Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להבחנה של hiPSCs לצברי שדות עיניים ויצירת אורגנואידים נוירו-רשתית באמצעות תנאי תרבית פשוטים המערבים הן מערכות תרבית הדבקה והן מערכת תרבית תלייה. סוגים אחרים של תאי עין, כגון RPE ואפיתל הקרנית, יכולים גם הם להיות מבודדים משדות עיניים בוגרים בתרביות רשתית.
Abstract
תאי גזע פלוריפוטנטיים יכולים לייצר אורגנואידים מורכבים של רקמות השימושיים למחקרי מודלים של מחלות חוץ גופיות ולפיתוח טיפולים רגנרטיביים. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה, חזקה ומדורגת יותר ליצירת אורגנואידים ברשתית במערכת תרבית היברידית המורכבת מתרביות חד-שכבתיות דבקות במהלך 4 השבועות הראשונים של התמיינות הרשתית עד להופעתם של אשכולות קדמוניים מובהקים של שדה העין (EFPs) המאורגנים באופן עצמאי. יתר על כן, האיים הנוירו-רשתיים בצורת סופגנייה, עגולים ושקופים בתוך כל EFP נקטפים ידנית ומתורבתים תחת תרחיף באמצעות צלחות תרבית לא דבקות במדיום התמיינות רשתית למשך 1-2 שבועות כדי ליצור כוסות אופטיות תלת-ממדיות רב-שכבתיות (OC-1M). אורגנואידים לא בשלים אלה ברשתית מכילים PAX6+ ו-ChX10+ מתרבים ומבשרי רשתית רב-עוצמה. התאים המקדימים מורכבים באופן ליניארי בתוך האורגנואידים ומופיעים כפסיעות רדיאליות נפרדות. לאחר 4 שבועות לאחר תרבית התרחיף, אבות הרשתית עוברים דום פוסט-מיטוטי והתמיינות שושלת ליצירת אורגנואידים רשתית בוגרים (OC-2M). שושלת קולטני האור מתפתחת בתוך השכבות החיצוניות ביותר של אורגנואידים ברשתית. תאים קולטי אור CRX+ ו-RCVRN+ אלה בשלים מורפולוגית כדי להציג הרחבות פנימיות דמויות סגמנט. ניתן לאמץ שיטה זו ליצירת אורגנואידים ברשתית באמצעות תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). כל השלבים והנהלים מוסברים ומודגמים בבירור כדי להבטיח שכפול וליישומים רחבים יותר במדע בסיסי ובמחקר תרגומי.
Introduction
הרשתית היא רקמה רגישה לאור הנמצאת בחלק האחורי של עין החוליות הממירה אותות אור לדחפים עצביים על ידי תופעה ביוכימית הידועה בשם מסלול פוטו-טרנסדוקציה. הדחפים העצביים הראשוניים הנוצרים בתאי הפוטורצפטור של הרשתית מתומרמים לתאי עצב אחרים ברשתית ולתאי גנגליון ברשתית (RGCs) ומגיעים לקליפת המוח הראייתית, המסייעת בתפיסת תמונה ובתגובה חזותית.
על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), כ -1.5 מיליון ילדים עיוורים, מתוכם מיליון באסיה. ניוון רשתית תורשתי (IRD) היא מחלה מסנוורת חמורה הפוגעת ב-1 מכל 4,000 אנשים ברחבי העולם בגילאי 1,2,3, בעוד ששכיחות העיוורון הקשור לניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) נעה בין 0.6%-1.1% במדינות מתפתחות4. IRDs נגרמים על ידי פגמים גנטיים תורשתיים ביותר מ -300 גנים שונים המעורבים בהתפתחות הרשתית ותפקוד5. שינויים גנטיים כאלה גורמים לשיבוש תפקודי הרשתית התקינים ולניוון הדרגתי של תאי הרשתית, כלומר תאי קולטני האור והאפיתל הפיגמנטי ברשתית (RPE), ובכך מובילים לאובדן ראייה חמור ולעיוורון. התקדמות עצומה הושגה במצבים מסנוורים אחרים המערבים את הקרנית, העדשה וכו'. עם זאת, ניוון רשתית וניוון עצב הראייה אין כל טיפול מוכח עד כה. מכיוון שלרשתית אנושית בוגרת אין תאי גזע6, מקורות חלופיים כגון תאי גזע עובריים (ESC) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם במטופל (iPSCs) יכולים לספק אספקה בלתי מוגבלת של סוגי תאים רצויים וטומנים בחובם הבטחה גדולה לפיתוח אורגנואידים מורכבים של רקמות הדרושות למחקרי מידול מחלות חוץ גופיות ולפיתוח טיפולים רגנרטיביים7, 8,9,10.
מספר שנים של מחקר רשתית הובילו להבנה טובה יותר של אירועים מולקולריים המתזמרים התפתחות רשתית מוקדמת. רוב הפרוטוקולים ליצירת תאי רשתית ואורגנואידים תלת-ממדיים מ-PSCs שואפים לשחזר אירועים התפתחותיים אלה במבחנה, על ידי תרבית התאים בקוקטייל מורכב של גורמי גדילה ומולקולות קטנות כדי לווסת את התהליכים הביולוגיים הידועים באופן מדורג. אורגנואידי הרשתית הנוצרים כך מורכבים מתאי רשתית עיקריים: תאי גנגליון רשתית (RGCs), אינטרנוירונים, פוטורצפטורים ואפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. למרות ניסיונות מוצלחים למדל IRDs באמצעות אורגנואידים ברשתית, הדרישה לקוקטייל המורכב של גורמי גדילה ומולקולות קטנות במהלך התמיינות והיעילות הנמוכה יחסית של יצירת אורגנואידים ברשתית מציבה אתגר גדול ברוב הפרוטוקולים. הם כוללים בעיקר היווצרות של גופים עובריים, ולאחר מכן התמיינות מדורגת שלהם לשושלות רשתית באמצעות תנאי תרבית מורכבים בשלבים שונים של התפתחות חוץ גופית 20,21,22.
כאן מדווחת שיטה פשוטה וחזקה לפיתוח אורגנואידים נוירו-רשתית תלת-ממדיים מורכבים מבקרה בריאה ו-hiPSCs ספציפיים למחלות רשתית. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בהבחנה ישירה של תרביות hiPSC כמעט משתלבות ללא צורך בהיווצרות גוף עוברי. כמו כן, המורכבות של מדיום התרבות היא פשוטה יותר, מה שהופך אותו טכניקה חסכונית לשחזור שניתן לאמץ בקלות על ידי חוקרים חדשים. היא כוללת מערכת תרבית היברידית המורכבת מתרביות חד-שכבתיות דבקות במהלך 4 השבועות הראשונים של התמיינות הרשתית עד להופעתם של אשכולות קדמוניים מובהקים של שדה עיניים (EFPs) המאורגנים בעצמם. יתר על כן, האיים הנוירו-רשתית המעגליים בתוך כל EFP נקטפים ידנית ומגודלים בתרביות תרחיף במשך 1-2 שבועות כדי להכין גביעי רשתית תלת-ממדיים רב-שכבתיים או אורגנואידים המורכבים ממבשרי נוירו-רשתית מתרבים PAX6+ ו-CHX10+ . תרבית ממושכת של אורגנואידים ברשתית בתווך המכיל טאורין של 100 מיקרומטר למשך 4 שבועות נוספים הביאה להופעתם של מבשרי קולטני אור RCVRN + ו-CRX+ ותאים בוגרים עם שלוחות בסיסיות דמויות מקטע פנימי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים ב-hiPSCs בוצעו באופן אספטי, תוך עמידה בנוהלי המעבדה הסטנדרטיים, הנחיות אתיות ובטיחות ביולוגית, ובאישורי גופים רגולטוריים כגון ועדת האתיקה המוסדית (IEC), הוועדה המוסדית לחקר תאי גזע (IC-SCR) והוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית (IBSC).
1. הכנת תרבית iPSC ומדיום התמיינות רשתית וריאגנטים
- תרבות iPSC ואמצעי תחזוקה
- תרבית ושמור על קו hiPSCרגיל 23 (hiPSC-F2-3F1) ועל קו CRISPR ערוך, RB1-/ - hiPSC (LVIP15-RB1-CS3, עם מחיקה ביאלית, frameshift של 10 bp בתוך אקסון 18 של הגן RB1 האנושי) בתווך חיוני 8 על ציפוי מטריג'ל (מטריצת קרום מרתף מצופה; ראה טבלת חומרים) צלחות תרבית בתנאי תרבית ללא הזנה.
הערה: פרוטוקול זה יכול להיעשות נטול קסנו לחלוטין על ידי החלפת מטריצת קרום המרתף בציפוי ויטרונקטין רקומביננטי (VTN-N). הכינו את Essential 8 medium המלא על ידי הוספת תוסף 50x Essential 8 (מסופק עם ערכת Essential 8 medium; ראו טבלת חומרים) ו-100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין תמיסות. לחלופין, ניתן גם לתרבית את hiPSCs באמצעות מדיום mTeSR1 המלא.
- תרבית ושמור על קו hiPSCרגיל 23 (hiPSC-F2-3F1) ועל קו CRISPR ערוך, RB1-/ - hiPSC (LVIP15-RB1-CS3, עם מחיקה ביאלית, frameshift של 10 bp בתוך אקסון 18 של הגן RB1 האנושי) בתווך חיוני 8 על ציפוי מטריג'ל (מטריצת קרום מרתף מצופה; ראה טבלת חומרים) צלחות תרבית בתנאי תרבית ללא הזנה.
- פתרון לדיסוציאציה של תאים (CDS אחד)
- לדיסוציאציה נטולת אנזימים ולהעברה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים, הכינו את ה-CDS המכיל 0.5 mM EDTA, pH 8.0 ו-30 mM NaCl במי מלח חוצצי פוספט (DPBS) של 1x Dulbecco (ראו טבלת חומרים).
- כדי להכין 100 מ"ל של 1x CDS, הוסף 100 μL של 0.5M EDTA ו- 1 מ"ל של 3 M NaCl פתרונות מלאי ל- 99 מ"ל של DPBS 1x, ערבב היטב וסנן סטריליזציה באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
- אמצעי אינדוקציה בידול (DIM)
- הכינו DIM באמצעות מדיום בסיסי DMEM-F12 בתוספת 10% תחליף סרום נוקאאוט (KOSR), 1x חומצת אמינו לא חיונית (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U / מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין, 200 מיקרומטר L-חומצה אסקורבית, ותוסף N2 1% (ראה רשימת חומרים).
- מדיום התמיינות רשתית (RDM)
- הכינו RDM באמצעות מדיום בסיסי DMEM-F12 בתוספת 10% סרום נוקאאוט (KOSR), 1x חומצת אמינו לא חיונית (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U / מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין, 200 מיקרומטר חומצה L-אסקורבית, ותוסף B27 2% (עם ויטמין A) (ראה רשימת חומרים).
- משטחי תרבית תאים חוץ-תאיים מצופים מטריצה
- הפשירו את מטריצת קרום המרתף בעלת אישור hESC למשך הלילה בדלי קרח, רצוי בתוך מקרר בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס. לדלל את מלאי המטריצה 100x המופשר (5 מ"ל) ביחס של 1:5 על ידי הוספת 20 מ"ל של מדיום בסיסי DMEM-F12 קר כקרח ולערבב על ידי ערבול עדין להכנת תמיסת מלאי 20x.
- מכינים 0.5 מ"ל aliquots על קרח באמצעות קצוות פיפטה מצוננים מראש צינורות microcentrifuge סטריליים. תייגו את הבקבוקונים כמלאי פי 20 ואחסנו אותם קפואים במקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך עד 6 חודשים.
- לציפוי משטחי תרבית התאים (צלחות תרבית או צלחות 6 בארות), הפשירו אליקוט של מטריצה 20x על קרח ודללו ביחס של 1:20 באמצעות מדיום בסיסי DMEM-F12 קר כקרח להכנת 10 מ"ל של תמיסת ציפוי מטריצה 1x, המספיקה לציפוי צלחת 100 מ"מ או צלחת 6 בארות (1.5 מ"ל / באר).
הערה: מצננים את הפיפטות/מיקרוטיפים על ידי שאיפת DPBS קר כקרח וסטרילי לפני הטיפול בתמיסת המטריצה. ההפשרה וכל הטיפול במטריצה חייב להיעשות על קרח, תוך שימוש בפיפטות/מיקרוטיפים מקוררים מראש כדי למנוע פילמור וג'לינג בטמפרטורת החדר. - הוסף 1.5 מ"ל של תמיסת ציפוי מטריצה 1x לכל באר של צלחת 6 בארות, סובב בעדינות את הצלחת כדי להבטיח ציפוי אחיד, ודגר על הלוחות ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 . השאירו את הלוחות ללא הפרעה למשך שעה לפחות כדי להבטיח ציפוי אחיד של המטריצה על משטחי התרבית.
- לפני זריעת התאים יש לשאוף את תמיסת הציפוי באמצעות פיפטה סטרילית בנפח 5 מ"ל ולהשליך את הפסולת הנוזלית. מוסיפים מיד תרבית טרייה (2 מ"ל/באר של צלחת בעלת 6 בארות) וזורעים את התאים בצפיפות של 150,000-200,000 תאים/באר. אין לתת לצלחות להתייבש במהלך הטיפול.
הערה: לחילופין, ציפוי ויטרונקטין רקומביננטי (VTN-N) בריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל יכול לשמש לפרוטוקול תרבית נטול קסנו.
- הפשירו את מטריצת קרום המרתף בעלת אישור hESC למשך הלילה בדלי קרח, רצוי בתוך מקרר בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס. לדלל את מלאי המטריצה 100x המופשר (5 מ"ל) ביחס של 1:5 על ידי הוספת 20 מ"ל של מדיום בסיסי DMEM-F12 קר כקרח ולערבב על ידי ערבול עדין להכנת תמיסת מלאי 20x.
2. ביסוס תרבויות iPSC אנושיות
- הפשרה והחייאת hiPSCs
- מצפים באר אחת של צלחת 6 בארות עם תמיסת מטריצת ממברנה 1x. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה כדי לאפשר פילמור וציפוי אחיד של משטח התרבית.
- לאחר שעה אחת של דגירה, הסר את תמיסת הציפוי והוסף 1 מ"ל של מדיום Essential 8 שלם שחומם מראש המכיל 10 מיקרומטר של מעכב רו-קינאז, Y-27632 (1 μL/mL של 10 mM מלאי; ראה טבלת חומרים), לפני החייאת התאים.
- הסר מלאי קריוביאלי hiPSC (1 x 106 תאים/בקבוקון) ממיכל החנקן הנוזלי. הפשיר במהירות את הקריוביאל באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם ערבול עדין.
הערה: אין להפשיר את הבקבוקון לחלוטין; רשמו את מספר המעבר, עקרו את הבקבוקון ונגבו אותו לייבוש באמצעות מטוש ללא סיבים המכיל 70% אלכוהול איזופרופיל. - בעזרת קצה פיפטה סטרילי של 1 מ"ל, שואפים את התוכן הקריוביאלי לתוך צינור טרי של 15 מ"ל המורכב מ-2 מ"ל של מדיום Essential 8 שלם שחומם מראש ללא Y-27632. צנטריפוגה את הצינור ב 1,000 x גרם במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט.
- השהה מחדש את גלולת התא ב 1.0 מ"ל של מדיום חיוני 8 מלא המכיל 10 מיקרומטר Y-27632.
- הוסף את מתלה התא הזה על המשטחים המצופים במטריצה מבלי להפריע למטריצה על ידי פיזורו לאורך הקירות. נענעו את הצלחת בעדינות לרוחב כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים.
- לדגור על הצלחות ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 כדי לאפשר לתאים להיצמד ולהתחיל להתרבות.
- לאחר 12-24 שעות, יש להחליף את המדיום המשומש ולשמור על התרביות בתווך Essential 8 שחומם מראש ללא Y-27632.
- שנה את מדיום התרבות כל 24 שעות ועבור את התרבויות ברגע שהן מגיעות למפגש של 70%-80%.
הערה: יחס פיצול של 1:6 מתבצע באופן שגרתי עבור תרביות hiPSC ומועבר במרווחי זמן קבועים של 3-4 ימים.
- מעבר וציפוי של hiPSCs כדי להתחיל התמיינות שושלת רשתית
- שאפו את המדיום המושקע מ-70%-80% תרביות iPSC אנושיות בלוחות בעלי 6 בארות.
- הוסף 1 מ"ל CDS (שלב 1.2) לכל באר ודגר ב 37 ° C במשך 5-7 דקות עד התאים לעגל כלפי מעלה. בזהירות להסיר את CDS, בזהירות לא לנתק את התאים, ולהוסיף 2 מ"ל של טרי חיוני 8 בינוני בעדינות triturate באמצעות פיפטה.
- אספו את תרחיף התא מבאר אחת של צלחת 6 תאים לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל וסובבו את הצינור במהירות של 1,000 x גרם למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט.
- יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-1.2 מ"ל של מדיום חיוני 8 ולהוציא 200 μL של התא 200μL של תרחיף התא (יחס פיצול של 1:6) לכל באר של צלחת 6 בארות מצופת מטריצה המכילה 1.5 מ"ל של מדיום תרבית iPSC המכיל 10 מיקרומטר Y-27632, כמתואר בשלב 1.5.
- לאחר 12-24 שעות, יש להחליף את המדיום המשומש ולשמור על התרביות בתווך Essential 8 שחומם מראש ללא Y-27632.
- שנה את מדיום התרבות כל 24 שעות עד שהתרבויות מגיעות למפגש של 70%-80%.
3. התמיינות של hiPSCs לשדות עיניים ושושלת רשתית
הערה: מתאר סכמטי של תהליך הבידול מוצג באיור 1.
- התחל את הליך הבידול ברגע שתרביות hiPSC מגיעות למפגש של 70%-80%.
- ביום 0, שנה את אמצעי התחזוקה hiPSC ל- DIM (שלב 1.3) המכיל 1 ng/mL bFGF ו- 1 ng/mL Noggin. הוסף 2.0 מ"ל של בינוני לכל באר של צלחת 6 בארות ולשמור על התאים ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 .
הערה: נסיגה הדרגתית של bFGF גורמת להתמיינות של PSCs, ותוספת של ריכוזים הולכים וגדלים של Noggin (מעכב של מספר BMPs) במהלך השלבים הראשונים גורמת להתמיינות שושלת אקטודרמלית ונוירוליזציה11,12 וחוסמת את מחויבות המזודרם והאנדודרם. לחלופין, Noggin יכול להיות מוחלף על ידי LDN193189. שלא כמו אסטרטגיית עיכוב SMAD כפול שדווחה קודם לכן20,21, פרוטוקול זה אינו דורש תוספת של Activin או SB-431542. - ביום הראשון, שנה את המדיום המשומש והוסף DIM המכיל 1 ng/mL bFGF ו- 10 ng/mL Noggin. מוסיפים 2.0 מ"ל לכל באר של צלחת 6 בארות. לדגור ולתחזק את התאים ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 .
- ביום 2-3, הסר את המדיום המשומש והוסף DIM המכיל רק 10 ng/mL Noggin. מוסיפים 2.0 מ"ל לבאר של צלחת 6 בארות ומשנים את המדיום כל 24 שעות. לדגור ולתחזק את התאים ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 .
הערה: יש לחמם תמיד מראש את התרבית עד 30-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. עודף צפים ותאים מתים ניתן לראות בתרביות התמיינות מוקדמת. בתנאים כאלה, שטפו את התרביות פעם אחת עם DPBS 1x והוסיפו את מדיום התמיינות הרשתית. בדיקות סטריליות על המדיום בילה ניתן לעשות מדי שבוע או לפי הצורך. - ביום 4, הסר את המדיום שהוצא והוסף את RDM (שלב 1.4). הוסף 2.0 מ"ל לבאר של צלחת 6 בארות והמשך לשמור על התרביות ב- RDM ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 , עם שינוי בינוני טרי מדי יום.
הערה: לחילופין, ניתן לגדל את PSCs כתרביות תרחיף מהיום 1-3, בלוחות 96 בארות לא דבוקים ובעלי תחתית עגולה, בצפיפות תאים של 5 x 103 תאים/100 μL/well ליצירת גופים עובריים (EBs) בתנאי תרבית זהים ב-DIM. EBs מעוצבים היטב ביום 4 יכולים להיות מצופים על לוחות מצופים מטריצה המכילים RDM ומותר לדבוק, להתרבות, ולהבדיל כמתואר להלן. - בסביבות היום ה-14-18, התבוננו בתרביות תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 10 עבור הופעתם של אזורים דמויי רוזטה עצבית המורכבים מאבות מוקדמים של שדה העין (איור 2B).
- בסביבות היום ה-21-28 (3-4 שבועות), התבוננו בתרביות תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 4 ו-10 כדי לצפות בהופעתם של EFPs נפרדים המאורגנים בעצמם, עם אי מרכזי של מבנים נוירו-רשתית תלת-ממדיים עגולים המוקפים בגידולים רציפים של אפיתל עצבי ואפיתל פני השטח של העין (איור 2C,D).
הערה: ניתן לראות כ-20-30 EFPs לכל באר של צלחת 6 בארות של תרבית התמיינות רשתית HiPSC תקינה. מספר זה יכול להשתנות עם קווי hiPSC ספציפיים אחרים למחלה, בהתבסס על הרקע הגנטי שלהם ופוטנציאל התמיינות שושלת הרשתית.
4. קצירת אורגנואידים ברשתית
- משיכת להבה של פיפטות פסטר זכוכית לקטיף ידני של כוסות רשתית.
הערה: השתמש בפיפטות פסטר מזכוכית אוטומטית וסטרילית לאיסוף שדה העין.- הפעל מבער Bunsen. לוקחים פיפטה סטרילית של פסטר ומחזיקים את הבסיס ביד אחת ואת קצה הנימים ביד השנייה. הלהבה מעקרת ומחממת את האזור הסמוך לאמצע קצה הנימים, בתנועות סיבוביות עד שהזכוכית הופכת גמישה. לאחר מכן התרחקו מהלהבה ומשכו החוצה במהירות כדי ליצור קצה נימי דק עם לומן סגור.
- החזיקו את הקצה הדק אופקית מול הלהבה והעבירו אותו במהירות דרך הלהבה בתנועה החוצה כדי ליצור וו חלק או קצה נימי בצורת L.
- השתמש באזור העקמומיות החיצוני החלק של וו הנימים ככף מדידה עדינה כדי להרים ולנתק בעדינות את כוסות הרשתית העצבית השלמות מאשכולות ה- EFP.
הערה: הזווית החלקה של וו נימי הזכוכית אינה גורמת נזק לתאים ואינה יוצרת שריטות על משטחי התרבית. כלי פשוט זה יכול לשמש ביעילות גם לפיצול מושבות hiPSC בודדות בתבניות רשת ולהעברתן כצבירי תאים קטנים במהלך הרחבת השבטים.
- תרבית ותחזוקה של גביעוני רשתית ליצירת אורגנואידים תלת ממדיים ברשתית.
- ביום 25-30, יש להוסיף 4.0 מ"ל של מדיום התמיינות רשתית שחומם מראש בכלי של 60 מ"מ עם חיבור נמוך לפני ההכנה לקציר כוסות נוירו-רשתית.
- עבוד תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה של 0.63x-4.5x כדי לצפות ולבחור ידנית כוסות נוירו-רשתית בנויות היטב מ- EFPs בודדים.
הערה: הופעתם של תאי RPE פיגמנטיים מסייעת בזיהוי קל של EFPs ושל גביעי נוירו-רשתית הממוקמים במרכז. גביעי הרשתית מופיעים כמבנים תלת-ממדיים בצורת סופגנייה, עגולים ושקופים, עם פסיעות רדיאליות ברורות, שנוצרו על ידי תאי גזע רשתית מסודרים ליניאריים ומורכבים מעצמם, בניגוד לצבירים הצפופים והכדוריים או הבלתי סדירים שנוצרו על ידי תאי העצב של מערכת העצבים המרכזית או תאי הפסגה העצבית23. - השתמשו בווי פיפטה מרעה המושכים להבה כדי לדחוף בעדינות ולגרוף החוצה את האי הנוירו-רשתית המרכזי בתוך EFPs בודדים.
- הניחו מיקרופיפטה של 1 מ"ל כדי לשאוף 100 מיקרו-ליטר והשתמשו במיקרו-טיפים של 1 מ"ל עם פתחים רחבים כדי לשאוף ולהעביר את כוסות הרשתית הצפות למנות התרבית הטריות והנמוכות שהוכנו בשלב 4.2.1.
הערה: שימוש בקצוות עם גודל משעמם קטן יותר ולחץ יניקה גבוה יותר עלול לגרום לגזירה ולהשפיע על שלמות כוסות הרשתית. הממדים המשוערים של גביעי הרשתית הם בקוטר של כ-1-2 מ"מ. - שמרו על גביעי הרשתית ב-RDM כתרביות תרחיף שאינן נצמדות ודגרו עליהן בטמפרטורה של 37°C באינקובטורCO2 של 5%.
- יום 30-45: החליפו את המדיום מדי יום על ידי הטייה עדינה של הכלי ואפשרו לכוסות הרשתית להסתפק בכ-30 שניות. בצע שיטת הזנה חלקית, הסרת חצי נפח של מדיום בילה ולהחליף עם כמויות שוות של מדיום טרי.
הערה: יש להימנע משאיפה חוזרת ומהעברות חוזרות כדי למנוע נזק לכוסות הרשתית. לאחר 1-2 שבועות של תרבית תרחיף, גביעי הרשתית גדלים מעט בגודלם (1-3 מ"מ) ומתפתחים לאורגנואידים תלת-ממדיים מאורגנים מעצמם (OC-1M) המורכבים מאבות נוירו-רשתית מוקדמים המסודרים באופן ליניארי המבטאים PAX6 ו-CHX10 (איור 3Bi). - יום 45-60: תרבית אורגנואידים ברשתית למשך 4 שבועות נוספים ב- RDM המכיל 100 מיקרומטר טאורין (ראה טבלת חומרים) כדי לתמוך בהישרדות טובה יותר ובהתמיינות שושלת של אבות נוירו-רשתית ופיתוח סוג תאי רשתית בוגרים (OC-2M).
הערה: כ-70%-80% מגביעי הרשתית או האופטיים שנקטפו מ-EFPs נשארים שלמים, שומרים על הלמינציה שלהם ומתפתחים לאורגנואידים רשתית בוגרים לאחר 4 שבועות של תרבית השעיה (OC-2M). - בדקו שהאורגנואידים הבשלים ברשתית לאחר 4 שבועות של תרבית השעיה מראים את הופעתם של מבשרי קולטני אור RCVRN+ ו-CRX+ ותאים בוגרים עם הרחבה בסיסית דמוית מקטע פנימי בשכבות התאים החיצוניות ביותר, ובכך לשחזר את תהליך התפתחות הרשתית וההבשלה הרגיל במבחנה (איור 3Bii).
הערה: לאחר הסרת כוסות נוירו-רשתית, תרביות ההתמיינות יכולות להישמר ברציפות ב- RDM. גידולי האפיתל הפרוקסימלי המקיפים את הרשתית העצבית מכילים מבשרי תאי אפיתל פיגמנטיים ברשתית (RPE), אשר מתרחבים ומבשילים עוד יותר ליצירת מונושכבות RPE פיגמנטיות עם מורפולוגיה טיפוסית של אבן מרוצפת (איור 4). הגידולים הדיסטליים מורכבים בעיקר מאפיתל פני העין התורםלעדשה ולאפיתל הקרנית.ניתן לקצור סוגי תאים רצויים מאזורים שונים של גידולי EFP ולהעשיר אותם עוד יותר כדי לבסס תרביות טהורות.
5. אפיון אורגנואידים ברשתית
- אפיון מורפולוגי ומולקולרי
- התבונן ב- EFPs הדבקים ובאורגנואידים רשתית צפים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה בהגדלה של 4x ו- 10x ותעד את המורפולוגיה והממדים שלהם.
- אספו כ-20 אורגנואידים ברשתית בשלבים שונים של הבשלה (שלבים 4.2.3-4.2.6) לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל באמצעות קצוות רחבים של 1,000 מיקרוליטר. תנו לאורגנואידים להתיישב בתחתית ושאפו החוצה את המדיום. שטפו את הכוסות עם 1x PBS.
- הסר את עודפי PBS והוסף 1.0 מ"ל של מגיב TRIzol (ראה טבלת חומרים). יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הומוגניזציה של הרקמה באמצעות צינור מזיק ו triturate באמצעות פיפטה 1.0 מ"ל.
- הכן את סך כל הרנ"א על ידי ביצוע שיטת הריאגנט הסטנדרטית של בידוד וטיהור RNA, בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
- בדוק את איכות הרנ"א על ג'ל האגרוז וכמת אותה באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop (ראה טבלת חומרים).
- המר 1-2 מיקרוגרם של RNA כולל ל- cDNA באמצעות אנזים שעתוק הפוך בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). ראו טבלה 1 לקבלת רשימה של פריימרים ספציפיים לגנים.
- בקצרה, הכינו את תערובת המאסטר RNA-פריימר בנפח כולל של 10 μL כנזכר בטבלה 2 ודגרו על הצינור בטמפרטורה של 65°C למשך 5 דקות במחזור תרמי. מעבירים את הצינור מהמחזור התרמי לקרח למשך 2 דקות.
- בינתיים, הכינו את תערובת האב 2 עם הריאגנטים המוזכרים בטבלה 3. הוסף תערובת מאסטר זו לצינור תערובת RNA-פריימר שהוכן בשלב 5.1.7. מערבבים בעדינות.
- לדגור את הדגימה ב 50 ° C במשך 50 דקות, ולאחר מכן 85 ° C במשך 5 דקות, ולאחר מכן להחזיק ב 4 ° C כדי לעצור את התגובה.
- השתמש ב- cDNA המסונתז כתבנית בתגובות PCR כדי לבדוק את הביטוי של אב נוירו-רשתית וסמנים של תאי רשתית בוגרים.
- נרמלו את תבניות ה-cDNA הכוללות של כל דגימה, כלומר F2-UD (hiPSC-F2-3F1; תאים לא ממוינים), OC-1M (אופטית בת שבוע בתרבית תרחיף) ו-OC-2M (אופטית בת 4 שבועות בתרבית תרחיף) על ידי PCR כמותי למחצה באמצעות גנים ביתיים כגון hE1fα או GAPDH.
- הכינו את תמהיל האב ל-PCR כמותי למחצה, כמפורט בטבלה 4, והניחו את מבחנות הבדיקה להגברה במחזור תרמי. תנאי הגברת ה-PCR מוזכרים בטבלה 5.
- היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה
- יש לאסוף את הכוסות האופטיות בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2.0 מ"ל ולשאוף את התווך העודף (שלבים 4.2.3-4.2.6). שטפו את האורגנואידים עם 1x PBS ולאחר מכן שטפו והשהו אותם ב-500 μL של 4% Paraformaldehyde כדי לתקן אותם למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
- למחרת, לשטוף את הכוסות במים deionized. תנו לכוסות לעמוד ב-95% אלכוהול (שלושה שינויים, 15-20 דקות כל אחד), ולאחר מכן 100% אלכוהול (שלושה שינויים, 15-20 דקות כל אחד), תערובת של 1:1 של אלכוהול מוחלט וקסילן למשך 15 דקות, קסילן (שני שינויים, 15 דקות כל אחד) ופרפין (שלושה שינויים, 15 דקות כל אחד). הטמע רקמה זו כדי להכין בלוק פרפין בעקבות הליכים סטנדרטיים. תנו לו להתקרר ולהתגבש.
- הכינו מקטעים דקים (~4-5 מיקרומטר עובי) באמצעות מיקרוטום והניחו אותם על שקופיות מיקרוסקופיות מצופות סילאן (ראו טבלת חומרים) בהתאם להליכים היסטולוגיים סטנדרטיים.
- עבור deparaffinization, לחמם את המגלשות ב 70 ° C על בלוק חימום במשך 15-20 דקות. ברגע שהשעווה נמסה, שטפו את המגלשות עם קסילן (שלושה שינויים, 3-4 דקות כל אחד), אשר יסיר את הפרפין לחלוטין.
הערה: הסרה לא מלאה של פרפין גורמת להכתמה גרועה/מטושטשת של קטעים עם כמות עצומה של רעשי רקע. - יש לייבש מחדש את המגלשות באחוזים שונים של אתנול (100%, 90% ו-80%) למשך 3 דקות כל אחת. שוטפים את המגלשות במים מזוקקים וממשיכים בשליפת אנטיגן.
- לפני תחילת שליפת האנטיגן, מחממים מראש את חיץ הציטראט (pH 6.0) בצנצנת קופלין (ראה טבלת חומרים) באמצעות תנור מיקרוגל עד שהוא מגיע ל 95-100 מעלות צלזיוס.
- טובלים את המגלשות במאגר ציטראט שחומם מראש ומחממים את הצנצנת במשך 15 דקות במיקרוגל. מוציאים את צנצנת קופלין מהתנור ומניחים לה להתקרר בטמפרטורת החדר.
- חסום את החלקים עבור peroxidase אנדוגני על ידי הוספת תערובת 1: 1 של מתנול ומי חמצן במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם 1x PBS.
- חדרו את המקטעים באמצעות 0.5% Triton-X 100 למשך 15 דקות. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם 1x PBS.
- חסום את הקישור הלא ספציפי של נוגדן ראשוני על ידי דגירה על החלקים עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ב- 1x PBS למשך שעה אחת.
- לדגור את החלקים עם נוגדן ראשוני במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (75 °F). שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם 1x PBS למשך 3-5 דקות כל אחת כדי להסיר את הנוגדן הלא קשור.
- מוסיפים נוגדן משני מצומד בצבע פלואורסצנטי מתאים ודוגרים במשך 45 דקות. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם 1x PBS למשך 3-5 דקות כל אחת.
הערה: הנוגדנים והדילולים שלהם בהתאמה מוזכרים בטבלת החומרים. מקטעי האורגנואידים ברשתית סומנו כמדוכונים באמצעות PAX6 ו-CHX10 כדי לזהות תאים מקדימים נוירו-רשתית מוקדמים, ובאמצעות Recoverin ו-CRX כדי לזהות תאים מקדימים של רשתית וקולטני אור. באופן דומה, אנטי-PAX6 ואנטי-MITF שימשו לזיהוי מבשרי RPE, ואנטי-CRALBP ואנטי-RPE65 שימשו לזיהוי תאי RPE בוגרים פיגמנטיים על ידי אימונוציטוכימיה של תרביות חד-שכבתיות דו-ממדיות. - הכתימו את המקטעים ב-DAPI או PI והרכיבו אותם על שקופית זכוכית באמצעות אמצעי ההרכבה נגד דהייה (ראו טבלת חומרים).
- צלם ותעד את המקטעים המתויגים החיסונית של אורגנואידים ברשתית ותרביות RPE באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר פלואורסצנטי או קונפוקלי כדי לבחון שכבות תאים שונות המבטאות סמני רשתית שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התמיינות של hiPSCs לשושלות עיניים מושגת על-ידי תרבית תאים בקוקטיילים שונים של מדיום תרבית המכיל תוספי מזון וגורמי גדילה בשלבים עוקבים בנקודות זמן שונות, כפי שמתואר באיור 1. תרביות hiPSC נשמרות בתווך Essential 8, מדיום תחזוקת תאי גזע פלוריפוטנטי. ברגע שהם מגיעים למפגש של 70%-80% (איור 2A), המדיום מוחלף ב-Differentiation Induction Medium (DIM) ביום 0 (עיין בשלב 3.2) המכיל 1 ng/mL bFGF, 1 ng/mL Noggin ו-1% תוספת N2. יחד עם תוסף N2 הגורם לעצבים, Noggin, מעכב איתות BMP, ממלא תפקיד מכריע בהכוונת התאים לעבר שושלת נוירואקטודרמלית על ידי חסימת מחויבות מזודרמלית ואנדודרמלית. ביום הראשון, השניוהשלישי, ריכוז הנוגין עולה ל-10 ננוגרם/מ"ל (עיין בשלב 3.3 ו-3.4). מהיוםהרביעי, ה-DIM מוחלף ב-Retinal Differentiation Medium (RDM) (שלב 3.5), והתרביות נשמרות ברציפות עד 30 יום. B27 בקוקטייל RDM מכיל תוספי מזון נוספים כגון נוגדי חמצון מרובים D-גלקטוז, אשר מקדם מטבוליזם אירובי ומסייע בהפחתת מתח חמצוני, שיפור הכדאיות של תאים אב מתמיינים. בנוסף, נוכחות של רטינול אצטט (ויטמין A) והורמוני גדילה כגון triiodo-I-thyronine (T3) מקדם התמיינות שושלת עצבית ורשתית.
ביום ה-14 עדה-18 נצפתה היווצרות של רוזטות עצביות, מה שמסמן את התחלת המחויבות לשדה העין (איור 2B). מבשרי שדה העין בתוך הרוזטות העצביות מתרבים ומתארגנים בעצמם לצבירים קדמוניים נפרדים של שדה העין (EFPs) עם מבנים נוירו-רשתית מעגליים במרכז. סוגי תאים אחרים כגון אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE), אפיתל הפסגה העצבית, ואלה התורמים לפני השטח של העין מופיעים ונודדים החוצה כאפיתל רציף עם שוליים מוגדרים היטב. ניתן לצפות בשדות עיניים בנויים היטב, כפי שתואר לעיל,בין היום ה-21 ליוםה-28 של התמיינות (איור 2C,D). האי המרכזי של גביעי נוירו-רשתית נקצרים בין היום ה-25 ל-30 באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית המושכת בלהבה (איור 2E) ונשמרים כתרחיות תרחיף לא דבקות ב-RDM למשך 1-2 שבועות נוספים, עד היום ה-45. אבות הרשתית המתרבים מתארגנים עוד יותר ויוצרים אורגנואידים תלת-ממדיים רב-ממדיים בקוטר של כ-2-3 מ"מ (איור 2F,G). מהיום ה-46 מוסיפים ל-RDM טאורין של 100 מיקרומטר כדי לקדם נוירוגנזה ולשפר את הישרדות התאים בתרביות אורגנואידים ארוכות טווח במבחנה (איור 2H).
אורגנואידים ברשתית מאופיינים בשלבים שונים של הבשלה לביטוי של מספר סמני אב ברשתית באמצעות שעתוק לאחור PCR (RT-PCR) ואימונוהיסטוכימיה (IHC). לשם כך, האורגנואידים נקצרים לבידוד RNA מוחלט ביום ה -30 וה-60 של התמיינות. תוצאות RT-PCR אישרו את השראתם והבעתם של סמנים נוירו-רשתית כגון NEUROD1, ChX10, CRX, PKCß1, RLBP1, RHOK, OPN1SW, RCVRN, ABCA4, RD3 ו-PDE6C באורגנואידים ברשתית בני שבוע (4-5 שבועות לאחר ההתמיינות, OC-1M) ואורגנואידי רשתית בני 4 שבועות 8,12 (7-8 שבועות לאחר ההתמיינות, OC-2M) (איור 3A). אימונוהיסטוכימיה והדמיה פלואורסצנטית אישרו את הביטוי של סמני אב רשתית מוקדמים PAX6, CHX10 ו-OTX2 ב-OC-1M וסמני רשתית בוגרים RCVRN ו-CRX ב-OC-2M 8,12 (איור 3Bi,ii).
בנוסף לגביעי הרשתית העצבית המרכזית, סוגי תאי העין האחרים, כגון אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE), אפיתל עצבי ותאי אפיתל משטח העין, יוצאים ונודדים אל מחוץ ל- EFPs. אבות RPE שמקורם בנוירואקטודרם מופיעים כתאי אפיתל מסודרים בצורה קומפקטית המקיפים את ה-EFPs, אשר מבשילים בהדרגה ומקבלים פיגמנט לאורך השוליים הנודדים מהיום ה-30-45 (איור 4A-C). תרביות התמיינות דבקות אלה, לאחר הסרת גביעוני רשתית, יכולות לפיכך להיות מורחבות עד ליום 45, כדי לקצור מבשרי RPE מתרבים (איור 4D), אשר ניתן להעשיר עוד יותר כדי להכין תרביות חד-שכבתיות של תאי RPE פיגמנטיים בוגרים לחלוטין. RPE פיגמנטי בוגר יכול להיראות כמונו-שכבות עם מורפולוגיה טיפוסית של אבן מרוצפת (איור 4E). זהות תאי RPE מאושרת עוד יותר על-ידי אימונוציטוכימיה באמצעות נוגדנים נגד סמנים ספציפיים ל-RPE כגון MITF (סמן אב RPE), PAX6 (סמן אב וסמן RPE בוגר) ו-RPE65 (סמן RPE בוגר)10,12 (איור 4F-H).
אורגנואידים רשתית פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע יכולים לשמש אפוא כמודלים במבחנה לחקר מחלות רשתית תורשתיות שונות 7,8,9. מודלים ספציפיים לתאי גזע מפותחים על ידי יצירת קווי iPSC ספציפיים למטופל או על ידי החדרת מוטציות ספציפיות למחלה בקווי iPSC בריאים לבקרה באמצעות גישת עריכת גנים מבוססת קריספר 7,8. תאי גזע פלוריפוטנטיים מוטנטיים מוטנטיים מושרים עשויים להתמיין ביעילות לסוגי תאי רשתית בהתאם למוטציות הגנטיות המעורבות. בעוד שרוב קווי תאי הבקרה הבריאים עקבו אחר ציר הזמן שתואר לעיל, יכולות להיות סטיות במקרה של תאי גזע פלוריפוטנליים ספציפיים למחלה במונחים של צירי זמן ההתמיינות, מורפולוגיית EFP, גודל הרשתית, למינציה והתבגרות. נבדק פוטנציאל התמיינות הרשתית של קו RB1-/- hiPSC (LVIP15-RB1-CS3) הנושא מחיקה ביאלית של 10 bp בתוך אקסון 18 של הגן RB1 האנושי, מה שמביא להסטת מסגרת ולאובדן מוחלט של ביטוי חלבון RB1. נצפה כי אובדן ביטוי RB1 לא השפיע על העין ועל התמיינות שושלת הרשתית המוקדמת של קו hiPSC המוטנטי. עם זאת, נצפתה עיכוב ניכר בלוחות הזמנים וירידה ביעילות יצירת EFP. ל-EFPs הלא טיפוסיים שהופיעו היו אגרגטים חריגים של אבות רשתית שלא הצליחו לרבד ולהתארגן לגביעי רשתית תקינים (איור 5A,B) או שלא היו באזור שמסביב של RPE ואפיתל פני העין (OSE) (איור 5C). כאשר הם נבחרו ונשמרו כתרביות תרחיף, אשכולות האב האלה של הרשתית יצרו אגרגטים נוירו-רשתית לא סדירים (איור 5D).
איור 1: ציר זמן המייצג את ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנליים מושרים לאורגנואידים ברשתית. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: יצירת אורגנואידים תלת-ממדיים ברשתית בהתארגנות עצמית. (A) גידול תרביות hiPSCs בתנאים נטולי הזנה. (B) פיתוח רוזטות עצביות ביום ה-14 להתמיינות (כוכבית). (ג,ד) צבירי שדה עין ראשוניים (EFP) המכילים מבנה דמוי גביע נוירו-רשתית מרכזי (חצים שחורים) המוקפים באזור הנדידה של האפיתל (חיצים לבנים) ביום 21-28 להתמיינות. (E) פיפטה פסטר מזכוכית משוכת להבה עם קצה מכור. העקומה החלקה באזור הציר משמשת לדחיפה והרמה של גביעי הרשתית (חץ). (ו,ז) גביעי רשתית שנקטפו ביום ה-25 וגודלו בתרבית תחת תרחיף כדי לייצר אורגנואידים רשתית תלת-ממדיים מאורגנים באופן עצמי. (H) אורגנואידים רשתית בוגרים בתרבית תרחיף ביום 45. מוטות קנה מידה: 100 מיקרומטר (A,B,D,G); 200 מיקרומטר (C,F,H). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אפיון אורגנואידים ברשתית. (A) פרופיל ביטוי גנים ברשתית על-ידי RT-PCR של קו hiPSC נורמלי בלתי ממוין 23 (hiPSC-F2-3F1) (F2-UD) והגביעים האופטיים הרגילים המובחנים שנקטפו לאחר 3-4 שבועות של התמיינות והבשילו עוד יותר בתרבית ההשעיה במשך שבוע אחד (OC-1M) ו-4 שבועות (OC-2M) בהתאמה. cDNA של כל דגימות הבדיקה נורמל באמצעות eEF1a כבקרת העמסה. (B) תמונות קונפוקליות של מקטעים בעלי תווית חיסונית של (i) אורגנואידים לא בשלים ברשתית (OC-1M) המשתמשים בנוגדנים כנגד סמני האב הנוירו-רשתית CHX10, PAX6 ו-OTX2 (באדום) ו-(ii) אורגנואידים רשתית בוגרים (OC-2M) המשתמשים בנוגדנים כנגד הסמנים מקדימים של קולטני האור Recoverin ו-CRX (באדום). השכבה החיצונית המסומנת ביותר של אורגנואידי הרשתית עם תאים קולטי אור מתמיינים (תיבה) בפאנלים השמאליים מוגדלת ומוצגת בפאנלים הימניים. DAPI שימש ככתם נגדי (בכחול). השלוחות הפנימיות הבסיסיות דמויות המקטע מסומנות בחצים לבנים. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הופעה של סוגי תאים עיניים שונים. (A) אשכולות EFP עם הגביע הנוירו-רשתית במרכז וגידולי RPE נודדים המראים פיגמנטציה לאורך הקצוות המובילים (חץ לבן). (B) גידולי אפיתל פיגמנטיים ממוינים היטב ממספר EFPs בכל רחבי האי הנוירו-רשתית. (C) הגדלה גבוהה יותר של EFP מראה את אזור הנדידה של אבות RPE (חץ לבן) ואפיתל פני השטח של העין (כוכבית) סביב גביע נוירו-רשתית. (D) תרביות דבקות מורחבות שפיתחו מונושכבות של תאי RPE לא בשלים המכילים תאים פיגמנטיים ותאים שאינם פיגמנטים. (E) תרביות חד-שכבתיות של תאי RPE בוגרים לחלוטין ופיגמנטים המראים מורפולוגיה מרוצפת אבן ביום ה-60. (פ-ח) תאי RPE המבטאים PAX6, MITF ו-RPE65 בירוק. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר (A,B); 100 מיקרומטר (C-E); 20 מיקרומטר (F-H). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: היווצרות לא תקינה של גביעוני רשתית ב-RB1-/- iPSCs מוטנטיים. (A,B) EFPs עם צברים חריגים של אבות רשתית עם למינציה מעוותת וחוסר פסיעות. (C) EFP עם הגביע הנוירו-רשתית המיניאטורי אך חסר את האזור שמסביב של RPE ואפיתל משטח העין (חץ). (D) אגרגטים נוירו-רשתית לא סדירים שנוצרו בתרבית תרחיף. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| שם פריימר | רצף ראשוני (5'-3') | גודל הרצועה (bp) | מזהה Ref | |||
| 1 | heEF1α | F: GAAGTCTGGTGATGCTGCCATTGT | 198 | NM_001402 | ||
| R: TTCTGAGCTCTGGGCAGACTTG | ||||||
| 2 | hNeuroD1 | F: CGCGCTTAGCATCACTAACT | 349 | NM_002500 | ||
| R: GCGTCTCTTGGGCTTTTGAT | ||||||
| 3 | hCHX10 | F: CAAGTCAGCCAAGGATGGCA | 382 | NM_182894 | ||
| R: CTTGACCTAAGCCATGTCCT | ||||||
| 4 | hCRX | F: TCAACGCCTTGGCCCTAAGT | 357 | NM_000554 | ||
| R: ACACATCTGTGGAGGGTCTT | ||||||
| 5 | hPKC-β1 | F: AAAGGCAGCTTTGGCAAGGT | 376 | NM_212535 | ||
| R: CGAGCATCACGTTGTCAAGT | ||||||
| 6 | RLBP1 | F: TGCACCATTGAAGCTGGCTA | 361 | NM_000326 | ||
| R: AGAAGGGCTTGACCACATTG | ||||||
| 7 | RHOK | F: CAAGCTGTATGCCTGCAAGA | 360 | NM_002929 | ||
| R: ATCCGGACATTGCCGTCATT | ||||||
| 8 | hOPN1SW | F: TGCTTCATTGTGCCTCTCTC | 373 | NM_001708 | ||
| R: AGCTGCATGTGTCGGATTCA | ||||||
| 9 | RCVRN | F: AGACCAACCAGAAGCTGGAGT | 367 | NM_002903 | ||
| R: ACGGGTGTCATGTGAGTGGTA | ||||||
| 10 | hABCA4 | F: CACCGTAGCAGGCAAGAGTATT | 271 | NG_009073 | ||
| R: AATGAGTGCGATGGCTGTGGAGA | ||||||
| 11 | hRD3 | F: ATGGTGCTGGAGACGCTTAT | 328 | NM_183059 | ||
| R: CTTCCTGCTTCATCCTCTCCA | ||||||
| 12 | hPDE6C | F: GTTGATGCCTGTGAACAAATGC | 351 | NM_006204 | ||
| R: ACCACTCAGCATAGGTGTGAT | ||||||
טבלה 1: רשימה של פריימרים ספציפיים לגן עבור RT-PCR.
| רכיבים לתערובת RNA-Primer | נפח (ב-μL) |
| RNA (1-2 מיקרוגרם) | n |
| 10 mM dNTP | 1 |
| 10 מ"מ אוליגו dT | 1 |
| מים שטופלו ב-DEPC | עד 10 |
| נפח תגובה כולל | 10 |
טבלה 2: תערובת מאסטר RNA-פריימר להמרת cDNA.
| רכיבים עבור Mastermix 2 | נפח (ב-μL) |
| מאגר RT 10x | 2 |
| 25 מ"מ MgCl2 | 4 |
| 0.1 מטר DTT | 2 |
| SuperScript III תעתיק הפוך | 1 |
| RNaseOut | 1 |
| נפח תגובה כולל | 10 |
טבלה 3: מאסטר מיקס 2 להמרת cDNA.
| רכיבי PCR | נפח (ב-μL)/תגובה |
| 10x PCR Buffer | 2 |
| 2 mM dNTP | 2 |
| פריימר קדמי (5 מיקרומטר) | 1 |
| פריימר הפוך (5 מיקרומטר) | 1 |
| Taq פולימראז | 0.2 |
| תבנית cDNA (50-100 ננוגרם) | 1 |
| מים סטריליים של מילי-קיו | 12.8 |
| נפח תגובה כולל | 20 |
טבלה 4: תמהיל אב ל-PCR כמותי למחצה.
| טמפרטורה | זמן | מס' מחזורים | |
| דנטורציה | 95 °C | 5 דקות | x 1 |
| דנטורציה | 95 °C | 30 שניות | x 35 |
| חישול | 50-60 מעלות צלזיוס | 30 שניות | |
| סיומת | 72 °C | 30 שניות | |
| הארכה סופית | 72 °C | 10 דק' | x 1 |
טבלה 5: תנאי הגברה של PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hiPSCs הם כלי רב עוצמה לחקר התפתחות איברים ורקמות במבחנה. שחזור פנוטיפ המחלה על ידי הבחנה בין hiPSCs בריאים לעומת ספציפיים למחלה לכיוון שושלת הרשתית יכול לעזור בהשגת תובנות חדשות יותר על הפתופיזיולוגיה של צורות שונות של ניוון רשתית תורשתי. מספר פרוטוקולים תוארו ואומצו להתמיינות חוץ גופית של PSCs לסוגי תאי רשתית. רובם כרוכים בשימוש במדיום תרבית המכיל קוקטיילים מורכבים של גורמי גדילה רקומביננטיים, תוספים, מולקולות קטנות וריאגנטים, כגון: תוספי N1, N2 ו-B27; חוסמי איתות BMP ו- TGFβ כמו Noggin, SB431542, LDN193189 ו- Follistatin, או משרים כגון Activin A, Lefty ו- IDE1; חוסמי איתות Wnt קנוניים כגון DKK1, SFRP, IWP-2 ו- IWR-1-endo, או משרים כגון CHIR99021, SB216763 ו- CKI-7; חוסמי איתות קולטן FGF כגון PD0325901 ו- PD173074 או משרים כמו bFGF; מעכבי איתות חריץ כגון DAPT; מולקולות איתות אחרות כגון גורם גדילה דמוי אינסולין (IGF-1); חומצה רטינואית; הורמוני גדילה כגון Triiodothyronine (T3) ו הידרוקורטיזון; ונוגדי חמצון וגורמים מעודדי הישרדות אחרים כגון חומצה אסקורבית, ניקוטינאמיד, טאורין, חומצה דוקוסהקסאנואית, 1-תיוגליצרול וכו '. רכיבים אלה נכללים בתווך התרבית בשלבים שונים של התמיינות תאי גזע כדי לעורר או לווסת מפלים איתות שונים כדי לגרום למחויבות לשושלת העין והרשתית 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22.
כאן מתוארת שיטה פשוטה, חזקה ויעילה יותר ליצירת אורגנואידים ברשתית ישירות מתרביות כמעט דבקות של hiPSCs. הפרוטוקול הפשוט כולל שימוש בפחות תוספים, גורמי גדילה ומולקולות קטנות שמעוררים בעיקר את ההתמיינות הראשונית של PSCs לשושלת הנוירואקטודרמלית. שלבי ההתמיינות הבאים מסתמכים על היכולת הטבועה של PSCs להתמיין באופן סינכרוני לסוג התא של שושלות קשורות, אשר לאחר מכן מארגנים את עצמם ומווסתים הדדית את הפיתוח והארגון המרחבי של סוגי תאים מרובים התורמים להיווצרות רקמות מורכבות. הנסיגה ההדרגתית של bFGF והוספת Noggin מסייעים בהשראת גורל נוירו-אקטודרמלית מוקדמת תוך 3 ימים מההבחנה. תחזוקה מתמשכת של תרביות התמיינות ב- RDM מעורר עצבים, ללא הוספת גורמי גדילה או מולקולות קטנות, גורמת להשראת מבנים קדמוניים של שדה העין (EFP) עם שוליים ברורים, תוך 3-4 שבועות מההתמיינות. ה- EFPs מכילים תאי אב רב-עוצמה, אשר לאחר תחזוקה בלתי מופרעת ומתמשכת, גורמים להתמיינות והרכבה עצמית של שושלות מרובות ליצירת EFPs מורכבים המורכבים מגביעי נוירו-רשתית במיקום מרכזי או גביעי אופטיקה (OCs), המוקפים בסוגי תאים עיניים קשורים אחרים כגון אפיתל פיגמנט רשתית (RPE), אפיתל עצבי ואפיתל משטח העין. לחלופין, ניתן לגדל את PSCs כתרביות השעיה מהיום 1-3 כדי ליצור EBs בתנאי תרבית זהים. ניתן לצפות את ה- EBs ביום 4 ולגדל כתרביות דבקות על משטחים מצופים מטריצה ב- RDM כדי ליזום התמיינות שושלת רשתית, כמתואר לעיל. תרביות דיפרנציאציה בריאות מניבות באופן שגרתי כ-20-30 EFPs לכל באר של צלחת בעלת 6 בארות. ניתן לקצור את ה- OCs מה- EFPs לאחר 3-4 שבועות של התמיינות רשתית והם נשמרים בתרביות תרחיף למשך 30-60 יום נוספים, כדי לאפשר התמיינות של אבות נוירו-רשתית וליצור אורגנואידים רשתית בוגרים. לאחר 4 שבועות של תרבית תרחיף, כ-70%-80% מהכוסות האופטיות שנבחרו מ-EFPs נשארות שלמות, שומרות על הלמינציה שלהן ומתפתחות לאורגנואידים רשתית בוגרים (OC-2M), עם תאי קולטני אור RCVRN + ו-CRX+ ותוספים דמויי מקטע פנימי בתוך השכבות החיצוניות ביותר.
המפגש של תרבויות iPSC גדלות הוא קריטי בזמן התחלת הבידול והעברת התרבויות ל- DIM. תרבויות עם מושבות קטנות יותר ומפגש מתחת ל -60%, ואלה המבדלות מראש, גורמות למספרי EFP מופחתים באופן משמעותי. כאשר אשכולות שדה העין מופיעים, האי המרכזי של גביעי נוירו-רשתית צריך להיות קצור בתוך שבוע אחד. ניתן לעשות זאת על ידי דחיפה והרמה עדינה של הכוסות השלמות באמצעות הזווית או האזור המעוגל של קצה נימי הזכוכית המושך בלהבה, כמתואר בסעיף הפרוטוקול. יש להקפיד שלא לפגוע בכוסות. עיכובים נוספים בקטיף יגרמו להשטחה ולאובדן הארגון התלת-ממדי עקב התרבות ונדידה של תאי אב נוירו-רשתית, מה שמקשה על הקציר וגורם לאורגנואידים לא טיפוסיים ברשתית.
היעילות של השראת שדה העין והבשלה של גביעוני הרשתית משתנה בין מחלות שונות או קווי hiPSC ספציפיים למטופל, בהתאם לפגמים הגנטיים הבסיסיים. לדוגמה, המחויבות לשושלת הרשתית והיעילות ליצירת EFP של קו ספציפי למחלת RP הייתה זהה לזו של תאי הביקורת הבריאים, בעוד שקו ריק RB1 לא הצליח ליצור EFPs (הנתונים לא מוצגים). קווים מסוימים שנשאו מוטציות הקשורות לאמאורוזיס מולד של Leber יצרו EFPs לא טיפוסיים עם פגמים בגודלם, הרכבה עצמית, למינציה והבשלה של אבות רשתית (הנתונים אינם מוצגים). תיקוף מולקולרי נוסף ופרופיל ביטוי גנים של אורגנואידים ברשתית ספציפיים למטופל בהשוואה לרקמות בקרה בריאות יהיו נחוצים כדי להבין את הפתופיזיולוגיה של מצב מחלה. בהתחשב בשונות בגנום המטופל ובמעורבות של רשתות מרובות גנים בביטויי מחלות, ייתכן שיהיה חשוב גם לחקור אורגנואידים ברשתית שמקורם בקווי iPSC איזוגניים כדי לבסס מתאם גנוטיפ-פנוטיפ מוחלט במחקרי מודלים של מחלות. קווים איזוגניים כאלה יכולים להיווצר על ידי נוקאאוטים גנטיים ממוקדים בקווי בקרה בריאים או על ידי תיקון המוטציות הפתוגניות בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ספציפיים לחולה, תוך שימוש בטכניקות מתקדמות לעריכת גנום 8,9.
אורגנואידים שלמים כאלה ברשתית שמקורם בקווי iPSC נורמליים או ספציפיים למחלה יכולים לשמש בבדיקות ובדיקות של תרופות חדשניות. ניתן לבודד ולהעשיר מבשרי פוטורצפטור בתוך אורגנואידים ברשתית וסוגים אחרים של תאי עין, כגון RPE ואפיתל הקרנית בתוך גידולי EFP, ולהעשיר אותם עוד יותר עבור היישומים שלהם במחקר בסיסי וברפואה רגנרטיבית. ניתן לאמץ בקלות את הפרוטוקול המתואר כאן לתהליכים תואמי GMP להכנת תאים בדירוג קליני המיועדים להערכות פרה-קליניות וניסויים קליניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לכל המחברים אין ניגוד עניינים או גילויים כספיים.
Acknowledgments
המחברים מודים על התמיכה המדעית והטכנית של ד"ר צ'יטרה קנאבירן, גנטיקאית; ד"ר סובהדרה ג'לאלי, יועצת רשתית; ד"ר מילינד נאיק, כירורג אוקולופלסטי; וד"ר סוואתי קליקי, אונקולוג עיניים במכון העיניים LV Prasad, היידראבאד לקראת יצירת קווי iPSC נורמליים וספציפיים למטופל. המחברים מודים על מענקי המו"פ של מועצת המחקר למדע והנדסה, המחלקה למדע וטכנולוגיה (IM), (SB/SO/HS/177/2013), המחלקה לביוטכנולוגיה (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019), ומלגות מחקר בכירות מ- ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) ו- CSIR (V.K.P.), ממשלת הודו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
| 15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
| Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
| Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
| Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
| Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
| GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
| HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
| Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
| Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
| Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
| Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
| Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
| Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |
References
- Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P.
- Sen, P., et al. Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years. Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).
- Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. Trend of retinal diseases in developing countries. Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).
- RetNet - Retinal Information Network. , Available from: https://sph.uth.edu/retnet/ (2022).
- Cicero, S. A., et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).
- Guo, Y., et al. Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361 (2019).
- Lane, A., et al. Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids. Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).
- Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).
- Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
- Meyer, J. S., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).
- Zhu, J., Lamba, D. A. Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (12), 2882 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Chichagova, V., et al. Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95 (2019).
- Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal. STAR Protocols. 1 (1), 100033 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Mellough, C. B., et al. IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
