Summary
Denne protokol beskriver en effektiv metode til at differentiere hiPSC'er i øjenfeltklynger og generere neuro-retinale organoider ved hjælp af forenklede dyrkningsbetingelser, der involverer både vedhængende og suspensionskultursystemer. Andre okulære celletyper, såsom RPE og hornhindepitel, kan også isoleres fra modne øjenfelter i retinale kulturer.
Abstract
Pluripotente stamceller kan generere komplekse vævsorganoider, der er nyttige til in vitro sygdomsmodelleringsundersøgelser og til udvikling af regenerative terapier. Denne protokol beskriver en enklere, robust og trinvis metode til generering af retinale organoider i et hybridkultursystem bestående af klæbende enkeltlagskulturer i løbet af de første 4 uger af retinal differentiering indtil fremkomsten af forskellige, selvorganiserede øjenfeltprimordiale klynger (EFP'er). Endvidere plukkes de doughnutformede, cirkulære og gennemskinnelige neuro-retinale øer inden for hver EFP manuelt og dyrkes under suspension ved hjælp af ikke-klæbende kulturskåle i et retinalt differentieringsmedium i 1-2 uger for at generere flerlags 3D-optiske kopper (OC-1M). Disse umodne retinale organoider indeholder PAX6+ og ChX10+ proliferationerende, multipotente retinale forløbere. Forløbercellerne er lineært selvsamlede inden for organoiderne og fremstår som forskellige radiale striber. Ved 4 uger efter suspensionskultur gennemgår retinale forfædre postmitotisk anholdelse og afstamningsdifferentiering for at danne modne retinale organoider (OC-2M). Fotoreceptorafstamningen begik forstadier udvikler sig inden for de yderste lag af retinale organoider. Disse CRX+ og RCVRN+ fotoreceptorceller modnes morfologisk til at vise indre segmentlignende udvidelser. Denne metode kan anvendes til generering af retinale organoider ved hjælp af humane embryonale stamceller (hESC'er) og inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er). Alle trin og procedurer er tydeligt forklaret og demonstreret for at sikre replikabilitet og til bredere anvendelser inden for grundvidenskab og translationel forskning.
Introduction
Nethinden er et lysfølsomt væv til stede bag på hvirveldyrets øje, der omdanner lyssignaler til nerveimpulser ved et biokemisk fænomen kendt som fototransduktionsvejen. De indledende nerveimpulser, der genereres i nethindens fotoreceptorceller, transduceres til andre retinale interneuroner og retinale ganglionceller (RGC'er) og når hjernens visuelle cortex, hvilket hjælper med billedopfattelse og visuel respons.
Ifølge Verdenssundhedsorganisationen (WHO) er anslået 1,5 millioner børn blinde, hvoraf 1 million er i Asien. Arvelig retinal dystrofi (IRD) er en alvorlig blindende sygdom, der rammer 1 ud af 4.000 individer over hele verden 1,2,3, mens forekomsten af blindhed forbundet med aldersrelateret makuladegeneration (AMD) varierer fra 0,6% -1,1% i udviklingslande 4. IRD'er er forårsaget af arvelige genetiske defekter i over 300 forskellige gener, der er involveret i retinal udvikling og funktion5. Sådanne genetiske ændringer resulterer i forstyrrelse af normale retinale funktioner og gradvis degeneration af retinale celler, nemlig fotoreceptorcellerne og det retinale pigmenterede epitel (RPE), hvilket fører til alvorligt synstab og blindhed. Der er gjort enorme fremskridt under andre blændende forhold, der involverer hornhinden, linsen osv. Imidlertid har retinale dystrofier og optiske nerveatrofier ikke nogen dokumenteret terapi til dato. Da en voksen menneskelig nethinde ikke har stamceller6, kan alternative kilder såsom embryonale stamceller (ESC'er) og patientafledte inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) give et ubegrænset udbud af ønskede celletyper og have et stort løfte om udvikling af komplekse vævsorganoider, der kræves til in vitro-sygdomsmodelleringsundersøgelser og til udvikling af regenerative terapier7, 8,9,10.
Flere års retinal forskning har ført til en bedre forståelse af molekylære begivenheder, der orkestrerer tidlig retinal udvikling. De fleste protokoller til generering af retinale celler og 3D-organoider fra PSC'er sigter mod at rekapitulere disse udviklingsbegivenheder in vitro ved at dyrke cellerne i en kompleks cocktail af vækstfaktorer og små molekyler for at modulere de kendte biologiske processer trinvist. De retinale organoider, der således genereres, består af store retinale celler: retinale ganglionceller (RGC'er), interneuroner, fotoreceptorer og retinal pigmenteret epitel (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. På trods af vellykkede forsøg på at modellere IRD'er ved hjælp af retinale organoider udgør kravet om den komplekse cocktail af vækstfaktorer og små molekyler under differentiering og den relativt lave effektivitet af retinal organoidgenerering en stor udfordring med de fleste protokoller. De omfatter hovedsageligt dannelsen af embryoidlegemer efterfulgt af deres trinvise differentiering i retinale slægter ved hjælp af komplekse kulturbetingelser på forskellige stadier af in vitro-udvikling 20,21,22.
Her rapporteres en forenklet og robust metode til udvikling af komplekse 3D neuro-retinale organoider fra sund kontrol og retinale sygdomsspecifikke hiPSC'er. Protokollen beskrevet her anvender direkte differentiering af nær-sammenflydende hiPSC-kulturer uden behov for embryoid kropsdannelse. Kompleksiteten af kulturmediet er også forenklet, hvilket gør det til en omkostningseffektiv og reproducerbar teknik, der let kan vedtages af nye forskere. Det involverer et hybridkultursystem bestående af vedhængende enkeltlagskulturer i løbet af de første 4 uger af retinal differentiering indtil fremkomsten af forskellige, selvorganiserede øjenfeltprimordialklynger (EFP'er). Endvidere plukkes de cirkulære neuro-retinale øer inden for hver EFP manuelt og dyrkes i suspensionskulturer i 1-2 uger for at forberede flerlags 3D retinale kopper eller organoider bestående af PAX6 + og CHX10 + prolifererende neuro-retinale forløbere. Udvidet dyrkning af retinale organoider i 100 μM taurinholdigt medium i yderligere 4 uger resulterede i fremkomsten af RCVRN + og CRX+ fotoreceptorprækursorer og modne celler med rudimentære indre segmentlignende forlængelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter, der involverede hiPSC'er, blev udført aseptisk i overensstemmelse med standardlaboratoriepraksis, etiske og biosikkerhedsretningslinjer og med godkendelse fra tilsynsorganer som Institutional Ethics Committee (IEC), Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR) og Institutional Bio-Safety Committee (IBSC).
1. Fremstilling af iPSC-kultur og retinalt differentieringsmedium og reagenser
- iPSC kultur og vedligeholdelsesmedium
- Dyrk og vedligehold den normale hiPSC-linje23 (hiPSC-F2-3F1) og en CRISPR-redigeret, RB1-/- hiPSC-linje (LVIP15-RB1-CS3, med biallelisk, frameshift-deletion af 10 bp inden for exon 18 af det humane RB1-gen) i Essential 8-medium på matrigelbelagte (kældermembranmatrixbelagt; se materialetabel) dyrkningsplader under føderfrie dyrkningsforhold.
BEMÆRK: Denne protokol kan gøres helt xenofri ved at erstatte kældermembranmatrixen med den rekombinante vitronectin (VTN-N) belægning. Forbered komplet Essential 8 medium ved at tilføje 50x Essential 8 supplement (leveres med Essential 8 medium kit; se tabel over materialer) og 100 E / ml Penicillin-Streptomycin opløsninger. Alternativt kan hiPSC'erne også dyrkes ved hjælp af det komplette mTeSR1-medium.
- Dyrk og vedligehold den normale hiPSC-linje23 (hiPSC-F2-3F1) og en CRISPR-redigeret, RB1-/- hiPSC-linje (LVIP15-RB1-CS3, med biallelisk, frameshift-deletion af 10 bp inden for exon 18 af det humane RB1-gen) i Essential 8-medium på matrigelbelagte (kældermembranmatrixbelagt; se materialetabel) dyrkningsplader under føderfrie dyrkningsforhold.
- Celledissociationsopløsning (1x CDS)
- For en enzymfri dissociation og overførsel af humane iPSC'er fremstilles CDS indeholdende 0,5 mM EDTA, pH 8,0 og 30 mM NaCl i 1x Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) (se materialetabel).
- For at forberede 100 ml 1x CDS tilsættes 100 μL 0,5 M EDTA og 1 ml 3 M NaCl-stamopløsninger til 99 ml 1x DPBS, blandes godt og filtreres steriliseres ved hjælp af et 0,22 μm filter.
- Differentieringsinduktionsmedium (DIM)
- Forbered DIM ved hjælp af DMEM-F12 Basalmedium suppleret med 10% Knockout Serum Replacement (KOSR), 1x Non-Essential Amino Acid (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 E / ml Penicillin-Streptomycin, 200 μM L-Ascorbinsyre og 1% N2 supplement (se materialetabel).
- Retinal differentieringsmedium (RDM)
- Forbered RDM ved hjælp af DMEM-F12 Basalmedium suppleret med 10% Knockout Serum (KOSR), 1x ikke-essentiel aminosyre (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U / ml Penicillin-Streptomycin, 200 μM L-ascorbinsyre og 2% B27 supplement (med vitamin A) (se tabel over materialer).
- Ekstracellulære matrixbelagte cellekulturoverflader
- Den hESC-kvalificerede kældermembranmatrix natten over tøs op i en isspand, helst inde i et køleskab ved 4-8 °C. Fortynd den optøede 100x matrixstamme (5 ml) i forholdet 1:5 ved at tilsætte 20 ml iskold DMEM-F12 basalmedium og bland ved forsigtig hvirvling for at forberede en 20x stamopløsning.
- Tilbered 0,5 ml alikvoter på is ved hjælp af forkølede pipettespidser og sterile mikrocentrifugerør. Mærk hætteglassene som 20x lager og opbevar dem frosne i en -80 °C fryser i op til 6 måneder.
- Til belægning af cellekulturoverfladerne (dyrkningsskåle eller plader med 6 brønde) optø en alikvot 20x matrix på is og fortynd den i forholdet 1:20 ved hjælp af iskold DMEM-F12 basalmedium til fremstilling af 10 ml 1x matrixbelægningsopløsning, hvilket er tilstrækkeligt til at belægge en 100 mm skål eller en 6-brønds plade (1,5 ml / brønd).
BEMÆRK: Forafkøl pipetterne/mikrospidserne ved at opsuge iskold og steril DPBS, før matrixopløsningen håndteres. Optøning og al håndtering af matrixen skal ske på is ved hjælp af forkølede pipetter/mikrospidser for at undgå polymerisering og gelering ved stuetemperatur. - Tilsæt 1,5 ml 1x matrixbelægningsopløsning til hver brønd i en 6-brønds plade, hvirvl forsigtigt pladen for at sikre jævn belægning, og inkuber pladerne ved 37 ° C i en 5% CO2 -inkubator. Lad pladerne stå uforstyrret i mindst 1 time for at sikre ensartet belægning af matrixen på dyrkningsoverfladerne.
- Før podning af cellerne suges belægningsopløsningen ud med en 5 ml steril pipette og kasseres det flydende affald. Tilsæt straks frisk dyrkningsmedium (2 ml / hul af en 6-brøndplade) og frø cellerne med en densitet på 150.000-200.000 celler / brønd. Lad ikke pladerne tørre under håndtering.
BEMÆRK: Alternativt kan rekombinant vitronectin (VTN-N) belægning ved en slutkoncentration på 0,5 μg / ml anvendes til en xenofri kulturprotokol.
- Den hESC-kvalificerede kældermembranmatrix natten over tøs op i en isspand, helst inde i et køleskab ved 4-8 °C. Fortynd den optøede 100x matrixstamme (5 ml) i forholdet 1:5 ved at tilsætte 20 ml iskold DMEM-F12 basalmedium og bland ved forsigtig hvirvling for at forberede en 20x stamopløsning.
2. Etablering af humane iPSC-kulturer
- Optøning og genoplivning af hiPSC'er
- Overtræk en brønd i en 6-brønds plade med 1x membranmatrixopløsning. Der inkuberes ved 37 °C i 1 time for at muliggøre polymerisation og ensartet belægning af dyrkningsoverfladen.
- Efter 1 times inkubation fjernes belægningsopløsningen, og der tilsættes 1 ml forvarmet komplet Essential 8-medium indeholdende 10 μM rhokinasehæmmer, Y-27632 (1 μL/ml 10 mM stam; se materialetabellen), før cellerne genoplives.
- Fjern en hiPSC-kryoialstamme (1 x 106 celler/hætteglas) fra beholderen med flydende nitrogen. Kryovialen tøs hurtigt op i et 37 °C vandbad med let hvirvlende.
BEMÆRK: Optø ikke hætteglasset helt; Notér passagenummeret, overfladesteriliser hætteglasset, og tør det af med en fnugfri vatpind indeholdende 70% isopropylalkohol. - Brug en steril 1 ml pipettespids til at opsuge kryovialt indhold til et frisk 15 ml rør bestående af 2 ml forvarmet komplet Essential 8-medium uden Y-27632. Centrifuger glasset ved 1.000 x g i 4 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres.
- Resuspender cellepellet i 1,0 ml komplet Essential 8-medium indeholdende 10 μM Y-27632.
- Tilføj denne cellesuspension på de matrixbelagte overflader uden at forstyrre matrixen ved at dispensere den langs væggene. Rock pladen forsigtigt på tværs for at sikre en jævn fordeling af celler.
- Pladerne inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator for at lade cellerne klæbe sammen og begynde at proliferere.
- Efter 12-24 timer udskiftes det brugte medium, og kulturerne opretholdes i forvarmet komplet Essential 8-medium uden Y-27632.
- Skift kulturmediet hver 24. time og passage kulturerne, når de når 70% -80% sammenløb.
BEMÆRK: Et splitforhold på 1:6 følges rutinemæssigt for hiPSC-kulturer og passeres med regelmæssige intervaller på 3-4 dage.
- Passaging og plating af hiPSC'er for at initiere retinal afstamningsdifferentiering
- Opsug det brugte medium fra 70% -80% sammenflydende humane iPSC-kulturer i 6-brønds plader.
- Der tilsættes 1 ml CDS (trin 1.2) til hvert hul og inkuberes ved 37 °C i 5-7 minutter, indtil cellerne runder op. Fjern forsigtigt CDS'et, pas på ikke at løsne cellerne, og tilsæt 2 ml frisk Essential 8 medium og triturer forsigtigt ved hjælp af en pipette.
- Opsaml cellesuspensionen fra et hul i en 6-celleplade i et 15 ml centrifugerør og drej røret ved 1.000 x g i 4 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres.
- Cellepellet resuspenderes i 1,2 ml Essential 8-medium, og 200 μL af celle 200 μL af cellesuspensionen (1:6 splitforhold) hældes i hvert hul i en matrixbelagt 6-brønds plade indeholdende 1,5 ml iPSC-kulturmedium indeholdende 10 μM Y-27632, som beskrevet i trin 1.5.
- Efter 12-24 timer udskiftes det brugte medium, og kulturerne opretholdes i forvarmet komplet Essential 8-medium uden Y-27632.
- Skift kulturmediet hver 24. time, indtil kulturerne når 70% -80% sammenløb.
3. Differentiering af hiPSC'er i øjenfelter og retinal afstamning
BEMÆRK: En skematisk oversigt over differentieringsprocessen er vist i figur 1.
- Start differentieringsproceduren, når hiPSC-kulturerne når 70%-80% sammenløb.
- På dag 0 ændres hiPSC-vedligeholdelsesmediet til DIM (trin 1.3), der indeholder 1 ng/ml bFGF og 1 ng/ml Noggin. Der tilsættes 2,0 ml medium pr. hul i en plade med 6 huller, og cellerne holdes ved 37 °C i en 5 % CO2 -inkubator.
BEMÆRK: Gradvis tilbagetrækning af bFGF inducerer differentieringen af PSC'er, og tilføjelsen af stigende koncentrationer af Noggin (hæmmer af flere BMP'er) i de indledende faser inducerer ektodermal afstamningsdifferentiering og neuralisering11,12 og blokerer mesoderm og endoderm forpligtelsen. Alternativt kan Noggin erstattes af LDN193189. I modsætning til den dobbelte SMAD-hæmningsstrategi, der tidligere blev rapporteret20,21, kræver denne protokol ikke tilføjelse af Activin eller SB-431542. - På dag 1 skiftes det brugte medium, og der tilsættes DIM indeholdende 1 ng/ml bFGF og 10 ng/ml Noggin. Tilsæt 2,0 ml pr. hul på en plade med 6 brønde. Cellerne inkuberes og vedligeholdes ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator.
- På dag 2-3 fjernes det brugte substrat, og der tilsættes DIM indeholdende kun 10 ng/ml Noggin. Tilsæt 2,0 ml pr. hul på en 6-brønds plade, og skift mediet hver 24. time. Cellerne inkuberes og vedligeholdes ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator.
BEMÆRK: Forvarm altid dyrkningsmediet til 30-37 °C før brug. Overskydende floaters og døde celler kan observeres i tidlige differentieringskulturer. Under sådanne forhold vaskes kulturerne en gang med 1x DPBS og tilsættes retinal differentieringsmedium. Sterilitetstest på det brugte medium kan udføres ugentligt eller efter behov. - På dag 4 skal du fjerne det brugte medium og tilføje RDM (trin 1.4). Tilsæt 2,0 ml pr. hul i en 6-brønds plade, og fortsæt med at opretholde kulturerne i RDM ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator med et frisk mediumskift hver dag.
BEMÆRK: Alternativt kan PSC'erne dyrkes som suspensionskulturer fra dag 1-3 i ikke-klæbende og rundbundede plader med 96 brønde ved en celletæthed på 5 x 103 celler/100 μL/brønd for at danne embryoidlegemer (EB'er) under identiske dyrkningsbetingelser i DIM. Velformede EB'er på dag 4 kan belægges på matrixbelagte plader, der indeholder RDM, og får lov til at klæbe fast. sprede sig og differentiere som beskrevet nedenfor. - Omkring dag 14-18 observeres kulturerne under et mikroskop ved 10x forstørrelse for fremkomsten af neurale rosetlignende domæner bestående af tidlige øjenfeltforfædre (figur 2B).
- Omkring dag 21-28 (3-4 uger) observeres kulturer under et mikroskop ved 4x og 10x forstørrelse for at observere fremkomsten af selvorganiserede, forskellige EFP'er med en central ø af cirkulære 3D neuro-retinale strukturer omgivet af sammenhængende udvækst af neuroepitel og okulært overfladeepitel (figur 2C, D).
BEMÆRK: Der kan observeres ca. 20-30 EFP'er pr. brønd i en 6-brønds plade med en normal hiPSC retinal differentieringskultur. Dette tal kan variere med andre sygdomsspecifikke hiPSC-linjer baseret på deres genetiske baggrund og retinale afstamningsdifferentieringspotentiale.
4. Høstning af retinale organoider
- Flammetrækning af Pasteur-pipetter af glas til manuel plukning af nethindebægre.
BEMÆRK: Brug autoklaverede og sterile Pasteur-pipetter af glas til øjenfeltplukning.- Tænd for en bunsenbrænder. Tag en steril Pasteur-pipette og hold basen i den ene hånd og kapillærspidsen i den anden. Flammesteriliser og opvarm området nær midten af kapillærspidsen med rotationsbevægelser, indtil glasset bliver bøjeligt. Flyt derefter væk fra flammen og træk hurtigt udad for at skabe en fin kapillærspids med et lukket lumen.
- Hold den fine spids vandret foran flammen og før den hurtigt gennem flammen i en udadgående bevægelse for at skabe en glat krog eller en L-formet kapillærspids.
- Brug kapillærkrogens glatte ydre krumningszone som en fin skefuld til forsigtigt at løfte og løsne de intakte neuro-retinale kopper fra EFP-klyngerne.
BEMÆRK: Den glatte vinkel på glaskapillærkrogen forårsager hverken skade på cellerne eller skaber ridser på kulturoverflader. Dette enkle værktøj kan også effektivt bruges til individuel hiPSC-koloniopdeling i gittermønstre og til at passere dem som små celleklynger under klonal ekspansion.
- Dyrkning og vedligeholdelse af retinale kopper til generering af 3D retinale organoider.
- På dag 25-30 tilsættes 4,0 ml forvarmet retinalt differentieringsmedium i en 60 mm skål med lav fastgørelse, inden der forberedes høst af neuro-retinale kopper.
- Arbejd under et stereomikroskop ved 0,63x-4,5x forstørrelse for at observere og manuelt vælge velformede neuro-retinale kopper fra individuelle EFP'er.
BEMÆRK: Udseendet af pigmenterede RPE-celleudvækst hjælper med nem identifikation af EFP'er og de centralt placerede neuro-retinale kopper. Nethindekopperne fremstår som doughnutformede, cirkulære og gennemskinnelige 3D-strukturer med klare radiale striber, dannet af de lineært arrangerede og selvmonterede retinale stamceller, i modsætning til de tæt pakkede og sfæriske eller uregelmæssige klynger dannet af CNS-neuronerne eller de neurale kamceller23. - Brug de flammetrukne Pasture-pipettekroge til forsigtigt at skubbe og øse den centrale neuronethindeø ud inden for individuelle EFP'er.
- Indstil en 1 ml mikropipette til at aspirere 100 μL, og brug 1 ml mikrospidser med brede boreåbninger til at aspirere og overføre de flydende retinale kopper til de friske, lavklæbende kulturskåle, der er tilberedt i trin 4.2.1.
BEMÆRK: Brug af spidser med en mindre borestørrelse og højere sugetryk kan forårsage klipning og påvirke integriteten af retinale kopper. De omtrentlige dimensioner af retinale kopper er ca. 1-2 mm i diameter. - Retinale kopper i RDM vedligeholdes som ikke-klæbende suspensionskulturer og inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator.
- Dag 30-45: Skift mediet dagligt ved forsigtigt at vippe fadet og lade nethindekopperne sætte sig i ca. 30 sekunder. Følg en delvis fodringsmetode, fjern halve mængder brugt medium og erstat med lige store mængder frisk medium.
BEMÆRK: Undgå gentagen aspiration og overførsler for at forhindre beskadigelse af retinale kopper. Efter 1-2 ugers suspensionskultur vokser retinale kopper lidt i størrelse (1-3 mm) og udvikler sig til selvorganiserede 3D retinale organoider (OC-1M) bestående af lineært arrangerede, tidlige neuro-retinale forfædre, der udtrykker PAX6 og CHX10 (figur 3Bi). - Dag 45-60: Dyrk retinale organoider i yderligere 4 uger i RDM indeholdende 100 μM taurin (se materialetabel) for at understøtte bedre overlevelse og afstamningsdifferentiering af neuro-retinale forfædre og udvikling af moden retinal celletype (OC-2M).
BEMÆRK: Ca. 70% -80% af retinale eller optiske kopper plukket fra EFP'er forbliver intakte, bevarer deres laminering og udvikler sig til modne retinale organoider efter 4 ugers suspensionskultur (OC-2M). - Kontroller, at de modne retinale organoider ved 4 ugers suspensionskultur viser fremkomsten af RCVRN + og CRX+ fotoreceptorprækursorer og modne celler med en rudimentær indre segmentlignende forlængelse i de yderste cellelag, hvilket rekapitulerer den normale retinale udviklings- og modningsproces in vitro (figur 3Bii).
BEMÆRK: Efter fjernelse af neuro-retinale kopper kan differentieringskulturerne kontinuerligt opretholdes i RDM. De proksimale epiteludvækst, der omgiver neuronethinden, indeholder retinale pigmenterede epitelcelleforstadier (RPE), som yderligere udvides og modnes til dannelse af pigmenterede RPE-monolag med typisk brostensmorfologi (figur 4). De distale udvækst består overvejende af okulært overfladeepitel, der bidrager til linsen oghornhindepitelet. Ønskede celletyper kan høstes fra forskellige zoner af EFP-udvækst og beriges yderligere for at etablere rene kulturer.
5. Karakterisering af retinale organoider
- Morfologisk og molekylær karakterisering
- Observer de klæbende EFP'er og flydende retinale organoider under et fasekontrastmikroskop ved 4x og 10x forstørrelse og dokumentere deres morfologi og dimensioner.
- Ca. 20 retinale organoider samles på forskellige modningsstadier (trin 4.2.3-4.2.6) i 1,5 ml mikrocentrifugerør ved hjælp af 1.000 μL spidser med bred boring. Lad organoiderne slå sig ned i bunden og sug mediet ud. Vask kopperne med 1x PBS.
- Fjern overskydende PBS og tilsæt 1,0 ml TRIzol-reagens (se materialetabel). Inkuber ved stuetemperatur i 5 min. Homogeniser vævet ved hjælp af en rørpestle og triturat ved hjælp af en 1,0 ml pipette.
- Forbered total RNA ved at følge standardreagensmetoden til RNA-isolering og oprensning i henhold til producentens anvisninger (se materialetabel).
- Kontroller RNA-kvaliteten på agarosegelen og kvantificer den ved hjælp af NanoDrop-spektrofotometeret (se materialetabel).
- Konverter 1-2 μg total RNA til cDNA ved hjælp af det revers transkriptaseenzym i henhold til producentens instruktioner (se materialetabel). Se tabel 1 for en liste over genspecifikke primere.
- Kort fortalt fremstilles RNA-primer-masterblandingen i 10 μL totalvolumen som nævnt i tabel 2 og inkuberes røret ved 65 °C i 5 minutter i en termisk cyklist. Overfør røret fra den termiske cyklist til is i 2 min.
- I mellemtiden fremstilles masterblandingen 2 med de reagenser, der er nævnt i tabel 3. Denne masterblanding tilsættes til RNA-primerblandingsrøret fremstillet i trin 5.1.7. Bland forsigtigt.
- Prøven inkuberes ved 50 °C i 50 minutter, derefter 85 °C i 5 min, og derefter holdes den ved 4 °C for at standse reaktionen.
- Brug det syntetiserede cDNA som skabelon i PCR-reaktioner til at kontrollere ekspressionen af neuro-retinal stamfader og modne retinale cellemarkører.
- Normaliser de samlede cDNA-skabeloner for hver prøve, nemlig F2-UD (hiPSC-F2-3F1; udifferentierede celler), OC-1M (1 uge gammel optisk kop i suspensionskultur) og OC-2M (4 uger gammel optisk kop i suspensionskultur) ved semikvantitativ PCR ved hjælp af husholdningsgener såsom hE1fα eller GAPDH.
- Masterblandingen fremstilles til semikvantitativ PCR, som nævnt i tabel 4, og reagensglassene anbringes til amplifikation i en termisk cyklist. PCR-forstærkningsbetingelserne er nævnt i tabel 5.
- Histologi og immunhistokemi
- De optiske kopper samles i et 2,0 ml mikrocentrifugerør og suges til det overskydende medium (trin 4.2.3-4.2.6). Skyl organoiderne med 1x PBS og vask og suspender dem derefter i 500 μL 4% Paraformaldehyd for at fiksere dem natten over ved stuetemperatur.
- Den næste dag vaskes kopperne i deioniseret vand. Lad kopperne stå i 95% alkohol (tre skift, 15-20 min hver), efterfulgt af 100% alkohol (tre ændringer, 15-20 min hver), en 1:1 blanding af absolut alkohol og xylen i 15 min, xylen (to ændringer, 15 min hver) og paraffin (tre ændringer, 15 min hver). Integrer dette væv for at forberede en paraffinblok efter standardprocedurer. Lad det køle af og størkne.
- Forbered tynde sektioner (~ 4-5 μm tykkelse) ved hjælp af et mikrotom, og placer dem på silanbelagte mikroskopiske dias (se materialetabel) efter standardhistologiprocedurer.
- Til afparaffinisering opvarmes diasene ved 70 °C på en varmeblok i 15-20 min. Når voksen smelter, vaskes diasene med xylen (tre ændringer, 3-4 minutter hver), som fjerner paraffinen helt.
BEMÆRK: Ufuldstændig fjernelse af paraffin resulterer i dårlig / ujævn farvning af sektioner med en enorm mængde baggrundsstøj. - Rehydrer diasene ved hjælp af forskellige procentdele ethanol (100%, 90% og 80%) i 3 minutter hver. Skyl diasene med destilleret vand og fortsæt med antigenhentning.
- Før antigenudtagningen påbegyndes, forvarmes citratbufferen (pH 6,0) i en Coplin-krukke (se materialetabellen) ved hjælp af en mikrobølgeovn, indtil den når 95-100 °C.
- Dyp diasene i forvarmet citratbuffer og opvarm krukken i 15 minutter i en mikrobølgeovn. Fjern Coplin-krukken fra ovnen, og lad den køle af ved stuetemperatur.
- Bloker sektionerne for endogen peroxidase ved at tilsætte en 1:1 blanding af methanol og hydrogenperoxid i 5 minutter, efterfulgt af at vaske sektionerne tre gange med 1x PBS.
- Permeabiliser sektionerne med 0,5% Triton-X 100 i 15 min. Vask diasene tre gange med 1x PBS.
- Bloker den uspecifikke binding af primært antistof ved at inkubere sektionerne med 10% føtalt bovint serum (FBS) i 1x PBS i 1 time.
- Sektionerne inkuberes med primært antistof i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C. Vask diasene tre gange med 1x PBS i 3-5 minutter hver for at fjerne det ubundne antistof.
- Tilsæt egnet fluorescerende farvestofkonjugeret sekundært antistof og inkuber i 45 min. Vask diasene tre gange med 1x PBS i 3-5 min hver.
BEMÆRK: Antistofferne og deres respektive fortyndinger er nævnt i materialetabellen. De retinale organoide sektioner blev immunmærket ved hjælp af PAX6 og CHX10 til påvisning af tidlige neuro-retinale forløberceller og ved hjælp af Recoverin og CRX til at detektere engagerede retinale og fotoreceptorprecursorceller. Tilsvarende blev anti-PAX6 og anti-MITF anvendt til at detektere RPE-prækursorer, og anti-CRALBP og anti-RPE65 blev anvendt til at detektere pigmenterede modne RPE-celler ved immuncytokemi af 2D-enkeltlagskulturer. - Modbehandj sektionerne med DAPI eller PI, og monter dem på et glasglas ved hjælp af antifade-monteringsmediet (se materialetabellen).
- Billede og dokumentér de immunmærkede sektioner af retinale organoider og RPE-kulturer ved hjælp af et fluorescens- eller konfokal laserscanningsmikroskop for at undersøge forskellige cellelag, der udtrykker forskellige retinale markører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Differentiering af hiPSC'er i øjenlinjer opnås ved at dyrke cellerne i forskellige cocktails af dyrkningsmedium indeholdende kosttilskud og vækstfaktorer i sekventielle trin på forskellige tidspunkter, som beskrevet i figur 1. HiPSC-kulturerne opretholdes i Essential 8-mediet, det pluripotente stamcellevedligeholdelsesmedium. Når de når 70% -80% sammenløb (figur 2A), erstattes mediet med differentieringsinduktionsmedium (DIM) på dag 0 (se trin 3.2), der indeholder 1 ng / ml bFGF, 1 ng / ml Noggin og 1% N2 supplement. Sammen med det neurale inducerende N2-supplement spiller Noggin, BMP-signalhæmmeren, en afgørende rolle i at lede cellerne mod neuroektodermal afstamning ved at blokere mesodermal og endodermal forpligtelse. På 1., 2. og 3. dag øges koncentrationen af Noggin til 10 ng/ml (se trin 3.3 og3.4). Fra den 4. dag erstattes DIM med Retinal Differentiation Medium (RDM) (trin 3.5), og kulturerne opretholdes kontinuerligt i op til 30 dage. B27 i RDM-cocktailen indeholder yderligere kosttilskud såsom flere antioxidanter og D-Galactose, som fremmer aerob metabolisme og hjælper med at reducere oxidativ stress, hvilket forbedrer levedygtigheden af differentierende stamceller. Derudover fremmer tilstedeværelsen af retinolacetat (vitamin A) og væksthormoner såsom triiodo-I-thyronin (T3) neurale og retinale afstamningsdifferentiering.
På den 14. til 18. dag observeres dannelsen af neurale rosetter, hvilket markerer indledningen af øjenfeltengagement (figur 2B). Øjenfeltforløberne i de neurale rosetter formerer sig yderligere og organiserer sig selv i forskellige øjenfeltprimordialklynger (EFP'er) med cirkulære neuro-retinale strukturer i midten. Andre celletyper såsom retinal pigmenteret epitel (RPE), neurale kamepitel og dem, der bidrager til den okulære overflade, dukker op og migrerer ud som sammenhængende epitel med veldefinerede margener. Velformede øjenfelter, som beskrevet ovenfor, kan observeres mellem den 21. til 28. differentieringsdag (figur 2C, D). Den centrale ø af neuro-retinale kopper høstes mellem dag 25-30 ved hjælp af en flammetrukket glas Pasteur-pipette (figur 2E) og opretholdes som ikke-klæbende suspensionskulturer i RDM i yderligere 1-2 uger indtil dag 45. De prolifererende retinale forfædre organiserer sig yderligere for at danne flerlags 3D retinale organoider på ca. 2-3 mm i diameter (figur 2F, G). Fra dag 46 suppleres RDM med 100 μM taurin for at fremme neurogenese og forbedre celleoverlevelsen i langsigtede organoidkulturer in vitro (figur 2H).
Retinale organoider karakteriseres på forskellige stadier af modning til ekspression af flere retinale stammarkører ved anvendelse af revers transkription PCR (RT-PCR) og immunhistokemi (IHC). Til dette høstes organoiderne til total RNA-isolering på den 30. og 60. differentieringsdag. RT-PCR-resultater bekræftede induktion og ekspression af neuro-retinale markører såsom NEUROD1, ChX10, CRX, PKCß1, RLBP1, RHOK, OPN1SW, RCVRN, ABCA4, RD3 og PDE6C i 1 uge gamle retinale organoider (4-5 uger efter differentiering, OC-1M) og 4 uger gamle retinale organoider 8,12 (7-8 uger efter differentiering, OC-2M) (figur 3A). Immunhistokemi og fluorescensbilleddannelse har bekræftet ekspressionen af tidlige retinale stammarkører PAX6, CHX10 og OTX2 i OC-1M og modne retinale markører RCVRN og CRX i OC-2M 8,12 (figur 3Bi,ii).
Ud over de centrale neuro-retinale kopper dukker de andre okulære celletyper, såsom retinal pigmenteret epitel (RPE), neurale kamepitel og okulære overfladeepitelceller, ud og migrerer ud af EFP'erne. De neuroektodermafledte RPE-forfædre fremstår som kompakt arrangerede epitelceller, der omgiver EFP'erne, som gradvist modnes og pigmenteres langs migrationsmargenerne fra dag 30-45 (figur 4A-C). Disse vedhængende differentieringskulturer, efter fjernelse af retinale kopper, kan derfor forlænges indtil dag 45 for at høste prolifererende RPE-prækursorer (figur 4D), som kan beriges yderligere for at forberede enkeltlagskulturer af fuldt modne pigmenterede RPE-celler. Moden pigmenteret RPE kan ses som monolag med typisk brostensmorfologi (figur 4E). RPE-celleidentiteten bekræftes yderligere ved immuncytokemi ved anvendelse af antistoffer mod RPE-specifikke markører såsom MITF (RPE-stamfadermarkør), PAX6 (stamfader og moden RPE-markør) og RPE65 (moden RPE-markør)10,12 (figur 4F-H).
Pluripotente stamcelleafledte retinale organoider kan således tjene som in vitro-modeller til undersøgelse af forskellige arvelige nethindesygdomme 7,8,9. Sygdomsspecifikke stamcellemodeller udvikles enten ved at generere patientspecifikke iPSC-linjer eller ved at indføre sygdomsspecifikke mutationer i raske kontrol-iPSC-linjer ved hjælp af den CRISPR-baserede genredigeringsmetode 7,8. De mutante iPSC'er kan eller måske ikke differentiere effektivt i retinale celletyper afhængigt af de involverede genmutationer. Mens de fleste sunde kontrolcellelinjer fulgte tidslinjen beskrevet ovenfor, kan der være afvigelser i tilfælde af sygdomsspecifikke iPSC'er med hensyn til differentieringstidslinjer, EFP-morfologi, retinal kopstørrelse, laminering og modning. Det retinale differentieringspotentiale for en RB1-/- hiPSC-linje (LVIP15-RB1-CS3), der bærer en biallelisk deletion på 10 bp inden for exon 18 af det humane RB1-gen, blev undersøgt, hvilket resulterer i en frameshift og fuldstændigt tab af RB1-proteinekspression. Det blev observeret, at tabet af RB1-ekspression ikke påvirkede øjet og tidlig retinal afstamningsdifferentiering af den mutante hiPSC-linje. Der blev imidlertid observeret en markant forsinkelse i tidslinjerne og en reduktion i EFP-dannelseseffektiviteten. De atypiske EFP'er, der opstod, havde unormale aggregater af retinale forfædre, der ikke kunne laminere og selvorganisere sig i korrekte retinale kopper (figur 5A, B) eller manglede den omgivende zone af RPE og okulært overfladeepitel (OSE) (figur 5C). Når de blev plukket og vedligeholdt som suspensionskulturer, dannede disse retinale stamfaderklynger uregelmæssige neuro-retinale aggregater (figur 5D).
Figur 1: Tidslinje, der repræsenterer differentieringen af iPSC'er i retinale organoider. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Selvorganiseret 3D retinal organoid generation. (A) Dyrkning af hiPSC-kulturer under feederfrie forhold. (B) Udvikling af neuronale rosetter på dag 14 af differentiering (stjerne). (C,D) Øjenfelt primordial (EFP) klynger indeholdende en central neuro-retinal koplignende struktur (sorte pile) omgivet af epithelets migrerende zone (hvide pile) på dag 21-28 af differentiering. E) Pasteurpipette af flammetrukket glas med kroget spids. Den glatte kurve i hængselområdet bruges til at skubbe og løfte retinale kopper (pil). (F,G) Retinale kopper høstet på dag 25 og dyrket under suspension for at generere selvorganiserede 3D retinale organoider. H) Modne retinale organoider i suspensionskultur på dag 45. Skalastænger: 100 μm (A, B, D, G); 200 μm (C,F,H). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Karakterisering af retinale organoider. (A) Retinal genekspressionsprofilering ved RT-PCR af den udifferentierede normale hiPSC-linje 23 (hiPSC-F2-3F1) (F2-UD) og de differentierede normale optiske kopper plukket ved 3-4 ugers differentiering og modnet yderligere i suspensionskultur i henholdsvis 1 uge (OC-1M) og 4 uger (OC-2M). cDNA'erne i alle testprøver blev normaliseret ved hjælp af eEF1a som belastningskontrol. (B) Konfokale billeder af immunmærkede sektioner af (i) umodne retinale organoider (OC-1M) ved hjælp af antistoffer mod neuro-retinale stammarkører CHX10, PAX6 og OTX2 (i rødt) og (ii) modne retinale organoider (OC-2M) ved hjælp af antistoffer mod fotoreceptorforløbermarkørerne Recoverin og CRX (i rødt). Det markerede yderste lag af retinale organoider med differentierende fotoreceptorceller (boks) i venstre paneler zoomes og vises i højre paneler. DAPI blev brugt som en modfarve (i blåt). De rudimentære indre segmentlignende udvidelser er markeret med hvide pile. Vægtstang: 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Fremkomst af forskellige okulære celletyper. (A) EFP-klynger med neuro-retinal kop i midten og migrerende RPE-udvækst, der viser pigmentering langs forkanterne (hvid pil). (B) Veldifferentierede pigmenterede epiteludvækster fra flere EFP'er rundt om den neuro-retinale ø. (C) Højere forstørrelse af en EFP viser migrationszonen af RPE-forfædre (hvid pil) og okulært overfladeepitel (stjerne), der omgiver en neuro-retinal kop. (D) Udvidede vedhængende kulturer, der udviklede monolag af umodne RPE-celler indeholdende både pigmenterede og ikke-pigmenterede celler. E) Enkeltlagskulturer af fuldt modne og pigmenterede RPE-celler, der udviser brostensmorfologi på dag 60. (F-H) RPE-celler, der udtrykker PAX6, MITF og RPE65 i grønt. Skalastang: 200 μm (A, B); 100 μm (C-E); 20 μm (F-H). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Unormal retinal kopdannelse i RB1-/- mutante iPSC'er. (A,B) EFP'er med unormale aggregater af retinale forfædre med forvrænget laminering og manglende striber. (C) EFP med miniature neuro-retinal kop, men mangler den omgivende zone af RPE og okulært overfladeepitel (pil). (D) Uregelmæssige neuroretinale aggregater dannet i suspensionskultur. Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Primer navn | Primtal sekvens (5'-3') | Båndstørrelse (bp) | Ref Id | |||
| 1 | heEF1α | F: GAAGTCTGGTGATGCTGCCATTGT | 198 | NM_001402 | ||
| R: TTCTGAGCTTTCTGGGCAGACTTG | ||||||
| 2 | hNeuroD1 | F: CGCGCTTAGCATCACTAACT | 349 | NM_002500 | ||
| R: GCGTCTTGGGCTTTTTTGAT | ||||||
| 3 | hCHX10 | F: CAAGTCAGCCAAGGATGGCA | 382 | NM_182894 | ||
| R: CTTGACCTAAGCCATGTCCT | ||||||
| 4 | hCRX | F: TCAACGCCTTGGCCCTAAGT | 357 | NM_000554 | ||
| R: ACACATCTGTGGAGGGTCTT | ||||||
| 5 | hPKC-β1 | F: AAAGGCAGCTTTGGCAAGGT | 376 | NM_212535 | ||
| R: CGAGCATCACGTTGTCAAGT | ||||||
| 6 | RLBP1 | F: TGCACCATTGAAGCTGGCTA | 361 | NM_000326 | ||
| R: AGAAGGGCTTGACCACATTG | ||||||
| 7 | RHOK | F: CAAGCTGTATGCCTGCAAGA | 360 | NM_002929 | ||
| R: ATCCGGACATTGCCGTCATT | ||||||
| 8 | hOPN1SW | F: TGCTTCATTGTGCCTCTCTC | 373 | NM_001708 | ||
| R: AGCTGCATGTGTCGGATTCA | ||||||
| 9 | RCVRN | F: AGACCAACCAGAAGCTGGAGT | 367 | NM_002903 | ||
| R: ACGGGTGTCATGTGAGTGGTA | ||||||
| 10 | hABCA4 | F: CACCGTAGCAGGCAAGAGTATT | 271 | NG_009073 | ||
| R: AATGAGTGCGATGGCTGTGGAGA | ||||||
| 11 | hRD3 | F: ATGGTGCTGGAGACGCTTAT | 328 | NM_183059 | ||
| R: CTTCCTGCTTCATCCTCTCCA | ||||||
| 12 | hPDE6C | F: GTTGATGCCTGTGAACAAATGC | 351 | NM_006204 | ||
| R: ACCACTCAGCATAGGTGTGAT | ||||||
Tabel 1: Liste over genspecifikke primere til RT-PCR.
| Komponenter til RNA-Primer mix | Volumen (i μL) |
| RNA (1-2 μg) | n |
| 10 mM dNTP | 1 |
| 10 mM Oligo dT | 1 |
| DEPC-behandlet vand | op til 10 |
| Samlet reaktionsvolumen | 10 |
Tabel 2: RNA-primer master mix til cDNA konvertering.
| Komponenter til Mastermix 2 | Volumen (i μL) |
| 10x RT-buffer | 2 |
| 25 mM MgCl2 | 4 |
| 0,1 m DTT | 2 |
| SuperScript III omvendt transkriptase | 1 |
| RNaseOUT | 1 |
| Samlet reaktionsvolumen | 10 |
Tabel 3: Mastermix 2 til cDNA-konvertering.
| Komponenter af PCR | Volumen (i μL)/reaktion |
| 10x PCR-buffer | 2 |
| 2 mM dNTP | 2 |
| Fremadgående primer (5 μM) | 1 |
| Omvendt primer (5 μM) | 1 |
| Taq Polymerase | 0.2 |
| cDNA-skabelon (50-100 ng) | 1 |
| Sterilt Milli-Q vand | 12.8 |
| Samlet reaktionsvolumen | 20 |
Tabel 4: Mastermix for semikvantitativ PCR.
| Temperatur | Tidspunkt | Antal cyklusser | |
| Denaturering | 95 °C | 5 minutter | x 1 |
| Denaturering | 95 °C | 30 s | x 35 |
| Udglødning | 50-60 °C | 30 s | |
| Forlængelse | 72 °C | 30 s | |
| Endelig forlængelse | 72 °C | 10 minutter | x 1 |
Tabel 5: PCR-amplifikationsbetingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hiPSC'er er et kraftfuldt værktøj til at studere organ- og vævsudvikling in vitro. Rekapitulering af sygdomsfænotypen ved at differentiere sunde versus sygdomsspecifikke hiPSC'er mod retinal afstamning kan hjælpe med at få nyere indsigt i patofysiologien af forskellige former for arvelige retinale dystrofier. Flere protokoller er blevet beskrevet og vedtaget til in vitro-differentiering af PSC'er i retinale celletyper. De fleste af dem involverer brugen af kulturmedium, der indeholder komplekse cocktails af rekombinante vækstfaktorer, kosttilskud, små molekyler og reagenser, såsom: N1, N2 og B27 kosttilskud; BMP og TGFβ signalblokkere som Noggin, SB431542, LDN193189 og Follistatin eller induktorer såsom Activin A, Lefty og IDE1; kanoniske Wnt-signalblokkere såsom DKK1, SFRP, IWP-2 og IWR-1-endo, eller induktorer såsom CHIR99021, SB216763 og CKI-7; FGF-receptorsignalblokkere såsom PD0325901 og PD173074 eller induktorer som bFGF; hak signalhæmmere såsom DAPT; andre signalmolekyler såsom insulinlignende vækstfaktor (IGF-1); retinsyre; væksthormoner såsom triiodothyronin (T3) og hydrocortison; og antioxidanter og andre pro-overlevelsesfaktorer såsom ascorbinsyre, nikotinamid, taurin, docosahexaensyre, 1-thioglykerol osv. Disse komponenter er inkluderet i kulturmediet på forskellige stadier af stamcelledifferentiering for at stimulere eller modulere forskellige signalkaskader for at inducere øjen- og retinal afstamningsforpligtelse 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22.
Her beskrives en enklere, robust og effektiv metode til generering af retinale organoider direkte fra næsten sammenflydende, klæbende kulturer af hiPSC'er. Den forenklede protokol indebærer anvendelse af færre kosttilskud, vækstfaktorer og små molekyler, der primært udløser den indledende differentiering af PSC'er i den neuroektodermale afstamning. Efterfølgende differentieringstrin er afhængige af PSC'ernes iboende evne til synkront at differentiere sig til celletypen af beslægtede slægter, som derefter selvorganiserer og gensidigt regulerer udviklingen og den rumlige organisering af flere celletyper, der bidrager til dannelsen af komplekse væv. Den gradvise tilbagetrækning af bFGF og tilføjelsen af Noggin hjælper med en vellykket induktion af tidlig neuro-ektodermal skæbneforpligtelse inden for 3 dage efter differentiering. Fortsat vedligeholdelse af differentieringskulturer i neuralt inducerende RDM uden tilsætning af vækstfaktorer eller små molekyler resulterer i induktion af øjenfeltprimordiale (EFP) strukturer med klare margener inden for 3-4 uger efter differentiering. EFP'erne indeholder multipotente stamceller, som ved uforstyrret og fortsat vedligeholdelse resulterer i multi-lineage differentiering og selvsamling til dannelse af komplekse EFP'er bestående af centralt placerede neuro-retinale kopper eller optiske kopper (OC'er), omgivet af andre relaterede okulære celletyper såsom retinal pigmenteret epitel (RPE), neuralt kamepitel og okulært overfladeepitel. Alternativt kan PSC'erne dyrkes som suspensionskulturer fra dag 1-3 for at danne EB'er under identiske dyrkningsbetingelser. EB'erne kan yderligere belægges på dag 4 og dyrkes som vedhængende kulturer på matrixbelagte overflader i RDM for at initiere retinal afstamningsdifferentiering, som beskrevet ovenfor. Sunde differentierende kulturer giver rutinemæssigt anledning til ca. 20-30 EFP'er pr. brønd på en 6-brønds plade. OC'erne kan høstes fra EFP'erne efter 3-4 ugers retinal differentiering og opretholdes i suspensionskulturer i yderligere 30-60 dage for at muliggøre differentiering af neuro-retinale forfædre og generere modne retinale organoider. Efter 4 ugers suspensionskultur forbliver ca. 70% -80% af de optiske kopper plukket fra EFP'er intakte, bevarer deres laminering og udvikler sig til modne retinale organoider (OC-2M) med RCVRN + og CRX + engagerede fotoreceptorceller og indre segmentlignende forlængelser inden for de yderste lag.
Sammenløbet af voksende iPSC-kulturer er kritisk på tidspunktet for initiering af differentiering og skift af kulturer til DIM. Kulturer med mindre kolonier og sammenløb under 60%, og dem, der er tidligt differentierende, resulterer i betydeligt reducerede EFP-tal. Når øjenfeltklyngerne dukker op, skal den centrale ø neuro-retinale kopper høstes inden for 1 uge. Dette kan gøres ved forsigtigt at skubbe og løfte de intakte kopper ved hjælp af vinklen eller det buede område af den flammetrukne glaskapillærspids, som beskrevet i protokolafsnittet. Pas på ikke at beskadige kopperne. Yderligere forsinkelser i plukning ville resultere i udfladning og tab af 3D-organisation på grund af spredning og migration af neuro-retinale stamceller, hvilket gør høstning vanskelig og resulterer i atypiske retinale organoider.
Effektiviteten af øjenfeltinduktion og modning af retinale kopper varierer mellem forskellige sygdoms- eller patientspecifikke hiPSC-linjer afhængigt af de underliggende genetiske defekter. For eksempel var retinal afstamningsforpligtelse og EFP-dannende effektivitet af en RP-sygdomsspecifik linje identisk med den for de sunde kontrolceller, mens en RB1-nullinje ikke dannede EFP'er (data ikke vist). Nogle linjer, der bærer mutationer knyttet til Leber medfødt amaurose, dannede atypiske EFP'er med defekter i deres størrelse, selvmontering, laminering og modning af retinale forfædre (data ikke vist). Yderligere molekylære valideringer og genekspressionsprofilering af patientspecifikke retinale organoider sammenlignet med sunde kontrolvæv ville være nødvendige for at forstå patofysiologien af en sygdomstilstand. I betragtning af variabiliteten i patientgenomer og involveringen af multigennetværk i sygdomsmanifestationer kan det også være vigtigt at studere retinale organoider afledt af isogene iPSC-linjer for at etablere en absolut genotype-fænotypekorrelation i sygdomsmodelleringsundersøgelser. Sådanne isogene linjer kan skabes enten ved målrettede genudskæringer i raske kontrollinjer eller ved at korrigere de patogene mutationer i patientspecifikke iPSC'er ved hjælp af avancerede genomredigeringsteknikker 8,9.
Sådanne intakte retinale organoider afledt af normale eller sygdomsspecifikke iPSC-linjer kan anvendes i ny lægemiddelscreening og testning. Fotoreceptorprækursorer inden for retinale organoider og andre okulære celletyper, såsom RPE og hornhindepitel inden for EFP-udvækst, kan yderligere isoleres og beriges til deres anvendelser inden for grundforskning og regenerativ medicin. Den her beskrevne protokol kan let anvendes til GMP-kompatible processer til forberedelse af celler af klinisk kvalitet, der er beregnet til prækliniske og kliniske forsøgsevalueringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har ingen interessekonflikt eller finansielle oplysninger.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender den videnskabelige og tekniske støtte fra Dr. Chitra Kannabiran, genetiker; Dr. Subhadra Jalali, retinal konsulent; Dr. Milind Naik, oculoplastikkirurg; og Dr. Swathi Kaliki, okulær onkolog ved LV Prasad Eye Institute, Hyderabad mod generering af normale og patientspecifikke iPSC-linjer. Forfatterne anerkender F & U-tilskud fra Science and Engineering Research Board, Institut for Videnskab og Teknologi (IM), (SB / SO / HS / 177/2013), Institut for Bioteknologi (IM) (BT / PR32404 / MED / 30/2136/2019) og seniorforskningsstipendier fra ICMR (S.M., D.P.), UGC (TA) og CSIR (V.K.P.), Indiens regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
| 15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
| Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
| Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
| Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
| Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
| GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
| HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
| Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
| Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
| Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
| Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
| Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
| Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |
References
- Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P.
- Sen, P., et al. Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years. Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).
- Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. Trend of retinal diseases in developing countries. Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).
- RetNet - Retinal Information Network. , Available from: https://sph.uth.edu/retnet/ (2022).
- Cicero, S. A., et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).
- Guo, Y., et al. Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361 (2019).
- Lane, A., et al. Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids. Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).
- Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).
- Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
- Meyer, J. S., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).
- Zhu, J., Lamba, D. A. Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (12), 2882 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Chichagova, V., et al. Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95 (2019).
- Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal. STAR Protocols. 1 (1), 100033 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Mellough, C. B., et al. IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
