Summary
Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het differentiëren van hiPSC's in oogveldclusters en het genereren van neuro-retinale organoïden met behulp van vereenvoudigde kweekomstandigheden waarbij zowel adherente als suspensiecultuursystemen betrokken zijn. Andere oculaire celtypen, zoals de RPE en het hoornvliesepitheel, kunnen ook worden geïsoleerd uit volwassen oogvelden in retinale culturen.
Abstract
Pluripotente stamcellen kunnen complexe weefselorganoïden genereren die nuttig zijn voor in vitro ziektemodelleringsstudies en voor het ontwikkelen van regeneratieve therapieën. Dit protocol beschrijft een eenvoudigere, robuuste en stapsgewijze methode voor het genereren van retinale organoïden in een hybride kweeksysteem bestaande uit adherente monolaagculturen gedurende de eerste 4 weken van retinale differentiatie tot het ontstaan van verschillende, zelfgeorganiseerde oogveld primordiale clusters (EFP's). Verder worden de donutvormige, cirkelvormige en doorschijnende neuro-retinale eilanden binnen elke EFP handmatig geplukt en gekweekt onder suspensie met behulp van niet-hechtende kweekschalen in een retinale differentiatiemedium gedurende 1-2 weken om meerlagige 3D-optische cups (OC-1M) te genereren. Deze onrijpe retinale organoïden bevatten PAX6+ en ChX10+ prolifererende, multipotente retinale voorlopers. De voorlopercellen zijn lineair zelf geassembleerd binnen de organoïden en verschijnen als verschillende radiale strepen. Na 4 weken na suspensiecultuur ondergaan de retinale voorlopers post-mitotische arrestatie en afstammingsdifferentiatie om volwassen retinale organoïden (OC-2M) te vormen. De fotoreceptorlijn gebonden voorlopers ontwikkelen zich binnen de buitenste lagen van retinale organoïden. Deze CRX+ en RCVRN+ fotoreceptorcellen rijpen morfologisch om binnenste segmentachtige extensies weer te geven. Deze methode kan worden toegepast voor het genereren van retinale organoïden met behulp van menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Alle stappen en procedures worden duidelijk uitgelegd en gedemonstreerd om repliceerbaarheid te garanderen en voor bredere toepassingen in fundamentele wetenschap en translationeel onderzoek.
Introduction
Het netvlies is een lichtgevoelig weefsel aan de achterkant van het gewervelde oog dat lichtsignalen omzet in zenuwimpulsen door een biochemisch fenomeen dat bekend staat als de fototransductieroute. De initiële zenuwimpulsen die in de fotoreceptorcellen van het netvlies worden gegenereerd, worden getransduceerd naar andere retinale interneuronen en retinale ganglioncellen (RGC's) en bereiken de visuele cortex van de hersenen, wat helpt bij beeldperceptie en visuele respons.
Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) zijn naar schatting 1,5 miljoen kinderen blind, waarvan 1 miljoen in Azië. Erfelijke retinale dystrofie (IRD) is een belangrijke blinderende ziekte die 1 op de 4.000 personen wereldwijd treft 1,2,3, terwijl de prevalentie van blindheid geassocieerd met leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) varieert van 0,6% -1,1% in ontwikkelingslanden 4. IRD's worden veroorzaakt door erfelijke genetische defecten in meer dan 300 verschillende genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling en functie van het netvlies5. Dergelijke genetische veranderingen resulteren in de verstoring van normale retinale functies en geleidelijke degeneratie van retinale cellen, namelijk de fotoreceptorcellen en het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE), wat leidt tot ernstig verlies van het gezichtsvermogen en blindheid. Er is enorme vooruitgang geboekt in andere verblindende aandoeningen met betrekking tot het hoornvlies, de lens, enz. Retinale dystrofieën en oogzenuwatrofieën hebben tot op heden echter geen bewezen therapie. Aangezien een volwassen menselijk netvlies geen stamcellenheeft 6, kunnen alternatieve bronnen zoals embryonale stamcellen (SER's) en patiënt-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) een onbeperkte voorraad van gewenste celtypen bieden en een grote belofte inhouden voor het ontwikkelen van complexe weefselorganoïden die nodig zijn voor in vitro ziektemodelleringsstudies en voor het ontwikkelen van regeneratieve therapieën7, 8,9,10.
Enkele jaren van netvliesonderzoek hebben geleid tot een beter begrip van moleculaire gebeurtenissen die de vroege retinale ontwikkeling orkestreren. De meeste protocollen om retinale cellen en 3D-organoïden uit PSC's te genereren, hebben tot doel deze ontwikkelingsgebeurtenissen in vitro samen te vatten, door de cellen te kweken in een complexe cocktail van groeifactoren en kleine moleculen om de bekende biologische processen stapsgewijs te moduleren. De aldus gegenereerde retinale organoïden bestaan uit belangrijke retinale cellen: retinale ganglioncellen (RGC's), interneuronen, fotoreceptoren en retinaal gepigmenteerd epitheel (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. Ondanks succesvolle pogingen om IRD's te modelleren met behulp van retinale organoïden, vormt de behoefte aan de complexe cocktail van groeifactoren en kleine moleculen tijdens differentiatie en de relatief lage efficiëntie van retinale organoïde generatie een grote uitdaging bij de meeste protocollen. Ze omvatten voornamelijk de vorming van embryoïde lichamen, gevolgd door hun stapsgewijze differentiatie in retinale afstammingslijnen met behulp van complexe kweekomstandigheden in verschillende stadia van in vitro ontwikkeling20,21,22.
Hier wordt een vereenvoudigde en robuuste methode gerapporteerd voor het ontwikkelen van complexe 3D neuro-retinale organoïden uit gezonde controle en retinale ziekte-specifieke hiPSC's. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van directe differentiatie van bijna-confluente hiPSC-culturen zonder dat embryoïde lichaamsvorming nodig is. Ook is de complexiteit van het kweekmedium vereenvoudigd, waardoor het een kosteneffectieve en reproduceerbare techniek is die gemakkelijk door nieuwe onderzoekers kan worden overgenomen. Het gaat om een hybride kweeksysteem bestaande uit aanhangende monolaagculturen gedurende de eerste 4 weken van retinale differentiatie tot het ontstaan van verschillende, zelfgeorganiseerde oogveld primordiale clusters (EFP's). Verder worden de cirkelvormige neuro-retinale eilanden binnen elke EFP handmatig geplukt en gekweekt in suspensieculturen gedurende 1-2 weken om meerlagige 3D-retinale cups of organoïden te bereiden die bestaan uit PAX6 + en CHX10 + prolifererende neuro-retinale voorlopers. Uitgebreide kweek van retinale organoïden in 100 μM Taurine-bevattend medium gedurende nog eens 4 weken resulteerde in de opkomst van RCVRN + en CRX + fotoreceptorvoorlopers en volwassen cellen met rudimentaire binnenste segmentachtige extensies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten met hiPSC's werden aseptisch uitgevoerd, in overeenstemming met de standaard laboratoriumpraktijken, ethische en bioveiligheidsrichtlijnen en met de goedkeuring van regelgevende instanties zoals de Institutional Ethics Committee (IEC), Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR) en Institutional Bio-Safety Committee (IBSC).
1. Bereiding van iPSC-cultuur en retinale differentiatiemedium en reagentia
- iPSC kweek- en onderhoudsmedium
- Kweek en handhaaf de normale hiPSC-lijn23 (hiPSC-F2-3F1) en een CRISPR-bewerkte, RB1-/- hiPSC-lijn (LVIP15-RB1-CS3, met biallelische, frameshiftdeletie van 10 bp binnen het exon 18 van het menselijke RB1-gen) in Essential 8-medium op matrigel-gecoate (keldermembraanmatrix gecoate; zie materiaaltabel) kweekplaten onder feedervrije kweekomstandigheden.
OPMERKING: Dit protocol kan volledig xenovrij worden gemaakt door de keldermembraanmatrix te vervangen door de recombinante vitronectine (VTN-N) coating. Bereid het complete Essential 8-medium voor door 50x Essential 8-supplement (geleverd met de Essential 8-mediumkit; zie materiaaltabel) en 100 U / ml penicilline-streptomycine-oplossingen toe te voegen. Als alternatief kunnen de hiPSC's ook worden gekweekt met behulp van het volledige mTeSR1-medium.
- Kweek en handhaaf de normale hiPSC-lijn23 (hiPSC-F2-3F1) en een CRISPR-bewerkte, RB1-/- hiPSC-lijn (LVIP15-RB1-CS3, met biallelische, frameshiftdeletie van 10 bp binnen het exon 18 van het menselijke RB1-gen) in Essential 8-medium op matrigel-gecoate (keldermembraanmatrix gecoate; zie materiaaltabel) kweekplaten onder feedervrije kweekomstandigheden.
- Celdissociatie-oplossing (1x CDS)
- Voor een enzymvrije dissociatie en passaging van menselijke iPSC's, bereid de CDS met 0,5 mM EDTA, pH 8,0 en 30 mM NaCl in 1x Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) (zie tabel met materialen).
- Om 100 ml 1x CDS te bereiden, voegt u 100 μL 0,5 M EDTA en 1 ml 3 M NaCl-stamoplossingen toe aan 99 ml 1x DPBS, mengt u goed en filtersteriliseert u met een filter van 0,22 μm.
- Differentiatie inductiemedium (DIM)
- Bereid DIM met DMEM-F12 Basaal medium aangevuld met 10% Knockout Serum Replacement (KOSR), 1x Niet-Essentieel Aminozuur (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U/ml Penicilline-Streptomycine, 200 μM L-Ascorbinezuur en 1% N2 supplement (zie Tabel met materialen).
- Retinaal differentiatiemedium (RDM)
- Bereid RDM met DMEM-F12 Basaal medium aangevuld met 10% Knockout Serum (KOSR), 1x Niet-Essentieel Aminozuur (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U/ml Penicilline-Streptomycine, 200 μM L-Ascorbinezuur en 2% B27 supplement (met vitamine A) (zie Tabel met materialen).
- Extracellulaire matrix-gecoate celkweekoppervlakken
- Ontdooi de hESC-gekwalificeerde keldermembraanmatrix een nacht in een ijsemmer, bij voorkeur in een koelkast bij 4-8 °C. Verdun de ontdooide 100x matrixbouillon (5 ml) in een verhouding van 1:5 door 20 ml ijskoud DMEM-F12 basaal medium toe te voegen en meng door zachtjes te draaien om een 20x stockoplossing te bereiden.
- Bereid 0,5 ml aliquots op ijs met behulp van voorgekoelde pipetpunten en steriele microcentrifugebuizen. Label de injectieflacons als 20x voorraad en bewaar ze bevroren in een vriezer van -80 °C gedurende maximaal 6 maanden.
- Voor het coaten van de celkweekoppervlakken (kweekschalen of 6-putplaten), ontdooi een aliquot van 20x matrix op ijs en verdun het in een verhouding van 1:20 met behulp van ijskoud DMEM-F12 basaal medium om 10 ml 1x matrixcoatingoplossing te bereiden, wat voldoende is om een schaal van 100 mm of een 6-well-plaat (1,5 ml / put) te coaten.
OPMERKING: Prechill de pipetten/microtips door ijskoude en steriele DPBS aan te zuigen voordat u de matrixoplossing hanteert. Het ontdooien en alle handelingen van de matrix moeten op ijs gebeuren, met behulp van voorgekoelde pipetten/microtips om polymerisatie en geleren bij kamertemperatuur te voorkomen. - Voeg 1,5 ml 1x matrixcoatingoplossing toe aan elke put van een 6-putplaat, draai de plaat voorzichtig rond om een gelijkmatige coating te garanderen en incuber de platen bij 37 °C in een 5% CO 2-incubator. Laat de platen minimaal 1 uur ongestoord om een uniforme coating van de matrix op de kweekoppervlakken te garanderen.
- Voordat u de cellen zaait, zuigt u de coatingoplossing uit met behulp van een steriele pipet van 5 ml en gooit u het vloeibare afval weg. Voeg onmiddellijk vers kweekmedium toe (2 ml / put van een 6-putplaat) en zaai de cellen met een dichtheid van 150.000-200.000 cellen / put. Laat de platen niet drogen tijdens het hanteren.
OPMERKING: Als alternatief kan recombinante vitronectine (VTN-N) coating in een eindconcentratie van 0,5 μg/ml worden gebruikt voor een xenovrij kweekprotocol.
- Ontdooi de hESC-gekwalificeerde keldermembraanmatrix een nacht in een ijsemmer, bij voorkeur in een koelkast bij 4-8 °C. Verdun de ontdooide 100x matrixbouillon (5 ml) in een verhouding van 1:5 door 20 ml ijskoud DMEM-F12 basaal medium toe te voegen en meng door zachtjes te draaien om een 20x stockoplossing te bereiden.
2. Vaststellen van menselijke iPSC-culturen
- Ontdooien en heropleving van hiPSC's
- Bedek een put van een 6-well plaat met 1x membraanmatrixoplossing. Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur om polymerisatie en uniforme coating van het kweekoppervlak mogelijk te maken.
- Verwijder na 1 uur incubatie de coatingoplossing en voeg 1 ml voorverwarmd compleet Essential 8-medium toe dat 10 μM Rho-kinaseremmer, Y-27632 (1 μL/ml 10 mM-bouillon, zie materiaaltabel) bevat, voordat de cellen nieuw leven worden ingeblazen.
- Verwijder een hiPSC cryoviale kolf (1 x 106 cellen/injectieflacon) uit de container voor vloeibare stikstof. Ontdooi de cryovial snel in een waterbad van 37 °C met zacht zwenken.
OPMERKING: Ontdooi de injectieflacon niet volledig; Noteer het doorgangsnummer, steriliseer de injectieflacon op het oppervlak en veeg deze droog met een pluisvrij wattenstaafje met 70% isopropylalcohol. - Gebruik een steriele pipetpunt van 1 ml om de cryoviale inhoud op te zuigen in een verse buis van 15 ml, bestaande uit 2 ml voorverwarmd compleet Essential 8-medium zonder Y-27632. Centrifugeer de buis op 1.000 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer de celpellet in 1,0 ml volledig Essential 8-medium met 10 μM Y-27632.
- Voeg deze celsuspensie toe aan de met matrix gecoate oppervlakken zonder de matrix te verstoren door deze langs de wanden af te geven. Schommel de plaat voorzichtig kruislings om de gelijkmatige verdeling van de cellen te garanderen.
- Incubeer de platen bij 37 °C in een 5% CO 2-incubator om de cellen te laten hechten en te laten prolifereren.
- Vervang na 12-24 uur het gebruikte medium en onderhoud de culturen in voorverwarmd compleet Essential 8-medium zonder Y-27632.
- Verander het kweekmedium elke 24 uur en passeer de culturen zodra ze 70% -80% samenvloeiing bereiken.
OPMERKING: Een gesplitste verhouding van 1:6 wordt routinematig gevolgd voor hiPSC-culturen en wordt met regelmatige tussenpozen van 3-4 dagen gepasseerd.
- Passaging en plating van hiPSC's om retinale afstammingsdifferentiatie te initiëren
- Zuig het gebruikte medium op uit 70%-80% confluente menselijke iPSC-culturen in 6-putplaten.
- Voeg 1 ml CDS (stap 1.2) toe aan elke put en incubeer bij 37 °C gedurende 5-7 minuten totdat de cellen zijn afgerond. Verwijder voorzichtig de CDS, zorg ervoor dat de cellen niet loskomen en voeg 2 ml vers Essential 8-medium toe en tritueer voorzichtig met een pipet.
- Verzamel de celsuspensie uit een put van een 6-celplaat in een centrifugebuis van 15 ml en draai de buis gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur op 1.000 x g . Gooi het supernatant weg.
- Suspendien de celpellet in 1,2 ml Essential 8-medium en doseer 200 μL van de cel 200μL van de celsuspensie (1:6 splitverhouding) in elk putje van een matrixgecoate 6-wellplaat met 1,5 ml iPSC-kweekmedium met 10 μM Y-27632, zoals beschreven in stap 1.5.
- Vervang na 12-24 uur het gebruikte medium en onderhoud de culturen in voorverwarmd compleet Essential 8-medium zonder Y-27632.
- Verander het kweekmedium elke 24 uur totdat de culturen 70% -80% samenvloeiing bereiken.
3. Differentiatie van hiPSC's in oogvelden en retinale afstamming
OPMERKING: Een schematisch overzicht van het differentiatieproces is weergegeven in figuur 1.
- Start de differentiatieprocedure zodra de hiPSC-culturen 70% -80% samenvloeiing bereiken.
- Vervang op dag 0 het hiPSC-onderhoudsmedium in DIM (stap 1.3) met 1 ng/ml bFGF en 1 ng/ml Noggin. Voeg 2,0 ml medium toe per put van een 6-well plaat en houd de cellen op 37 °C in een 5% CO 2-incubator.
OPMERKING: Geleidelijke terugtrekking van bFGF induceert de differentiatie van PSC's, en de toevoeging van toenemende concentraties van Noggin (remmer van verschillende BMP's) tijdens de beginfasen induceert ectodermale afstammingsdifferentiatie en neuralisatie11,12 en blokkeert het mesoderm en endoderm commitment. Als alternatief kan Noggin worden vervangen door LDN193189. In tegenstelling tot de dubbele SMAD-remmingsstrategie die eerderwerd gerapporteerd 20,21, vereist dit protocol niet de toevoeging van Activin of SB-431542. - Vervang op dag 1 het gebruikte medium en voeg DIM toe met 1 ng / ml bFGF en 10 ng / ml Noggin. Voeg 2,0 ml per put van een 6-well plaat toe. Incubeer en houd de cellen op 37 °C in een 5% CO 2-incubator.
- Verwijder op dag 2-3 het gebruikte medium en voeg DIM toe met slechts 10 ng / ml Noggin. Voeg 2,0 ml per put van een 6-putplaat toe en verander het medium elke 24 uur. Incubeer en houd de cellen op 37 °C in een 5% CO 2-incubator.
OPMERKING: Verwarm het kweekmedium voor gebruik altijd voor op 30-37 °C. Overtollige floaters en dode cellen kunnen worden waargenomen in vroege differentiatieculturen. Was onder dergelijke omstandigheden de culturen eenmaal met 1x DPBS en voeg het retinale differentiatiemedium toe. Steriliteitstests op het gebruikte medium kunnen wekelijks of indien nodig worden uitgevoerd. - Verwijder op dag 4 het gebruikte medium en voeg de RDM toe (stap 1.4). Voeg 2,0 ml per put van een 6-well plaat toe en blijf de culturen in RDM op 37 °C houden in een 5% CO 2-incubator, met elke dag een verse mediumwissel.
OPMERKING: Als alternatief kunnen de PSC's worden gekweekt als suspensieculturen van dag 1-3, in niet-hechtende en ronde bodemplaten met 96 putjes, met een celdichtheid van 5 x 103 cellen / 100 μL / put om embryoïde lichamen (EB's) te vormen onder identieke kweekomstandigheden in DIM. Goed gevormde EB's op dag 4 kunnen worden geplateerd op matrix-gecoate platen die RDM bevatten en mogen hechten, prolifereer en differentieer zoals hieronder beschreven. - Observeer rond dag 14-18 de culturen onder een microscoop met een vergroting van 10x voor het ontstaan van neurale rozetachtige domeinen bestaande uit vroege oogveldvoorlopers (figuur 2B).
- Observeer rond dag 21-28 (3-4 weken) culturen onder een microscoop met een vergroting van 4x en 10x om de opkomst van zelfgeorganiseerde, verschillende EFP's te observeren, met een centraal eiland van cirkelvormige 3D neuro-retinale structuren omgeven door aaneengesloten uitlopers van neuro-epitheel en oculair oppervlakte-epitheel (figuur 2C, D).
OPMERKING: Ongeveer 20-30 EFP's kunnen worden waargenomen per put van een 6-well plaat van een normale hiPSC retinale differentiatiecultuur. Dit aantal kan variëren met andere ziektespecifieke hiPSC-lijnen, op basis van hun genetische achtergrond en differentiatiepotentieel van retinale afstamming.
4. Oogsten van retinale organoïden
- Vlamtrekken van glazen Pasteur pipetten voor het handmatig plukken van retinale cups.
OPMERKING: Gebruik geautoclaveerde en steriele glazen Pasteurpipetten voor het plukken van oogvelden.- Zet een Bunsen-brander aan. Neem een steriele Pasteur-pipet en houd de basis in de ene hand en de capillaire punt in de andere. Vlam steriliseren en verwarmen het gebied in de buurt van het midden van de capillaire punt, met rotatiebewegingen totdat het glas buigzaam wordt. Ga vervolgens weg van de vlam en trek snel naar buiten om een fijne capillaire punt met een gesloten lumen te creëren.
- Houd de fijne punt horizontaal voor de vlam en laat deze snel in een naar buiten gerichte beweging door de vlam gaan om een gladde haak of een L-vormige capillaire punt te creëren.
- Gebruik de gladde buitenste krommingszone van de capillaire haak als een fijne schep om de intacte neuro-retinale cups voorzichtig op te tillen en los te maken van de EFP-clusters.
OPMERKING: De gladde hoek van de glazen capillaire haak veroorzaakt geen schade aan de cellen en veroorzaakt geen krassen op kweekoppervlakken. Deze eenvoudige tool kan ook effectief worden gebruikt voor het splitsen van individuele hiPSC-kolonies in rasterpatronen en voor het doorgeven ervan als kleine celclusters tijdens klonale expansie.
- Cultuur en onderhoud van retinale cups om 3D retinale organoïden te genereren.
- Voeg op dag 25-30 4,0 ml voorverwarmd retinale differentiatiemedium toe in een schaal met lage hechting van 60 mm voordat u zich voorbereidt op de oogst van neuro-retinale cups.
- Werk onder een stereomicroscoop met een vergroting van 0,63x-4,5x om goed gevormde neuro-retinale cups van individuele EFP's te observeren en handmatig te kiezen.
OPMERKING: Het verschijnen van gepigmenteerde RPE-celuitwassen helpt bij de eenvoudige identificatie van EFP's en de centraal geplaatste neuro-retinale cups. De retinale cups verschijnen als donutvormige, cirkelvormige en doorschijnende 3D-structuren, met duidelijke radiale strepen, gevormd door de lineair gerangschikte en zelf geassembleerde retinale stamcellen, in tegenstelling tot de dicht opeengepakte en bolvormige of onregelmatige clusters gevormd door de CZS-neuronen of de neurale topcellen23. - Gebruik de vlamgetrokken Pasture-pipethaken om het centrale neuro-retinale eiland voorzichtig in individuele EFP's te duwen en eruit te scheppen.
- Stel een micropipette van 1 ml in om 100 μL op te zuigen en gebruik 1 ml microtips met brede boringsopeningen om de zwevende retinale cups op te zuigen en over te brengen in de verse, laag hechtende kweekschalen die in stap 4.2.1 zijn bereid.
OPMERKING: Het gebruik van tips met een kleinere boringsgrootte en een hogere zuigdruk kan afschuiving veroorzaken en de integriteit van retinale cups beïnvloeden. De geschatte afmetingen van de retinale cups zijn ongeveer 1-2 mm in diameter. - Handhaaf de retinale cups in RDM als niet-hechtende suspensieculturen en incubeer ze bij 37 °C in een 5% CO 2-incubator.
- Dag 30-45: Verander het medium dagelijks door de schaal voorzichtig te kantelen en de netvliesbekers ongeveer 30 s te laten bezinken. Volg een gedeeltelijke voedingsmethode, verwijder de helft van het gebruikte medium en vervang door gelijke volumes vers medium.
OPMERKING: Vermijd herhaalde aspiratie en overdrachten om schade aan de netvliesbekers te voorkomen. Na 1-2 weken suspensiecultuur groeien de retinale cups iets in omvang (1-3 mm) en ontwikkelen ze zich tot zelfgeorganiseerde 3D-retinale organoïden (OC-1M) bestaande uit lineair gerangschikte, vroege neuro-retinale voorlopers die PAX6 en CHX10 tot expressie brengen (figuur 3Bi). - Dag 45-60: Kweek de retinale organoïden gedurende nog eens 4 weken in RDM met 100 μM Taurine (zie tabel met materialen) ter ondersteuning van een betere overleving en afstammingsdifferentiatie van neuro-retinale voorlopercellen en de ontwikkeling van volwassen retinale celtype (OC-2M).
OPMERKING: Ongeveer 70% -80% van de retinale of optische cups geplukt uit EFP's blijven intact, behouden hun laminering en ontwikkelen zich tot volwassen retinale organoïden na 4 weken suspensiecultuur (OC-2M). - Controleer of de volwassen retinale organoïden na 4 weken suspensiecultuur de opkomst vertonen van RCVRN + en CRX + fotoreceptorvoorlopers en volwassen cellen met een rudimentaire binnenste segmentachtige extensie in de buitenste cellagen, waardoor het normale retinale ontwikkelings- en rijpingsproces in vitro wordt samengevat (figuur 3Bii).
OPMERKING: Na het verwijderen van neuro-retinale cups kunnen de differentiatieculturen continu in RDM worden gehandhaafd. De proximale epitheliale uitlopers rond het neuro-retina bevatten retinale gepigmenteerde epitheel (RPE) celvoorlopers, die verder uitzetten en rijpen tot gepigmenteerde RPE-monolagen met typische kasseimorfologie (figuur 4). De distale uitlopers bestaan voornamelijk uit oculair oppervlakte-epitheel dat bijdraagt aan de lens en hethoornvliesepitheel. Gewenste celtypen kunnen worden geoogst uit verschillende zones van EFP-uitlopers en verder worden verrijkt om zuivere culturen te vestigen.
5. Karakterisering van retinale organoïden
- Morfologische en moleculaire karakterisering
- Observeer de aanhangende EFP's en zwevende retinale organoïden onder een fasecontrastmicroscoop bij 4x en 10x vergroting en documenteer hun morfologie en afmetingen.
- Verzamel ongeveer 20 retinale organoïden in verschillende stadia van rijping (stappen 4.2.3-4.2.6) in microcentrifugebuizen van 1,5 ml met behulp van brede boring 1.000 μL tips. Laat de organoïden onderaan bezinken en zuig het medium eruit. Was de cups met 1x PBS.
- Verwijder de overtollige PBS en voeg 1,0 ml TRIzol-reagens toe (zie materiaaltabel). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Homogeniseer het weefsel met een buisstamper en tritueer met een pipet van 1,0 ml.
- Bereid totaal RNA voor door de standaard reagensmethode van RNA-isolatie en -zuivering te volgen, volgens de instructies van de fabrikant (zie tabel met materialen).
- Controleer de RNA-kwaliteit op de agarosegel en kwantificeer deze met behulp van de NanoDrop Spectrophotometer (zie Tabel met materialen).
- Zet 1-2 μg totaal RNA om in cDNA met behulp van het reverse transcriptase-enzym volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel). Zie tabel 1 voor een lijst van genspecifieke primers.
- Bereid in het kort het RNA-primer mastermengsel in 10 μL van het totale volume zoals vermeld in tabel 2 en incubeer de buis bij 65 °C gedurende 5 minuten in een thermische cycler. Breng de buis van de thermische cycler gedurende 2 minuten over op ijs.
- Bereid ondertussen het hoofdmengsel 2 met de in tabel 3 vermelde reagentia. Voeg deze mastermix toe aan de RNA-primer mengbuis die in stap 5.1.7 is voorbereid. Meng voorzichtig.
- Incubeer het monster bij 50 °C gedurende 50 minuten, vervolgens 85 °C gedurende 5 minuten en houd het vervolgens bij 4 °C om de reactie te stoppen.
- Gebruik het gesynthetiseerde cDNA als een sjabloon in PCR-reacties om te controleren op de expressie van neuro-retinale voorloper- en rijpe retinale celmarkers.
- Normaliseer de totale cDNA-sjablonen van elk monster, namelijk F2-UD (hiPSC-F2-3F1; ongedifferentieerde cellen), OC-1M (1 week oude optische beker in suspensiecultuur) en OC-2M (4 weken oude optische beker in suspensiecultuur) door semi-kwantitatieve PCR met behulp van de huishoudgenen zoals hE1fα of GAPDH.
- Bereid het hoofdmengsel voor op semikwantitatieve PCR, zoals vermeld in tabel 4, en plaats de testmonsterbuizen voor versterking in een thermische cycler. De PCR-versterkingscondities zijn vermeld in tabel 5.
- Histologie en immunohistochemie
- Verzamel de optische cups in een microcentrifugebuis van 2,0 ml en zuig het overtollige medium op (stappen 4.2.3-4.2.6). Spoel de organoïden af met 1x PBS en was en suspensie ze vervolgens in 500 μL 4% paraformaldehyde om ze 's nachts bij kamertemperatuur te fixeren.
- Was de volgende dag de kopjes in gedeïoniseerd water. Laat de kopjes staan in 95% alcohol (drie veranderingen, 15-20 min elk), gevolgd door 100% alcohol (drie veranderingen, 15-20 min elk), een 1:1 mix van absolute alcohol en xyleen gedurende 15 min, xyleen (twee veranderingen, 15 min elk) en paraffine (drie veranderingen, 15 min elk). Sluit dit weefsel in om een paraffineblok te bereiden volgens standaardprocedures. Laat het afkoelen en stollen.
- Bereid dunne secties (~ 4-5 μm dikte) voor met behulp van een microtoom en plaats ze op silaan-gecoate microscopische dia's (zie tabel met materialen) volgens standaard histologische procedures.
- Verwarm voor deparaffinisatie de dia's op 70 °C op een verwarmingsblok gedurende 15-20 minuten. Zodra de was is gesmolten, was je de dia's met xyleen (drie veranderingen, elk 3-4 minuten), waardoor de paraffine volledig wordt verwijderd.
OPMERKING: Onvolledige verwijdering van paraffine resulteert in slechte / fragmentarische kleuring van secties met een enorme hoeveelheid achtergrondgeluid. - Hydrateer de dia's opnieuw met verschillende percentages ethanol (100%, 90% en 80%) gedurende elk 3 minuten. Spoel de dia's af met gedestilleerd water en ga verder met het ophalen van antigeen.
- Voordat u begint met het ophalen van het antigeen, verwarmt u de citraatbuffer (pH 6,0) in een Coplin-pot (zie materiaaltabel) met behulp van een magnetron tot deze 95-100 °C bereikt.
- Dompel de dia's onder in een voorverwarmde citraatbuffer en verwarm de pot gedurende 15 minuten in een magnetron. Haal de Coplin pot uit de oven en laat afkoelen op kamertemperatuur.
- Blokkeer de secties voor endogene peroxidase door gedurende 5 minuten een 1:1 mengsel van methanol en waterstofperoxide toe te voegen, gevolgd door de secties driemaal te wassen met 1x PBS.
- Permeabiliseer de secties met 0,5% Triton-X 100 gedurende 15 minuten. Was de dia's driemaal met 1x PBS.
- Blokkeer de niet-specifieke binding van primaire antilichamen door de secties te incuberen met 10% foetaal runderserum (FBS) in 1x PBS gedurende 1 uur.
- Incubeer de secties met primaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C. Was de dia's driemaal met 1x PBS gedurende 3-5 minuten elk om het ongebonden antilichaam te verwijderen.
- Voeg geschikte fluorescerende kleurstof-geconjugeerde secundaire antilichamen toe en incubeer gedurende 45 minuten. Was de dia's driemaal met 1x PBS gedurende 3-5 minuten elk.
OPMERKING: De antilichamen en hun respectieve verdunningen worden vermeld in de materiaaltabel. De retinale organoïde secties werden immunogelabeld met behulp van PAX6 en CHX10 om vroege neuro-retinale voorlopercellen te detecteren, en met behulp van Recoverin en CRX om toegewijde retinale en fotoreceptorvoorlopercellen te detecteren. Evenzo werden anti-PAX6 en anti-MITF gebruikt om RPE-voorlopers te detecteren, en anti-CRALBP en anti-RPE65 werden gebruikt om gepigmenteerde volwassen RPE-cellen te detecteren door immunocytochemie van 2D-monolaagculturen. - Zet de secties tegen elkaar met DAPI of PI en monteer ze op een glasplaat met behulp van het antifade montagemedium (zie Materiaaltabel).
- Beeld en documenteer de immunogelabelde secties van retinale organoïden en RPE-culturen met behulp van een fluorescentie- of confocale laserscanmicroscoop om verschillende cellagen te onderzoeken die verschillende retinale markers tot expressie brengen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Differentiatie van hiPSC's in ooglijnen wordt bereikt door de cellen te kweken in verschillende cocktails van kweekmedium met supplementen en groeifactoren in opeenvolgende stappen op verschillende tijdstippen, zoals beschreven in figuur 1. De hiPSC-culturen worden onderhouden in Essential 8-medium, het pluripotente stamcelonderhoudsmedium. Zodra ze 70% -80% confluentie bereiken (figuur 2A), wordt het medium op dag 0 vervangen door differentiatie-inductiemedium (DIM) (zie stap 3.2) met 1 ng / ml bFGF, 1 ng / ml noggin en 1% N2-supplement. Samen met het neuraal-inducerende N2-supplement speelt Noggin, de BMP-signaleringsremmer, een cruciale rol bij het richten van de cellen op neuro-ectodermale afstamming door mesodermale en endodermale betrokkenheid te blokkeren. Op de 1e, 2e en3e dag wordt de concentratie van Noggin verhoogd tot 10 ng / ml (zie stap 3.3 en 3.4). Vanaf de4e dag wordt de DIM vervangen door Retinal Differentiation Medium (RDM) (stap 3.5) en worden de culturen tot 30 dagen continu onderhouden. De B27 in de RDM-cocktail bevat aanvullende supplementen zoals meerdere antioxidanten en D-Galactose, die het aerobe metabolisme bevordert en helpt bij het verminderen van oxidatieve stress, waardoor de levensvatbaarheid van differentiërende voorlopercellen wordt verbeterd. Bovendien bevordert de aanwezigheid van retinolacetaat (vitamine A) en groeihormonen zoals triiodo-I-thyronine (T3) neurale en retinale afstammingsdifferentiatie.
Op de 14etot 18edag wordt de vorming van neurale rozetten waargenomen, wat de initiatie van oogveldbetrokkenheid markeert (figuur 2B). De voorlopers van het oogveld in de neurale rozetten vermenigvuldigen zich verder en organiseren zichzelf in verschillende oogveld primordiale clusters (EFP's) met circulaire neuro-retinale structuren in het midden. Andere celtypen zoals het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE), neurale topepitheel en die welke bijdragen aan het oculaire oppervlak komen naar voren en migreren als aaneengesloten epitheel met goed gedefinieerde marges. Goed gevormde oogvelden, zoals hierboven beschreven, kunnen worden waargenomen tussen de 21etot 28edag van differentiatie (figuur 2C, D). Het centrale eiland van neuro-retinale cups wordt geoogst tussen dag 25-30 met behulp van een vlamgetrokken glazen Pasteur-pipet (figuur 2E) en wordt gehandhaafd als niet-hechtende suspensieculturen in RDM gedurende nog eens 1-2 weken, tot dag 45. De prolifererende retinale voorlopers organiseren zichzelf verder om meerlagige 3D-retinale organoïden met een diameter van ongeveer 2-3 mm te vormen (figuur 2F, G). Vanaf dag 46 wordt de RDM aangevuld met 100 μM Taurine om neurogenese te bevorderen en de celoverleving in langdurige organoïde culturen in vitro te verbeteren (figuur 2H).
Retinale organoïden worden gekarakteriseerd in verschillende stadia van rijping voor de expressie van verschillende retinale voorlopermarkers met behulp van reverse transcriptie PCR (RT-PCR) en immunohistochemie (IHC). Hiervoor worden de organoïden geoogst voor totale RNA-isolatie op de 30een 60edag van differentiatie. RT-PCR-resultaten bevestigden de inductie en expressie van neuro-retinale markers zoals NEUROD1, ChX10, CRX, PKCß1, RLBP1, RHOK, OPN1SW, RCVRN, ABCA4, RD3 en PDE6C in 1 week oude retinale organoïden (4-5 weken na differentiatie, OC-1M) en 4 weken oude retinale organoïden 8,12 (7-8 weken na differentiatie, OC-2M) (Figuur 3A). Immunohistochemie en fluorescentiebeeldvorming hebben de expressie bevestigd van vroege retinale voorlopermarkers PAX6, CHX10 en OTX2 in OC-1M en volwassen retinale markers RCVRN en CRX in OC-2M 8,12 (figuur 3Bi,ii).
Naast de centrale neuro-retinale cups komen de andere oculaire celtypen, zoals het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE), neurale kutopepitheel en oculaire oppervlakte-epitheelcellen, tevoorschijn en migreren uit de EFP's. De van neuroectoderm afgeleide RPE-voorlopers verschijnen als compact gerangschikte epitheelcellen rond de EFP's, die geleidelijk rijpen en gepigmenteerd worden langs de migratiemarges vanaf dag 30-45 (figuur 4A-C). Deze aanhangende differentiatieculturen kunnen, na het verwijderen van retinale cups, daarom worden verlengd tot dag 45, om prolifererende RPE-voorlopers te oogsten (figuur 4D), die verder kunnen worden verrijkt om monolaagculturen van volledig volwassen gepigmenteerde RPE-cellen te bereiden. Volwassen gepigmenteerde RPE kan worden gezien als monolagen met typische kasseimorfologie (figuur 4E). De RPE-celidentiteit wordt verder bevestigd door immunocytochemie met behulp van antilichamen tegen RPE-specifieke markers zoals MITF (RPE-voorlopermarker), PAX6 (voorloper en rijpe RPE-marker) en RPE65 (volwassen RPE-marker)10,12 (figuur 4F-H).
Pluripotente stamcel-afgeleide retinale organoïden kunnen dus dienen als in vitro modellen voor het bestuderen van verschillende erfelijke netvliesaandoeningen 7,8,9. Ziektespecifieke stamcelmodellen worden ontwikkeld door patiëntspecifieke iPSC-lijnen te genereren of door ziektespecifieke mutaties in gezonde controle-iPSC-lijnen te introduceren met behulp van de CRISPR-gebaseerde genbewerkingsbenadering 7,8. De gemuteerde iPSC's kunnen al dan niet efficiënt differentiëren in retinale celtypen, afhankelijk van de betrokken genmutaties. Hoewel de meeste gezonde controlecellijnen de hierboven beschreven tijdlijn volgden, kunnen er afwijkingen zijn in het geval van ziektespecifieke iPSC's in termen van de differentiatietijdlijnen, EFP-morfologie, retinale cupgrootte, laminatie en rijping. Het retinale differentiatiepotentieel van een RB1-/- hiPSC-lijn (LVIP15-RB1-CS3) met een biallelische deletie van 10 bp in het exon 18 van het menselijke RB1-gen werd onderzocht, wat resulteert in een frameshift en volledig verlies van RB1-eiwitexpressie. Er werd waargenomen dat het verlies van RB1-expressie geen invloed had op de oog- en vroege retinale afstammingsdifferentiatie van de mutante hiPSC-lijn. Er werd echter een duidelijke vertraging in tijdlijnen en een vermindering van de EFP-vormingsefficiëntie waargenomen. De atypische EFP's die naar voren kwamen, hadden abnormale aggregaten van retinale voorlopers die niet lamineerden en zichzelf organiseerden in de juiste retinale cups (figuur 5A, B) of de omringende zone van RPE en oculair oppervlakte-epitheel (OSE) misten (figuur 5C). Wanneer ze als suspensieculturen werden geplukt en onderhouden, vormden deze retinale voorloperclusters onregelmatige neuro-retinale aggregaten (figuur 5D).
Figuur 1: Tijdlijn die de differentiatie van iPSC's in retinale organoïden weergeeft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Zelfgeorganiseerde 3D retinale organoïde generatie. (A) Groeiende hiPSC-culturen onder feedervrije omstandigheden. (B) Het ontwikkelen van neuronale rozetten op dag 14 van differentiatie (sterretje). (C,D) Eye field primordial (EFP) clusters met een centrale neuro-retinale cup-achtige structuur (zwarte pijlen) omgeven door de migrerende zone van het epitheel (witte pijlen) op dag 21-28 van differentiatie. (E) Vlamgetrokken glazen Pasteur-pipet met een gehaakte punt. De vloeiende curve bij het scharniergebied wordt gebruikt voor het duwen en optillen van de retinale cups (pijl). (F,G) Retinale cups geoogst op dag 25 en gekweekt onder suspensie om zelfgeorganiseerde 3D retinale organoïden te genereren. (H) Rijpe retinale organoïden in suspensiecultuur op dag 45. Schaalstaven: 100 μm (A,B,D,G); 200 μm (C,F,H). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Karakterisering van retinale organoïden. (A) Retinale genexpressieprofilering door RT-PCR van de ongedifferentieerde normale hiPSC-lijn 23 (hiPSC-F2-3F1) (F2-UD) en de gedifferentieerde normale optische cups geplukt bij 3-4 weken differentiatie en verder gerijpt in suspensiecultuur gedurende respectievelijk 1 week (OC-1M) en 4 weken (OC-2M ). De cDNA's van alle testmonsters werden genormaliseerd met eEF1a als belastingscontrole. (B) Confocale beelden van immunogelabelde secties van (i) onrijpe retinale organoïden (OC-1M) met behulp van antilichamen tegen de neuro-retinale voorlopermarkers CHX10, PAX6 en OTX2 (in rood) en (ii) volwassen retinale organoïden (OC-2M) met behulp van antilichamen tegen de fotoreceptorvoorlopermarkers Recoverin en CRX (in rood). De gemarkeerde buitenste laag van de retinale organoïden met differentiërende fotoreceptorcellen (kader) in de linkerpanelen worden ingezoomd en weergegeven in de rechterpanelen. DAPI werd gebruikt als tegenvlek (in blauw). De rudimentaire binnenste segmentachtige uitlopers worden gemarkeerd door witte pijlen. Schaalbalk: 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Opkomst van verschillende oculaire celtypen. (A) EFP-clusters met de neuro-retinale cup in het midden en migrerende RPE-uitlopers die pigmentatie vertonen langs de voorranden (witte pijl). (B) Goed gedifferentieerde gepigmenteerde epitheliale uitlopers van meerdere EFP's rondom het neuro-retinale eiland. (C) Hogere vergroting van een EFP toont de migratiezone van RPE-voorlopers (witte pijl) en oculair oppervlakte-epitheel (asterisk) rond een neuro-retinale cup. (D) Uitgebreide adherente culturen die monolagen van onrijpe RPE-cellen ontwikkelden die zowel gepigmenteerde als niet-gepigmenteerde cellen bevatten. (E) Monolaagculturen van volledig volwassen en gepigmenteerde RPE-cellen die op dag 60 kasseimorfologie vertonen. (F-H) RPE-cellen die PAX6, MITF en RPE65 in het groen tot expressie brengen. Schaalbalk: 200 μm (A,B); 100 μm (C-E); 20 μm (F-H). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Abnormale retinale cupvorming in RB1-/- mutante iPSC's. (A,B) EFP's met abnormale aggregaten van retinale voorlopercellen met vervormde laminatie en gebrek aan strepen. (C) EFP met de miniatuur neuro-retinale cup, maar zonder de omringende zone van RPE en oculair oppervlakte-epitheel (pijl). (D) Onregelmatige neuro-retinale aggregaten gevormd in suspensiecultuur. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Primer naam | Priemreeks (5'-3') | Band grootte (bp) | Referentie ID | |||
| 1 | heEF1α | F: GAAGTCTGGTGATGCTGCCATTGT | 198 | NM_001402 | ||
| R: TTCTGAGCTTTCTGGGCAGACTTG | ||||||
| 2 | hNeuroD1 | F: CGCGCTTAGCATCACTAACT | 349 | NM_002500 | ||
| R: GCGTCTCTTGGGCTTTTGAT | ||||||
| 3 | hCHX10 | F: CAAGTCAGCCAAGGATGGCA | 382 | NM_182894 | ||
| R: CTTGACCTAAGCCATGTCCT | ||||||
| 4 | hCRX | F: TCAACGCCTTGGCCCTAAGT | 357 | NM_000554 | ||
| R: ACACATCTGTGGAGGGTCTT | ||||||
| 5 | hPKC-β1 | F: AAAGGCAGCTTTGGCAAGGT | 376 | NM_212535 | ||
| R: CGAGCATCACGTTGTCAAGT | ||||||
| 6 | RLBP1 | F: TGCACCATTGAAGCTGGCTA | 361 | NM_000326 | ||
| R: AGAAGGGCTTGACCACATTG | ||||||
| 7 | RHOK | F: CAAGCTGTATGCCTGCAAGA | 360 | NM_002929 | ||
| R: ATCCGGACATTGCCGTCATT | ||||||
| 8 | hOPN1SW | F: TGCTTCATTGTGCCTCTCTC | 373 | NM_001708 | ||
| R: AGCTGCATGTGTCGGATTCA | ||||||
| 9 | Rcvrn | F: AGACCAACCAGAAGCTGGAGT | 367 | NM_002903 | ||
| R: ACGGGTGTCATGTGAGTGGTA | ||||||
| 10 | hABCA4 | F: CACCGTAGCAGGCAAGAGTATT | 271 | NG_009073 | ||
| R: AATGAGTGCGATGGCTGTGGAGA | ||||||
| 11 | hRD3 | F: ATGGTGCTGGAGACGCTTAT | 328 | NM_183059 | ||
| R: CTTCCTGCTTCATCCTCTCCA | ||||||
| 12 | hPDE6C | F: GTTGATGCCTGTGAACAAATGC | 351 | NM_006204 | ||
| R: ACCACTCAGCATAGGTGTGAT | ||||||
Tabel 1: Lijst van genspecifieke primers voor RT-PCR.
| Componenten voor RNA-Primer mix | Volume (in μL) |
| RNA (1-2 μg) | n |
| 10 mM dNTP | 1 |
| 10 mM Oligo dT | 1 |
| DEPC-behandeld water | tot 10 |
| Totaal reactievolume | 10 |
Tabel 2: RNA-primer mastermix voor cDNA-conversie.
| Componenten voor Mastermix 2 | Volume (in μL) |
| 10x RT buffer | 2 |
| 25 mM MgCl2 | 4 |
| 0,1 m DTT | 2 |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | 1 |
| RNaseOUT | 1 |
| Totaal reactievolume | 10 |
Tabel 3: Mastermix 2 voor cDNA-conversie.
| Componenten van PCR | Volume (in μL)/reactie |
| 10x PCR-buffer | 2 |
| 2 mM dNTP | 2 |
| Voorwaartse primer (5 μM) | 1 |
| Omgekeerde primer (5 μM) | 1 |
| Taq Polymerase | 0.2 |
| cDNA Sjabloon (50-100 ng) | 1 |
| Steriel Milli-Q water | 12.8 |
| Totaal reactievolume | 20 |
Tabel 4: Mastermix voor semikwantitatieve PCR.
| Temperatuur | Tijd | Aantal cycli | |
| Denaturatie | 95 °C | 5 min | x 1 |
| Denaturatie | 95 °C | 30 s | x 35 |
| Annealing | 50-60 °C | 30 s | |
| Extensie | 72 °C | 30 s | |
| Definitieve uitbreiding | 72 °C | 10 min | x 1 |
Tabel 5: PCR-versterkingscondities.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hiPSC's zijn een krachtig hulpmiddel om orgaan- en weefselontwikkeling in vitro te bestuderen. Het samenvatten van het fenotype van de ziekte door gezonde versus ziektespecifieke hiPSC's te differentiëren in de richting van de retinale afstamming kan helpen bij het verkrijgen van nieuwere inzichten in de pathofysiologie van verschillende vormen van erfelijke retinale dystrofieën. Verschillende protocollen zijn beschreven en aangenomen voor de in vitro differentiatie van PSC's in retinale celtypen. De meeste van hen omvatten het gebruik van kweekmedium met complexe cocktails van recombinante groeifactoren, supplementen, kleine moleculen en reagentia, zoals: N1-, N2- en B27-supplementen; BMP- en TGFβ-signaleringsblokkers zoals Noggin, SB431542, LDN193189 en Follistatin, of inductoren zoals Activin A, Lefty en IDE1; canonieke Wnt-signaleringsblokkers zoals DKK1, SFRP, IWP-2 en IWR-1-endo, of inductoren zoals CHIR99021, SB216763 en CKI-7; FGF-receptorsignaleringsblokkers zoals PD0325901 en PD173074 of inductoren zoals bFGF; notch signaleringsremmers zoals DAPT; andere signaalmoleculen zoals insuline-achtige groeifactor (IGF-1); retinoïnezuur; groeihormonen zoals Triiodothyronine (T3) en Hydrocortison; en anti-oxidanten en andere pro-overlevingsfactoren zoals ascorbinezuur, nicotinamide, taurine, docosahexaeenzuur, 1-thioglycerol, enz. Deze componenten zijn opgenomen in het kweekmedium in verschillende stadia van stamceldifferentiatie om verschillende signaalcascades te stimuleren of te moduleren om oog- en retinale afstammingsverbinteniste induceren 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22.
Hier wordt een eenvoudigere, robuuste en efficiënte methode beschreven om retinale organoïden rechtstreeks te genereren uit bijna-confluente, adherente culturen van hiPSC's. Het vereenvoudigde protocol omvat het gebruik van minder supplementen, groeifactoren en kleine moleculen die voornamelijk de initiële differentiatie van PSC's in de neuro-ectodermale afstamming veroorzaken. Daaropvolgende differentiatiestappen zijn afhankelijk van het inherente vermogen van PSC's om synchroon te differentiëren in het celtype van verwante afstammingslijnen, die vervolgens zelf de ontwikkeling en ruimtelijke organisatie van meerdere celtypen organiseren en wederzijds reguleren die bijdragen aan de vorming van complexe weefsels. De geleidelijke terugtrekking van bFGF en de toevoeging van Noggin helpen bij de succesvolle inductie van vroege neuro-ectodermale lotsverbintenis binnen 3 dagen na differentiatie. Voortgezet onderhoud van differentiatieculturen in neuraal-inducerende RDM, zonder toevoeging van groeifactoren of kleine moleculen, resulteert in de inductie van oogveld primordiale (EFP) structuren met duidelijke marges, binnen 3-4 weken na differentiatie. De EFP's bevatten multipotente voorlopercellen, die bij ongestoord en voortgezet onderhoud resulteren in multi-lineage differentiatie en zelfassemblage om complexe EFP's te vormen die bestaan uit centraal geplaatste neuro-retinale cups of optische cups (OC's), omringd door andere gerelateerde oculaire celtypen zoals het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE), neurale topepitheel en oculair oppervlakte-epitheel. Als alternatief kunnen de PSC's worden gekweekt als suspensieculturen van dag 1-3 om EB's te vormen onder identieke kweekomstandigheden. De EB's kunnen op dag 4 verder worden geplateerd en als hechtende culturen op matrixgecoate oppervlakken in RDM worden gekweekt om retinale afstammingsdifferentiatie te initiëren, zoals hierboven beschreven. Gezonde differentiërende culturen geven routinematig aanleiding tot ongeveer 20-30 EFP's per put van een 6-putplaat. De OC's kunnen worden geoogst uit de EFP's na 3-4 weken retinale differentiatie en worden nog eens 30-60 dagen in suspensieculturen gehouden, om de differentiatie van neuro-retinale voorlopercellen mogelijk te maken en om volwassen retinale organoïden te genereren. Na 4 weken suspensiecultuur blijft ongeveer 70% -80% van de optische cups geplukt uit EFP's intact, behoudt hun laminering en ontwikkelt zich tot volwassen retinale organoïden (OC-2M), met RCVRN + en CRX + toegewijde fotoreceptorcellen en binnenste segmentachtige extensies in de buitenste lagen.
De samenvloeiing van groeiende iPSC-culturen is van cruciaal belang op het moment van het initiëren van differentiatie en het verschuiven van de culturen naar DIM. Culturen met kleinere kolonies en samenvloeiing onder 60%, en culturen die vroegrijp differentiëren, resulteren in aanzienlijk verminderde EFP-aantallen. Wanneer de oogveldclusters tevoorschijn komen, moet het centrale eiland van neuro-retinale cups binnen 1 week worden geoogst. Dit kan worden gedaan door de intacte kopjes voorzichtig te duwen en op te tillen met behulp van de hoek of het gebogen gebied van de door de vlam getrokken glazen capillaire punt, zoals beschreven in het protocolgedeelte. Er moet voor worden gezorgd dat de kopjes niet worden beschadigd. Verdere vertragingen bij het plukken zouden resulteren in afvlakking en een verlies van 3D-organisatie als gevolg van de proliferatie en migratie van neuro-retinale voorlopercellen, wat het oogsten moeilijk maakt en resulteert in atypische retinale organoïden.
De efficiëntie van oogveldinductie en rijping van retinale cups varieert tussen verschillende ziekte- of patiëntspecifieke hiPSC-lijnen, afhankelijk van de onderliggende genetische defecten. De retinale afstammingsverbintenis en EFP-vormende efficiëntie van een RP-ziektespecifieke lijn was bijvoorbeeld identiek aan die van de gezonde controlecellen, terwijl een RB1-nullijn geen EFP's vormde (gegevens niet getoond). Sommige lijnen met mutaties die verband houden met Leber Congenitale Amaurosis vormden atypische EFP's met defecten in hun grootte, zelfassemblage, laminering en rijping van retinale voorlopers (gegevens niet getoond). Verdere moleculaire validaties en genexpressieprofilering van patiëntspecifieke retinale organoïden in vergelijking met gezonde controleweefsels zouden nodig zijn om de pathofysiologie van een ziekteaandoening te begrijpen. Gezien de variabiliteit in het genoom van patiënten en de betrokkenheid van multigennetwerken bij ziekteverschijnselen, kan het ook belangrijk zijn om retinale organoïden afgeleid van isogene iPSC-lijnen te bestuderen om een absolute genotype-fenotypecorrelatie vast te stellen in ziektemodelleringsstudies. Dergelijke isogene lijnen kunnen worden gecreëerd door gerichte gen knock-outs in gezonde controlelijnen of door de pathogene mutaties in patiëntspecifieke iPSC's te corrigeren, met behulp van geavanceerde genoombewerkingstechnieken 8,9.
Dergelijke intacte retinale organoïden afgeleid van normale of ziektespecifieke iPSC-lijnen kunnen worden gebruikt bij het screenen en testen van nieuwe geneesmiddelen. Fotoreceptorvoorlopers in de retinale organoïden en andere oculaire celtypen, zoals de RPE en het hoornvliesepitheel in de EFP-uitlopers, kunnen verder worden geïsoleerd en verrijkt voor hun toepassingen in fundamenteel onderzoek en regeneratieve geneeskunde. Het hier beschreven protocol kan eenvoudig worden toegepast op GMP-conforme processen voor het bereiden van cellen van klinische kwaliteit die bedoeld zijn voor preklinische en klinische proefevaluaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs hebben geen belangenconflicten of financiële openbaarmakingen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de wetenschappelijke en technische ondersteuning van Dr. Chitra Kannabiran, geneticus; Dr. Subhadra Jalali, retinale consultant; Dr. Milind Naik, Oculoplastisch Chirurg; en Dr. Swathi Kaliki, oculaire oncoloog aan het LV Prasad Eye Institute, Hyderabad naar het genereren van normale en patiëntspecifieke iPSC-lijnen. De auteurs erkennen de R&D-subsidies van de Science and Engineering Research Board, Department of Science and Technology (IM), (SB/SO/HS/177/2013), Department of Biotechnology (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019) en Senior Research Fellowships van ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) en CSIR (V.K.P.), Government of India.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
| 15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
| Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
| Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
| Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
| Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
| GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
| HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
| Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
| Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
| Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
| Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
| Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
| Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |
References
- Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P.
- Sen, P., et al. Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years. Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).
- Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. Trend of retinal diseases in developing countries. Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).
- RetNet - Retinal Information Network. , Available from: https://sph.uth.edu/retnet/ (2022).
- Cicero, S. A., et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).
- Guo, Y., et al. Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361 (2019).
- Lane, A., et al. Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids. Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).
- Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).
- Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
- Meyer, J. S., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).
- Zhu, J., Lamba, D. A. Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (12), 2882 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Chichagova, V., et al. Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95 (2019).
- Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal. STAR Protocols. 1 (1), 100033 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Mellough, C. B., et al. IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
