عضويات الشبكية وأنواع خلايا العين الأخرى ، مثل RPE وظهارة القرنية داخل نواتج EFP ، وإثرائها لتطبيقاتها في البحوث الأساسية والطب التجديدي. يمكن اعتماد البروتوكول الموصوف هنا بسهولة في العمليات المتوافقة مع GMP لإعداد خلايا الصف السريرية المخصصة للتقييمات قبل السريرية والتجارب السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

جميع المؤلفين ليس لديهم تضارب في المصالح أو إفصاحات مالية.

Acknowledgments

يقر المؤلفون بالدعم العلمي والتقني من الدكتورة شيترا كانابيران ، عالمة الوراثة. د. سوبهادرا جلالي، استشاري الشبكية. الدكتور ميليند ، جراح تجميل العين. والدكتور سواثي كاليكي ، أخصائي أورام العين في معهد LV Prasad للعيون ، حيدر أباد نحو توليد خطوط iPSC طبيعية ومحددة للمريض. يقر المؤلفون بمنح البحث والتطوير من مجلس أبحاث العلوم والهندسة ، قسم العلوم والتكنولوجيا (IM) ، (SB / SO / HS / 177/2013) ، قسم التكنولوجيا الحيوية (IM) ، (BT / PR32404 / MED / 30/2136/2019) ، وزمالات بحثية عليا من ICMR (S.M. ، D.P.) ، UGC (T.A.) ، و CSIR (V.K.P.) ، حكومة الهند.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Syringe filters TPP 99722 
15 mL centrifuge tube TPP 91015
50 mL centrifuge tube TPP 91050
6 well plates TPP 92006
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal Santa Cruz SC365519 1:50 dilution
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal Abcam ab140603 1:300 dilution
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal Abcam ab3201 1:250 dilution
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal      Millipore AB5585 1:300 dilution
B-27 Supplement (50x), serum free Thermo Fisher 17504044
Basic Fibroblast growth factor (bFGF) Sigma Aldrich F0291
Centrifuge 5810R Eppendorf
Coplin Jar (50 mL) Tarson
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix Corning 354277
CryoTubes Thermo Fisher V7884
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) Thermo Fisher 10565-018
DreamTaq DNA polymerase Thermo Fisher EP0709
Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 14190144
Essential 8 medium kit Thermo Fisher A1517001
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma Aldrich E5134
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm  Corning 351007
Fetal Bovine Serum, qualified, United States  Gibco 26140079
GelDocXR+ with Image lab software BIO-RAD Agarose Gel documentation system 
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher 35050061
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 1:300 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 Invitrogen A11030 1:300 dilution
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 Invitrogen A11035 1:300 dilution
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 1:300 dilution
HistoCore MULTICUT Leica For sectioning
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher 10828028
L-Acsorbic acid Sigma Aldrich A92902
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher 11140-050
N2 supplement (100x) Thermo Fisher 17502048
NanoDrop 2000 Thermo Fisher To quantify RNA
Paraformaldehyde Qualigens 23995
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged Corning 7095D-9
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher 15140-122
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal Abcam ab183951 1:300 dilution
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal Abcam ab195045 1:300 dilution
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal Abcam ab231782 1:300 dilution
Recombinant Human Noggin Protein R&D Systems 6057-NG
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
Serological pipettes 10 mL TPP 94010
Serological pipettes 5 mL TPP 94005
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Sodium Citrate Tribasic dihydrate Sigma Aldrich S4641
Starfrost (silane coated) microscopic slides Knittel
SuperScript III First-Strand Synthesis System Thermo Fisher 18080051
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Invitrogen 18080051
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
TRIzol Reagent Invitrogen 15596026
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI  Vector laboratories H-1200 
Vitronectin Thermo Fisher A27940
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) Sigma Aldrich Y0503
Zeiss LSM 880 Zeiss Confocal microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
  2. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  3. Sen, P., et al. Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years. Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).
  4. Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. Trend of retinal diseases in developing countries. Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).
  5. RetNet - Retinal Information Network. , Available from: https://sph.uth.edu/retnet/ (2022).
  6. Cicero, S. A., et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).
  7. Guo, Y., et al. Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361 (2019).
  8. Lane, A., et al. Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids. Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).
  9. Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).
  10. Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
  11. Meyer, J. S., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).
  12. Zhu, J., Lamba, D. A. Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (12), 2882 (2018).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  14. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  15. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
  16. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
  17. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  18. Chichagova, V., et al. Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95 (2019).
  19. Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal. STAR Protocols. 1 (1), 100033 (2020).
  20. Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
  21. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  22. Mellough, C. B., et al. IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).
  23. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 190 ، الخلايا الجذعية ، iPSCs ، تمايز الشبكية ، مجال العين البدائي ، عضويات الشبكية ، ظهارة الشبكية المصطبغة
توليد عضويات الشبكية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان وأمراض الشبكية الصحية والخاصة بأمراض الشبكية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mahato, S., Agrawal, T., Pidishetty, … More

Mahato, S., Agrawal, T., Pidishetty, D., Maddileti, S., Pulimamidi, V. K., Mariappan, I. Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (190), e64509, doi:10.3791/64509 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter