Summary
Este protocolo descreve um método eficiente de diferenciar hiPSCs em clusters de campos oculares e gerar organoides neuro-retinianos usando condições de cultura simplificadas envolvendo sistemas de cultura aderentes e de suspensão. Outros tipos de células oculares, como o EPR e o epitélio corneano, também podem ser isolados de campos oculares maduros em culturas de retina.
Abstract
Células-tronco pluripotentes podem gerar organoides teciduais complexos que são úteis para estudos de modelagem de doenças in vitro e para o desenvolvimento de terapias regenerativas. Este protocolo descreve um método mais simples, robusto e gradual de geração de organoides da retina em um sistema híbrido de cultura consistindo de culturas aderentes de monocamadas durante as primeiras 4 semanas de diferenciação retiniana até o surgimento de grupos primordiais de campo ocular (PFEs) distintos e auto-organizados. Além disso, as ilhas neurorretinianas em forma de rosca, circulares e translúcidas dentro de cada EFP são manualmente colhidas e cultivadas sob suspensão usando placas de cultura não aderentes em um meio de diferenciação retiniana por 1-2 semanas para gerar copos ópticos 3D multicamadas (OC-1M). Estes organoides imaturos da retina contêm precursores multipotentes da retina com proliferação de PAX6+ e ChX10+. As células precursoras são linearmente auto-organizadas dentro dos organoides e aparecem como estrias radiais distintas. Após 4 semanas da cultura de suspensão, os progenitores da retina sofrem parada pós-mitótica e diferenciação de linhagens para formar organoides retinianos maduros (OC-2M). Os precursores comprometidos da linhagem fotorreceptora desenvolvem-se dentro das camadas mais externas dos organoides da retina. Essas células fotorreceptoras CRX+ e RCVRN+ amadurecem morfologicamente para exibir extensões segmentares internas. Este método pode ser adotado para a geração de organoides da retina usando células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Todas as etapas e procedimentos são claramente explicados e demonstrados para garantir a replicabilidade e para aplicações mais amplas em ciência básica e pesquisa translacional.
Introduction
A retina é um tecido sensível à luz presente na parte de trás do olho do vertebrado que converte sinais luminosos em impulsos nervosos por um fenômeno bioquímico conhecido como via de fototransdução. Os impulsos nervosos iniciais gerados nas células fotorreceptoras da retina são transduzidos para outros interneurônios da retina e células ganglionares da retina (RGCs) e atingem o córtex visual do cérebro, o que ajuda na percepção da imagem e na resposta visual.
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), estima-se que 1,5 milhão de crianças sejam cegas, das quais 1 milhão estão na Ásia. A distrofia hereditária da retina (DIR) é uma importante doença cegante que afeta 1 em cada 4.000 indivíduos em todo o mundo 1,2,3, enquanto a prevalência de cegueira associada à degeneração macular relacionada à idade (DMRI) varia de 0,6%-1,1% em países emdesenvolvimento4. Os IRDs são causados por defeitos genéticos hereditários em mais de 300 genes diferentes envolvidos no desenvolvimento e função da retina5. Tais alterações genéticas resultam na interrupção das funções normais da retina e na degeneração gradual das células da retina, nomeadamente as células fotorreceptoras e o epitélio pigmentado da retina (EPR), levando assim a uma grave perda de visão e cegueira. Enormes progressos foram feitos em outras condições de cegamento envolvendo a córnea, lente, etc. No entanto, distrofias retinianas e atrofias do nervo óptico não têm nenhuma terapia comprovada até o momento. Uma vez que a retina humana adulta não possui células-tronco6, fontes alternativas como células-tronco embrionárias (CTEs) e células-tronco pluripotentes induzidas derivadas do paciente (iPSCs) podem fornecer um suprimento ilimitado de tipos celulares desejados e ser uma grande promessa para o desenvolvimento de organoides teciduais complexos necessários para estudos de modelagem de doenças in vitro e para o desenvolvimento de terapias regenerativas7, 8,9,10.
Vários anos de pesquisa na retina levaram a uma melhor compreensão dos eventos moleculares que orquestram o desenvolvimento inicial da retina. A maioria dos protocolos para gerar células da retina e organoides 3D a partir de PSCs visa recapitular esses eventos de desenvolvimento in vitro, cultivando as células em um complexo coquetel de fatores de crescimento e pequenas moléculas para modular os processos biológicos conhecidos de forma escalonada. Os organoides da retina assim gerados são constituídos pelas principais células da retina: células ganglionares da retina (CGRs), interneurônios, fotorreceptores e epitélio pigmentado da retina (EPR)11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Apesar das tentativas bem-sucedidas de modelar IRDs usando organoides da retina, a exigência do complexo coquetel de fatores de crescimento e pequenas moléculas durante a diferenciação e a eficiência relativamente baixa da geração de organoides da retina representam um grande desafio com a maioria dos protocolos. Incluem principalmente a formação de corpos embrionários, seguida de sua diferenciação gradual em linhagens retinianas utilizando condições complexas de cultura em diferentes estágios de desenvolvimento in vitro 20,21,22.
Aqui, um método simplificado e robusto de desenvolvimento de organoides neuro-retinianos 3D complexos a partir de controle saudável e hiPSCs específicas da doença da retina é relatado. O protocolo aqui descrito utiliza a diferenciação direta de culturas de hiPSC quase confluentes sem a necessidade de formação de corpo embrionário. Além disso, a complexidade do meio de cultura é simplificada, tornando-o uma técnica custo-efetiva e reprodutível que pode ser facilmente adotada por novos pesquisadores. Envolve um sistema híbrido de cultura que consiste em culturas aderentes de monocamadas durante as primeiras 4 semanas de diferenciação retiniana até o surgimento de grupos primordiais de campos oculares (PFEs) distintos e auto-organizados. Além disso, as ilhas neuro-retinianas circulares dentro de cada EFP são colhidas manualmente e cultivadas em culturas de suspensão por 1-2 semanas para preparar copos de retina 3D multicamadas ou organoides consistindo de precursores neuro-retinais de proliferação PAX6+ e CHX10+. A cultura prolongada de organoides da retina em meio contendo taurina 100 μM por mais 4 semanas resultou no surgimento de precursores fotorreceptores RCVRN+ e CRX+ e células maduras com extensões rudimentares semelhantes a segmentos internos.
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Protocol
Todos os experimentos envolvendo hiPSCs foram realizados de forma asséptica, em aderência às práticas laboratoriais padrão, diretrizes éticas e de biossegurança, e com as aprovações de órgãos reguladores como o Comitê de Ética Institucional (IEC), Comitê Institucional de Pesquisa com Células-Tronco (IC-SCR) e Comitê Institucional de Biossegurança (IBSC).
1. Preparo de cultura iPSC e meio de diferenciação retiniana e reagentes
- Cultura iPSC e meio de manutenção
- Cultivar e manter a linha hiPSC normal23 (hiPSC-F2-3F1) e uma linha CRISPR editada, RB1-/- hiPSC (LVIP15-RB1-CS3, com deleção bialélica, frameshift de 10 pb dentro do éxon 18 do gene RB1 humano) em meio Essential 8 em placas de cultura revestidas com matrigel (matriz de membrana basal; ver Tabela de Materiais) em condições de cultura livres de alimentador.
NOTA: Este protocolo pode ser totalmente livre de xeno, substituindo a matriz da membrana basal pelo revestimento de vitronectina recombinante (VTN-N). Prepare o meio Essential 8 completo adicionando 50x suplemento Essential 8 (fornecido com o kit médio Essential 8; ver Tabela de Materiais) e 100 U/mL de soluções de penicilina-estreptomicina. Alternativamente, as hiPSCs também podem ser cultivadas usando o meio mTeSR1 completo.
- Cultivar e manter a linha hiPSC normal23 (hiPSC-F2-3F1) e uma linha CRISPR editada, RB1-/- hiPSC (LVIP15-RB1-CS3, com deleção bialélica, frameshift de 10 pb dentro do éxon 18 do gene RB1 humano) em meio Essential 8 em placas de cultura revestidas com matrigel (matriz de membrana basal; ver Tabela de Materiais) em condições de cultura livres de alimentador.
- Solução de dissociação celular (1x CDS)
- Para uma dissociação livre de enzimas e passagem de iPSCs humanas, prepare o CDS contendo 0,5 mM de EDTA, pH 8,0 e 30 mM de NaCl em 1x solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco (ver Tabela de Materiais).
- Para preparar 100 mL de 1x CDS, adicionar 100 μL de EDTA 0,5M e 1 mL de soluções estoque de NaCl 3 M a 99 mL de 1x DPBS, misturar bem e esterilizar filtrando usando um filtro de 0,22 μm.
- Meio de Indução de Diferenciação (DIM)
- Preparar DIM usando DMEM-F12 Meio Basal suplementado com 10% de Reposição de Soro Nocaute (KOSR), 1x Aminoácidos Não Essenciais (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U/mL de Penicilina-Estreptomicina, 200 μM de ácido L-Ascórbico e 1% de suplemento de N2 (ver Tabela de Materiais).
- Meio de Diferenciação Retiniana (RDM)
- Preparar RDM usando DMEM-F12 Meio Basal suplementado com 10% de Knockout Serum (KOSR), 1x Aminoácidos Não Essenciais (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U/mL de Penicilina-Estreptomicina, 200 μM de ácido L-Ascórbico e 2% de suplemento B27 (com vitamina A) (ver Tabela de Materiais).
- Superfícies de cultura celular revestidas com matriz extracelular
- Descongele a matriz da membrana basal qualificada para hESC durante a noite em um balde de gelo, de preferência dentro de uma geladeira a 4-8 °C. Diluir o estoque de matriz descongelado de 100x (5 mL) na proporção de 1:5 adicionando 20 mL de meio basal DMEM-F12 gelado e misturar por turbilhão suave para preparar uma solução-mãe de 20x.
- Preparar alíquotas de 0,5 mL sobre gelo usando pontas de pipeta pré-resfriadas e tubos de microcentrífuga estéreis. Rotule os frascos como estoques de 20x e armazene-os congelados em um freezer de -80 °C por até 6 meses.
- Para o revestimento das superfícies de cultura celular (placas de cultura ou placas de 6 poços), descongelar uma alíquota de matriz de 20x sobre gelo e diluí-la na proporção de 1:20 usando meio basal DMEM-F12 gelado para preparar 10 mL de solução de revestimento de matriz 1x, o que é suficiente para revestir uma placa de 100 mm ou uma placa de 6 poços (1,5 mL/poço).
NOTA: Pré-resfriar as pipetas/micropontas aspirando DPBS geladas e estéreis antes de manusear a solução matricial. O descongelamento e todo o manuseio da matriz devem ser feitos em gelo, utilizando-se pipetas/micropontas pré-resfriadas para evitar polimerização e gelificação em temperatura ambiente. - Adicione 1,5 mL de solução de revestimento de matriz 1x a cada poço de uma placa de 6 poços, gire suavemente a placa para garantir um revestimento uniforme e incube as placas a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5%. Deixar as placas intactas por um mínimo de 1 h para garantir um revestimento uniforme da matriz nas superfícies de cultura.
- Antes de semear as células, aspirar a solução de revestimento usando uma pipeta estéril de 5 mL e descartar os resíduos líquidos. Adicionar imediatamente o meio de cultura fresco (2 mL/poço de uma placa de 6 poços) e semear as células a uma densidade de 150.000-200.000 células/poço. Não deixe as placas secarem durante o manuseio.
NOTA: Alternativamente, o revestimento de vitronectina recombinante (VTN-N) em uma concentração final de 0,5 μg/mL pode ser usado para um protocolo de cultura livre de xeno.
- Descongele a matriz da membrana basal qualificada para hESC durante a noite em um balde de gelo, de preferência dentro de uma geladeira a 4-8 °C. Diluir o estoque de matriz descongelado de 100x (5 mL) na proporção de 1:5 adicionando 20 mL de meio basal DMEM-F12 gelado e misturar por turbilhão suave para preparar uma solução-mãe de 20x.
2. Estabelecimento de culturas iPSC humanas
- Descongelamento e renascimento de hiPSCs
- Revestir um poço de uma placa de 6 poços com solução de matriz de membrana 1x. Incubar a 37 °C durante 1 h para permitir a polimerização e o revestimento uniforme da superfície de cultura.
- Após 1 h de incubação, remova a solução de revestimento e adicione 1 mL de meio Essential 8 completo pré-aquecido contendo 10 μM de inibidor de Rho-quinase, Y-27632 (1 μL/mL de estoque de 10 mM; ver Tabela de Materiais), antes de reviver as células.
- Remova um estoque criovial hiPSC (1 x 106 células/frasco para injetáveis) do recipiente de nitrogênio líquido. Descongelar rapidamente o criovial em banho-maria a 37 °C com um redemoinho suave.
NOTA: Não descongele completamente o frasco para injetáveis; Anote o número da passagem, esterilize o frasco para injetáveis e limpe-o com um cotonete sem fiapos contendo álcool isopropílico a 70%. - Usando uma ponteira de pipeta estéril de 1 mL, aspirar o conteúdo criovial em um tubo fresco de 15 mL composto por 2 mL de meio Essential 8 completo pré-aquecido sem Y-27632. Centrifugar o tubo a 1.000 x g por 4 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet celular em 1,0 mL de meio Essential 8 completo contendo 10 μM Y-27632.
- Adicione esta suspensão celular nas superfícies revestidas de matriz sem perturbar a matriz, distribuindo-a ao longo das paredes. Balançar a placa suavemente transversalmente para garantir a distribuição uniforme das células.
- Incubar as placas a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2 para permitir que as células adiram e comecem a proliferar.
- Após 12-24 h, substitua o meio gasto e mantenha as culturas em meio Essential 8 completo pré-aquecido sem Y-27632.
- Troque o meio de cultura a cada 24 h e passe pelas culturas quando elas atingirem 70%-80% de confluência.
NOTA: Uma proporção dividida de 1:6 é rotineiramente seguida para culturas hiPSC e é passada em intervalos regulares de 3-4 dias.
- Passaging e plaqueamento de hiPSCs para iniciar a diferenciação da linhagem retiniana
- Aspirar o meio gasto de 70%-80% de culturas humanas iPSC confluentes em placas de 6 poços.
- Adicionar 1 ml de CDS (passo 1.2) a cada poço e incubar a 37 °C durante 5-7 min até que as células se arredondam. Retire cuidadosamente o CDS, tomando cuidado para não desprender as células, e adicione 2 mL de meio fresco Essential 8 e triture suavemente usando uma pipeta.
- Recolher a suspensão celular de um poço de uma placa de 6 células num tubo de centrífuga de 15 ml e girar o tubo a 1.000 x g durante 4 minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet de células em 1,2 mL de meio Essential 8 e dispensar 200 μL da célula 200 μL da suspensão celular (proporção dividida 1:6) em cada poço de uma placa de 6 poços revestida com matriz contendo 1,5 mL de meio de cultura iPSC contendo 10 μM Y-27632, conforme descrito na etapa 1.5.
- Após 12-24 h, substitua o meio gasto e mantenha as culturas em meio Essential 8 completo pré-aquecido sem Y-27632.
- Troque o meio de cultura a cada 24 h até que as culturas atinjam 70%-80% de confluência.
3. Diferenciação das hiPSCs em campos oculares e linhagem retiniana
NOTA: Um esboço esquemático do processo de diferenciação é mostrado na Figura 1.
- Iniciar o procedimento de diferenciação quando as culturas de hiPSC atingirem 70%-80% de confluência.
- No dia 0, trocar o meio de manutenção hiPSC para DIM (passo 1.3) contendo 1 ng/mL de bFGF e 1 ng/mL de Noggin. Adicionar 2,0 mL de meio por poço de uma placa de 6 poços e manter as células a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5%.
NOTA: A retirada gradual do bFGF induz a diferenciação das LSPs, e a adição de concentrações crescentes de Noggin (inibidor de várias BMPs) durante os estágios iniciais induz diferenciação e neuralização da linhagem ectodérmica11,12 e bloqueia o comprometimento do mesoderma e endoderma. Alternativamente, Noggin pode ser substituído por LDN193189. Ao contrário da estratégia de inibição dupla da SMAD relatada anteriormente20,21, este protocolo não requer a adição de Activin ou SB-431542. - No dia 1, trocar o meio gasto e adicionar DIM contendo 1 ng/mL de bFGF e 10 ng/mL de Noggin. Adicionar 2,0 mL por poço de uma placa de 6 poços. Incubar e manter as células a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5%.
- No dia 2-3, remova o meio gasto e adicione DIM contendo apenas 10 ng/mL Noggin. Adicionar 2,0 mL por poço de uma placa de 6 poços e trocar o meio a cada 24 h. Incubar e manter as células a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5%.
NOTA: Pré-aqueça sempre o meio de cultura a 30-37 °C antes de usar. Excesso de moscas volantes e células mortas podem ser observados em culturas de diferenciação precoce. Nessas condições, lavar as culturas uma vez com 1x DPBS e adicionar o meio de diferenciação retiniana. Os testes de esterilidade no meio gasto podem ser feitos semanalmente ou conforme a necessidade. - No dia 4, remova o meio gasto e adicione o RDM (etapa 1.4). Adicionar 2,0 mL por poço de uma placa de 6 poços e continuar a manter as culturas em RDM a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5%, com uma troca de meio fresco a cada dia.
NOTA : Alternadamente, as PSCs podem ser cultivadas como culturas de suspensão do dia 1-3, em placas de 96 poços não aderentes e de fundo redondo, a uma densidade celular de 5 x 103 células/100 μL/poço para formar corpos embrionários (EBs) sob condições de cultura idênticas em DIM. EBs bem formados no dia 4 podem ser plaqueados em placas revestidas de matriz contendo RDM e podem aderir, proliferar e diferenciar conforme descrito abaixo. - Por volta dos 14 e 18 dias, observar as culturas ao microscópio com aumento de 10x para a emergência de domínios neurais semelhantes a rosetas constituídos por progenitores de campo ocular precoce (Figura 2B).
- Por volta dos 21-28 dias (3-4 semanas), observar culturas ao microscópio com aumentos de 4x e 10x para observar a emergência de PFE distintas e auto-organizadas, com uma ilha central de estruturas neurorretinianas circulares 3D circundadas por crescimentos contíguos do neuroepitélio e do epitélio da superfície ocular (Figura 2C,D).
NOTA: Cerca de 20-30 PFE podem ser observadas por poço de uma placa de 6 poços de uma cultura de diferenciação retiniana hiPSC normal. Esse número pode variar com outras linhagens de hiPSC específicas da doença, com base em seu background genético e potencial de diferenciação da linhagem retiniana.
4. Colheita de organoides da retina
- Puxador de chama de pipetas de vidro Pasteur para separação manual de copos de retina.
NOTA: Use pipetas de vidro Pasteur autoclavadas e estéreis para a coleta de campo ocular.- Ligue um queimador de Bunsen. Pegue uma pipeta Pasteur estéril e segure a base em uma mão e a ponta capilar na outra. Esterilizar a chama e aquecer a região próxima ao meio da ponta capilar, com movimentos rotacionais até que o vidro fique maleável. Em seguida, afaste-se da chama e puxe para fora rapidamente para criar uma ponta capilar fina com um lúmen fechado.
- Segure a ponta fina horizontalmente na frente da chama e passe-a rapidamente através da chama em um movimento para fora para criar um gancho liso ou uma ponta capilar em forma de L.
- Use a zona de curvatura externa lisa do gancho capilar como uma colher fina para levantar e separar suavemente os copos neurorretinários intactos dos clusters EFP.
NOTA: O ângulo liso do gancho capilar de vidro não causa danos às células nem cria arranhões nas superfícies de cultura. Esta ferramenta simples também pode ser efetivamente usada para a divisão de colônias hiPSC individuais em padrões de grade e para passá-las como pequenos agrupamentos de células durante a expansão clonal.
- Cultura e manutenção de copos de retina para gerar organoides 3D da retina.
- No dia 25-30, adicionar 4,0 mL de meio de diferenciação retiniana pré-aquecido em uma placa de 60 mm de baixa fixação antes de se preparar para a colheita de copos neurorretinários.
- Trabalhe sob um microscópio estéreo em aumento de 0,63x-4,5x para observar e escolher manualmente copos neurorretinários bem formados de EFPs individuais.
NOTA: O aparecimento de crescimentos de células de EPR pigmentadas ajuda na fácil identificação de EFPs e dos copos neuro-retinais colocados centralmente. As taças retinianas aparecem como estruturas 3D em forma de rosca, circulares e translúcidas, com estrias radiais claras, formadas pelas células-tronco retinianas linearmente dispostas e auto-organizadas, em oposição aos aglomerados esféricos ou irregulares formados pelos neurônios do SNC ou pelas células da crista neural23. - Use os ganchos de pipeta de pastagem puxados pela chama para cutucar suavemente e retirar a ilha neurorretiniana central dentro de EFPs individuais.
- Colocar uma micropipeta de 1 mL para aspirar 100 μL e usar micropontas de 1 mL com aberturas largas para aspirar e transferir os copos flutuantes da retina para os pratos de cultura frescos e de baixa aderência preparados na etapa 4.2.1.
NOTA: Usar pontas com um tamanho de furo menor e maior pressão de sucção pode causar cisalhamento e afetar a integridade dos copos da retina. As dimensões aproximadas dos copos da retina são de cerca de 1-2 mm de diâmetro. - Manter os copos retinianos em RDM como culturas de suspensão não aderentes e incubá-los a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2 .
- Dia 30-45: Troque o meio diariamente, inclinando suavemente o prato e deixando os copos da retina se acomodarem por cerca de 30 s. Siga um método de alimentação parcial, removendo metade dos volumes do meio gasto e substituindo por volumes iguais de meio fresco.
NOTA: Evite aspirações e transferências repetidas para evitar qualquer dano aos copos da retina. Após 1-2 semanas de cultura da suspensão, as taças retinianas crescem ligeiramente de tamanho (1-3 mm) e evoluem para organoides 3D retinianas auto-organizados (OC-1M) compostos por progenitores neurorretinianos precoces linearmente arranjados expressando PAX6 e CHX10 (Figura 3Bi). - Dia 45-60: Cultura dos organoides da retina por mais 4 semanas em RDM contendo 100 μM de Taurina (ver Tabela de Materiais) para apoiar melhor sobrevivência e diferenciação de linhagem de progenitores neuro-retinianos e o desenvolvimento do tipo de célula retiniana madura (OC-2M).
NOTA: Cerca de 70%-80% dos copos retinais ou ópticos colhidos de EFPs permanecem intactos, mantêm sua laminação e evoluem para organoides retinianos maduros após 4 semanas de cultura de suspensão (OC-2M). - Verificar se os organoides retinianos maduros com 4 semanas de cultura em suspensão mostram a emergência de precursores de fotorreceptores RCVRN+ e CRX+ e células maduras com uma extensão rudimentar semelhante a um segmento interno nas camadas celulares mais externas, recapitulando o processo normal de desenvolvimento e maturação da retina in vitro (Figura 3Bii).
NOTA: Após a remoção dos copos neuro-retinianos, as culturas de diferenciação podem ser mantidas continuamente em RDM. Os crescimentos epiteliais proximais ao redor da neuro-retina contêm precursores de células epiteliais pigmentadas da retina (EPR), que se expandem e amadurecem para formar monocamadas pigmentadas de EPR com morfologia típica de paralelepípedos (Figura 4). Os crescimentos distais consistem predominantemente de epitélio da superfície ocular que contribui para o cristalino eepitélio corneano.Os tipos celulares desejados podem ser colhidos de diferentes zonas de excrescências de EFP e enriquecidos ainda mais para estabelecer culturas puras.
5. Caracterização dos organoides da retina
- Caracterização morfológica e molecular
- Observar as PFE aderentes e os organoides flutuantes da retina em microscópio de contraste de fase em aumentos de 4x e 10x e documentar sua morfologia e dimensões.
- Coletar cerca de 20 organoides da retina em diferentes estágios de maturação (passos 4.2.3-4.2.6) em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL usando pontas de furo largo de 1.000 μL. Deixe os organoides se acomodarem no fundo e aspirar o meio. Lave os copos com 1x PBS.
- Remova o excesso de PBS e adicione 1,0 ml de reagente TRIzol (ver Tabela de Materiais). Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Homogeneizar o tecido com pilão tubular e triturar com pipeta de 1,0 mL.
- Prepare o RNA total seguindo o método padrão de isolamento e purificação do RNA, de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
- Verifique a qualidade do RNA no gel de agarose e quantifique-o usando o espectrofotômetro NanoDrop (ver Tabela de Materiais).
- Converter 1-2 μg de RNA total em cDNA usando a enzima transcriptase reversa de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Consulte a Tabela 1 para obter uma lista de primers específicos para genes.
- Resumidamente, preparar a mistura mestre RNA-primer em 10 μL de volume total, conforme mencionado na Tabela 2 , e incubar o tubo a 65 °C por 5 min em um termociclador. Transfira o tubo do termociclador para o gelo por 2 min.
- Enquanto isso, prepare a mistura master 2 com os reagentes mencionados na Tabela 3. Adicionar esta mistura mestra ao tubo de mistura RNA-primer preparado na etapa 5.1.7. Misture delicadamente.
- Incubar a amostra a 50 °C durante 50 min, depois 85 °C durante 5 min e, em seguida, segurar a 4 °C para parar a reacção.
- Use o cDNA sintetizado como molde em reações de PCR para verificar a expressão de progenitores neuro-retinianos e marcadores de células maduras da retina.
- Normalizar os modelos totais de cDNA de cada amostra, ou seja, F2-UD (hiPSC-F2-3F1; células indiferenciadas), OC-1M (copo óptico de 1 semana em cultura de suspensão) e OC-2M (copo óptico de 4 semanas em cultura de suspensão) por PCR semiquantitativo usando os genes housekeeping como hE1fα ou GAPDH.
- Preparar a mistura mestra para PCR semi-quantitativo, conforme mencionado na Tabela 4, e colocar os tubos de amostra de ensaio para amplificação em um termociclador. As condições de amplificação da PCR estão mencionadas na Tabela 5.
- Histologia e imuno-histoquímica
- Recolher as taças ópticas num tubo de microcentrífuga de 2,0 ml e aspirar o meio em excesso (passos 4.2.3-4.2.6). Enxaguar os organoides com 1x PBS e, em seguida, lavá-los e suspendê-los em 500 μL de Paraformaldeído a 4% para fixá-los durante a noite à temperatura ambiente.
- No dia seguinte, lave os copos em água deionizada. Deixe os copos repousarem em álcool 95% (três trocas, 15-20 min cada), seguido de álcool 100% (três trocas, 15-20 min cada), uma mistura 1:1 de álcool absoluto e xileno por 15 min, xileno (duas trocas, 15 min cada) e parafina (três trocas, 15 min cada). Incorpore este tecido para preparar um bloco de parafina seguindo os procedimentos padrão. Deixe esfriar e solidificar.
- Prepare seções finas (~4-5 μm de espessura) usando um micrótomo e coloque-as em lâminas microscópicas revestidas de silano (ver Tabela de Materiais) seguindo os procedimentos histológicos padrão.
- Para desparafinização, aqueça as lâminas a 70 °C em um bloco de aquecimento por 15-20 min. Uma vez que a cera derrete, lave as lâminas com xileno (três mudanças, 3-4 min cada), que removerá a parafina completamente.
NOTA: A remoção incompleta da parafina resulta em coloração pobre/irregular das seções com uma enorme quantidade de ruído de fundo. - Hidratar novamente as lâminas com diferentes porcentagens de etanol (100%, 90% e 80%) por 3 min cada. Enxaguar as lâminas com água destilada e proceder à recuperação do antígeno.
- Antes de iniciar a recuperação do antigénio, pré-aqueça o tampão citrato (pH 6,0) num frasco Coplin (ver Tabela de Materiais) utilizando um forno de micro-ondas até atingir 95-100 °C.
- Mergulhe as lâminas em tampão citrato pré-aquecido e aqueça o frasco por 15 minutos em um forno de micro-ondas. Retire o frasco Coplin do forno e deixe arrefecer à temperatura ambiente.
- Bloquear as secções para peroxidase endógena adicionando uma mistura 1:1 de metanol e peróxido de hidrogénio durante 5 min, seguida de lavar as secções três vezes com 1x PBS.
- Permeabilizar os cortes usando Triton-X 100 0,5% por 15 min. Lave as lâminas três vezes com 1x PBS.
- Bloquear a ligação inespecífica do anticorpo primário incubando os cortes com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) em 1x PBS por 1 h.
- Incubar as secções com anticorpo primário durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C. Lave as lâminas três vezes com 1x PBS por 3-5 min cada para remover o anticorpo não ligado.
- Adicionar o anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente adequado e incubar por 45 min. Lave as lâminas três vezes com 1x PBS por 3-5 min cada.
NOTA: Os anticorpos e suas respectivas diluições são mencionados na Tabela de Materiais. Os cortes organoides da retina foram imunomarcados usando PAX6 e CHX10 para detectar células precursoras neuro-retinianas precoces, e usando Recoverin e CRX para detectar células precursoras retinianas e fotorreceptoras comprometidas. Da mesma forma, anti-PAX6 e anti-MITF foram usados para detectar precursores de EPR, e anti-CRALBP e anti-RPE65 foram usados para detectar células maduras pigmentadas de EPR por imunocitoquímica de culturas de monocamada 2D. - Contra-manchar as seções com DAPI ou PI e montá-las em uma lâmina de vidro usando o meio de montagem antifade (consulte a Tabela de Materiais).
- Imageie e documente os cortes imunomarcados de organoides da retina e culturas de EPR usando um microscópio de varredura a laser confocal ou de fluorescência para examinar diferentes camadas celulares expressando diferentes marcadores da retina.
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Representative Results
A diferenciação das hiPSCs em linhagens oculares é obtida pela cultura das células em diferentes coquetéis de meio de cultura contendo suplementos e fatores de crescimento em etapas sequenciais em diferentes momentos, conforme descrito na Figura 1. As culturas de hiPSC são mantidas em meio Essential 8, o meio de manutenção de células-tronco pluripotentes. Uma vez que atinjam 70%-80% de confluência (Figura 2A), o meio é substituído por Meio de Indução de Diferenciação (DIM) no dia 0 (ver passo 3.2) contendo 1 ng/mL de bFGF, 1 ng/mL de Noggin e 1% de suplemento de N2. Juntamente com o suplemento N2 indutor neural, Noggin, o inibidor da sinalização BMP, desempenha um papel crucial no direcionamento das células para a linhagem neuroectodérmica, bloqueando o comprometimento mesodérmico e endodérmico. No 1º, 2º e 3ºdia, a concentração de Noggin é aumentada para 10 ng/mL (consulte os passos 3.3 e 3.4). A partir do 4ºdia, o DIM é substituído por Meio de Diferenciação da Retina (RDM) (passo 3.5), e as culturas são mantidas continuamente por até 30 dias. O B27 no coquetel RDM contém suplementos adicionais, como múltiplos antioxidantes e D-Galactose, que promove o metabolismo aeróbico e ajuda na redução do estresse oxidativo, melhorando a viabilidade de diferenciar células progenitoras. Além disso, a presença de acetato de retinol (vitamina A) e hormônios de crescimento como triiodo-I-tireonina (T3) promove diferenciação de linhagens neurais e retinianas.
No 14ºao 18ºdia, observa-se a formação de rosetas neurais, que marca o início do comprometimento do campo ocular (Figura 2B). Os precursores do campo ocular dentro das rosetas neurais proliferam e se auto-organizam em grupos primordiais de campo ocular (EFPs) distintos com estruturas neuro-retinianas circulares no centro. Outros tipos celulares, como o epitélio pigmentado da retina (EPR), o epitélio da crista neural e aqueles que contribuem para a superfície ocular, emergem e migram como epitélio contíguo com margens bem definidas. Campos oculares bem formados, como descrito acima, podem ser observados entre o 21ºe o 28ºdia de diferenciação (Figura 2C,D). As taças neurorretinianas da ilha central são colhidas entre os dias 25-30 usando uma pipeta de vidro Pasteur puxada pela chama (Figura 2E) e são mantidas como culturas em suspensão não aderentes em RDM por mais 1-2 semanas, até o dia 45. Os progenitores retinianos em proliferação ainda se auto-organizam para formar organoides retinianas 3D multicamadas de cerca de 2-3 mm de diâmetro (Figura 2F,G). A partir do 46º dia, o RDM é suplementado com 100 μM de Taurina para promover a neurogênese e melhorar a sobrevivência celular em culturas de organoides de longa duração in vitro (Figura 2H).
Os organoides da retina são caracterizados em diferentes estágios de maturação pela expressão de vários marcadores progenitores da retina usando transcrição reversa PCR (RT-PCR) e imunohistoquímica (IHQ). Para isso, os organoides são colhidos para isolamento do RNA total no 30ºe 60º dia de diferenciação. Os resultados da RT-PCR confirmaram a indução e expressão de marcadores neuro-retinianos como NEUROD1, ChX10, CRX, PKCß1, RLBP1, RHOK, OPN1SW, RCVRN, ABCA4, RD3 e PDE6C em organoides retinianos de 1 semana de idade (4-5 semanas após a diferenciação, OC-1M) e organoides retinianos de 4 semanas 8,12 (7-8 semanas após a diferenciação, OC-2M) (Figura 3A). A imuno-histoquímica e a imagem por fluorescência confirmaram a expressão dos marcadores progenitores retinianos precoces PAX6, CHX10 e OTX2 em OC-1M e dos marcadores retinianas maduros RCVRN e CRX em OC-2M 8,12 (Figura 3Bi,ii).
Além das taças neurorretinianas centrais, os outros tipos de células oculares, como o epitélio pigmentado da retina (EPR), o epitélio da crista neural e as células epiteliais da superfície ocular, emergem e migram para fora das PFEs. Os progenitores de EPR derivados do neuroectodérmico aparecem como células epiteliais compactamente dispostas ao redor das PFEs, que gradualmente amadurecem e se pigmentam ao longo das margens migratórias a partir do 30-45º dia (Figura 4A-C). Essas culturas de diferenciação aderentes, após a remoção das taças retinianas, podem, portanto, ser estendidas até o 45º dia, para colher precursores de EPR em proliferação (Figura 4D), que podem ser enriquecidos para preparar culturas de monocamada de células pigmentadas de EPR totalmente maduras. O EPR pigmentado maduro pode ser visto como monocamadas com morfologia típica de paralelepípedo (Figura 4E). A identidade da célula do EPR é confirmada pela imunocitoquímica usando anticorpos contra marcadores específicos do EPR, como MITF (marcador progenitor do EPR), PAX6 (progenitor e marcador do EPR maduro) e RPE65 (marcador do EPR maduro)10,12 (Figura 4F-H).
Organoides da retina pluripotentes derivados de células-tronco podem, assim, servir como modelos in vitro para o estudo de várias doenças hereditárias da retina 7,8,9. Modelos de células-tronco doença-específicas são desenvolvidos gerando linhagens iPSC específicas do paciente ou introduzindo mutações doença-específicas em linhagens iPSC de controle saudáveis usando a abordagem de edição gênica baseada em CRISPR 7,8. As iPSCs mutantes podem ou não se diferenciar eficientemente em tipos celulares da retina, dependendo das mutações gênicas envolvidas. Embora a maioria das linhagens celulares controle saudáveis tenha seguido a linha do tempo descrita acima, pode haver desvios no caso de iPSCs específicas da doença em termos de linhas do tempo de diferenciação, morfologia do EFP, tamanho do copo da retina, laminação e maturação. O potencial de diferenciação retiniana de uma linhagem RB1-/- hiPSC (LVIP15-RB1-CS3) que carrega uma deleção bialélica de 10 pb dentro do éxon 18 do gene RB1 humano foi examinado, o que resulta em um frameshift e perda completa da expressão da proteína RB1. Observou-se que a perda da expressão de RB1 não afetou o olho e a diferenciação precoce da linhagem retiniana da linhagem mutante hiPSC. No entanto, observou-se um atraso acentuado nos prazos e uma redução na eficiência de formação de EFP. As PFE atípicas que emergiram tinham agregados anormais de progenitores da retina que não conseguiam laminar e se auto-organizar em copos retinianos adequados (Figura 5A,B) ou não possuíam a zona circundante de PSE e epitélio da superfície ocular (OSE) (Figura 5C). Quando colhidos e mantidos como culturas de suspensão, esses agrupamentos de progenitores da retina formaram agregados neurorretinianos irregulares (Figura 5D).
Figura 1: Linha do tempo representando a diferenciação das iPSCs em organoides da retina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Geração de organoides 3D da retina auto-organizados. (A) Culturas de hiPSCs em crescimento em condições de alimentação livre. (B) Desenvolvimento de rosetas neuronais no 14º dia de diferenciação (asterisco). (C,D) Aglomerados primordiais do campo ocular (PFE) contendo uma estrutura central em forma de taça neurorretiniana (setas pretas) circundada pela zona migratória do epitélio (setas brancas) no dia 21-28 de diferenciação. (E) Pipeta de vidro Pasteur puxada pela chama com ponta presa. A curva lisa na região da dobradiça é usada para cutucar e levantar os copos da retina (seta). (F,G) Copos retinais colhidos aos 25 dias e cultivados sob suspensão para gerar organoides 3D retinianos auto-organizados. (H) Organoides retinianos maduros em cultura de suspensão aos 45 dias. Barras de escala: 100 μm (A,B,D,G); 200 μm (C,F,H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Caracterização dos organoides da retina. (A) Perfil de expressão gênica retiniana por RT-PCR da linhagem23 de hiPSC normal indiferenciada (hiPSC-F2-3F1) (F2-UD) e das copas ópticas normais diferenciadas colhidas em 3-4 semanas de diferenciação e amadurecidas em cultura de suspensão por 1 semana (OC-1M) e 4 semanas (OC-2M), respectivamente. Os cDNAs de todas as amostras teste foram normalizados usando eEF1a como controle de carga. (B) Imagens confocais de cortes imunomarcados de (i) organoides imaturos da retina (OC-1M) usando anticorpos contra os marcadores progenitores neuro-retinianos CHX10, PAX6 e OTX2 (em vermelho) e (ii) organoides maduros da retina (OC-2M) usando anticorpos contra os marcadores precursores de fotorreceptores Recoverin e CRX (em vermelho). A camada mais externa marcada dos organoides da retina com células fotorreceptoras diferenciadoras (caixa) nos painéis esquerdos são ampliadas e mostradas nos painéis direitos. DAPI foi utilizado como contracoloração (em azul). As extensões rudimentares em forma de segmento interno são marcadas por setas brancas. Barra de escala: 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Surgimento dos diferentes tipos de células oculares. (A) Agrupamento de PFE com a taça neurorretiniana no centro e crescimentos migratórios de EPR mostrando pigmentação ao longo das bordas de ataque (seta branca). (B) Crescimentos epiteliais pigmentados bem diferenciados de múltiplas PFEs ao redor da ilha neurorretiniana. (C) A maior magnificação de um PFE mostra a zona migratória dos progenitores do EPR (seta branca) e do epitélio da superfície ocular (asterisco) ao redor de uma taça neurorretiniana. (D) Culturas aderentes estendidas que desenvolveram monocamadas de células imaturas de EPR contendo células pigmentadas e não pigmentadas. (E) Culturas de monocamadas de células RPE totalmente maduras e pigmentadas mostrando morfologia de paralelepípedos aos 60 dias. (F-H) Células RPE expressando PAX6, MITF e RPE65 em verde. Barra de escala: 200 μm (A,B); 100 μm (C-E); 20 μm (F-H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Formação anormal de taças retinianas em iPSCs mutantes RB1-/- (A,B) com agregados anormais de progenitores retinianos com laminação distorcida e ausência de estriações. (C) PFE com a taça neurorretiniana em miniatura, mas sem a zona circundante de EPR e epitélio da superfície ocular (seta). (D) Agregados neurorretinianos irregulares formados em cultura em suspensão. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome da cartilha | Sequência primo (5'-3') | Tamanho da banda (pb) | Ref Id | |||
| 1 | heFE1α | F: GAAGTCTGGTGATGCTGCCATTGT | 198 | NM_001402 | ||
| R: TTCTGAGCTTTCTGGGCAGACTTG | ||||||
| 2 | hNeuroD1 | F: CGCGCTTAGCATCACTAACT | 349 | NM_002500 | ||
| R: GCGTCTCTTGGGCTTTTGAT | ||||||
| 3 | hCHX10 | F: CAAGTCAGCCAAGGATGGCA | 382 | NM_182894 | ||
| R: CTTGACCTAAGCCATGTCCT | ||||||
| 4 | hCRX | F: TCAACGCCTTGGCCCTAAGT | 357 | NM_000554 | ||
| R: ACACATCTGTGGAGGGTCTT | ||||||
| 5 | hPKC-β1 | F: AAAGGCAGCTTTGGCAAGGT | 376 | NM_212535 | ||
| R: CGAGCATCACGTTGTCAAGT | ||||||
| 6 | RLBP1 | F: TGCACCATTGAAGCTGGCTCTA | 361 | NM_000326 | ||
| R: AGAAGGGCTTGACCACATTG | ||||||
| 7 | RHOK | F: CAAGCTGTATGCCTGCAAGA | 360 | NM_002929 | ||
| R: ATCCGGACATTGCCGTCATT | ||||||
| 8 | hOPN1SW | F: TGCTTCATTGTGCCTCTCTC | 373 | NM_001708 | ||
| R: AGCTGCATGTGTCGGATTCA | ||||||
| 9 | RCVRN | F: AGACCAACCAGAAGCTGGAGT | 367 | NM_002903 | ||
| R: ACGGGTGTCATGTGAGTGGTA | ||||||
| 10 | hABCA4 | F: CACCGTAGCAGGCAAGAGTATT | 271 | NG_009073 | ||
| R: AATGAGTGCGATGGCTGTGGAGA | ||||||
| 11 | hRD3 | F: ATGGTGCTGGAGACGCTTAT | 328 | NM_183059 | ||
| R: CTTCCTGCTTCATCCTCTCCA | ||||||
| 12 | hPDE6C | F: GTTGATGCCTGTGAACAAATGC | 351 | NM_006204 | ||
| R: ACCACTCAGCATAGGTGTGAT | ||||||
Tabela 1: Lista de iniciadores gene-específicos para RT-PCR.
| Componentes para mistura RNA-Primer | Volume (em μL) |
| RNA (1-2 μg) | n |
| 10 mM dNTP | 1 |
| 10 mM Oligo dT | 1 |
| Água tratada com DEPC | até 10 |
| Volume Total de Reação | 10 |
Tabela 2: Mistura mestre RNA-primer para conversão de cDNA.
| Componentes para Mastermix 2 | Volume (em μL) |
| Buffer RT 10x | 2 |
| 25 mM MgCl2 | 4 |
| 0,1 M TDT | 2 |
| SuperScript III Transcriptase Reversa | 1 |
| RNaseOUT | 1 |
| Volume Total de Reação | 10 |
Tabela 3: Master mix 2 para conversão de cDNA.
| Componentes do PCR | Volume (em μL)/reação |
| 10x Buffer PCR | 2 |
| 2 mM dNTP | 2 |
| Primer para a frente (5 μM) | 1 |
| Primer reverso (5 μM) | 1 |
| Taq Polimerase | 0.2 |
| Modelo de cDNA (50-100 ng) | 1 |
| Água Milli-Q estéril | 12.8 |
| Volume Total de Reação | 20 |
Tabela 4: Master mix para PCR semiquantitativo.
| Temperatura | Hora | Nº de ciclos | |
| Desnaturação | 95 °C | 5 minutos | x 1 |
| Desnaturação | 95 °C | Anos 30 | x 35 |
| Recozimento | 50-60 °C | Anos 30 | |
| Extensão | 72 °C | Anos 30 | |
| Extensão Final | 72 °C | 10 minutos | x 1 |
Tabela 5: Condições de amplificação da PCR.
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Discussion
hiPSCs são uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento de órgãos e tecidos in vitro. Recapitular o fenótipo da doença diferenciando hiPSCs saudáveis versus doença-específicas em direção à linhagem retiniana pode ajudar a obter novos conhecimentos sobre a fisiopatologia de diferentes formas de distrofias hereditárias da retina. Vários protocolos têm sido descritos e adotados para a diferenciação in vitro de CTPs em tipos celulares da retina. A maioria deles envolve o uso de meio de cultura contendo coquetéis complexos de fatores de crescimento recombinantes, suplementos, pequenas moléculas e reagentes, tais como: suplementos N1, N2 e B27; BMP e TGFβ bloqueadores de sinalização como Noggin, SB431542, LDN193189 e Follistatin, ou indutores como Activin A, Lefty e IDE1; bloqueadores canônicos de sinalização Wnt, como DKK1, SFRP, IWP-2 e IWR-1-endo, ou indutores como CHIR99021, SB216763 e CKI-7; bloqueadores de sinalização do receptor do FGF como PD0325901 e PD173074 ou indutores como bFGF; inibidores de sinalização de entalhe, como DAPT; outras moléculas sinalizadoras, como o fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1); ácido retinóico; hormônios de crescimento como Triiodotironina (T3) e Hidrocortisona; e antioxidantes e outros fatores pró-sobrevivência, como ácido ascórbico, nicotinamida, taurina, ácido docosahexaenóico, 1-tioglicerol, etc. Esses componentes são incluídos no meio de cultura em diferentes estágios de diferenciação de células-tronco para estimular ou modular várias cascatas de sinalização para induzir o comprometimento de linhagens oculares e retinianas11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22.
Aqui, um método mais simples, robusto e eficiente de gerar organoides da retina diretamente a partir de culturas aderentes e quase confluentes de hiPSCs é descrito. O protocolo simplificado envolve o uso de menos suplementos, fatores de crescimento e pequenas moléculas que desencadeiam primariamente a diferenciação inicial das PSCs na linhagem neuroectodérmica. As etapas subsequentes de diferenciação dependem da capacidade inerente das PSCs de se diferenciarem sincronicamente no tipo celular de linhagens relacionadas, que então se auto-organizam e regulam mutuamente o desenvolvimento e a organização espacial de vários tipos celulares que contribuem para a formação de tecidos complexos. A retirada gradual do bFGF e a adição de Noggin ajudam na indução bem-sucedida do comprometimento precoce do destino neuroectodérmico dentro de 3 dias após a diferenciação. A manutenção contínua de culturas de diferenciação em RDM indutora de neurais, sem adição de fatores de crescimento ou pequenas moléculas, resulta na indução de estruturas primordiais do campo ocular (EFP) com margens claras, dentro de 3-4 semanas da diferenciação. As PFEs contêm células progenitoras multipotentes que, após manutenção contínua e não perturbada, resultam em diferenciação de múltiplas linhagens e automontagem para formar PFEs complexas que consistem em taças neurorretinianas ou copos ópticos (COs) posicionados centralmente, cercados por outros tipos de células oculares relacionadas, como o epitélio pigmentado da retina (EPR), o epitélio da crista neural e o epitélio da superfície ocular. Alternativamente, as LSPs podem ser cultivadas como culturas de suspensão do dia 1-3 para formar EBs sob condições de cultura idênticas. As EBs podem ser plaqueadas no 4º dia e cultivadas como culturas aderentes em superfícies revestidas de matriz em RDM para iniciar a diferenciação da linhagem retiniana, como descrito acima. Culturas diferenciadoras saudáveis rotineiramente dão origem a cerca de 20-30 EFPs por poço de uma placa de 6 poços. Os COs podem ser colhidos dos PFEs em 3-4 semanas de diferenciação retiniana e mantidos em culturas de suspensão por mais 30-60 dias, para permitir a diferenciação de progenitores neuro-retinianos e gerar organoides retinianos maduros. Após 4 semanas de cultura de suspensão, cerca de 70%-80% das taças ópticas colhidas de EFPs permanecem intactas, mantêm sua laminação e se desenvolvem em organoides retinianas maduros (OC-2M), com células fotorreceptoras comprometidas com RCVRN+ e CRX+ e extensões segmentares internas dentro das camadas mais externas.
A confluência de culturas iPSC crescentes é crítica no momento do início da diferenciação e deslocamento das culturas para DIM. Culturas com colônias menores e confluência abaixo de 60%, e aquelas que são precocemente diferenciadoras, resultam em números significativamente reduzidos de EFP. Quando os aglomerados do campo ocular emergem, a ilha central de copos neurorretinários deve ser colhida dentro de 1 semana. Isso pode ser feito empurrando suavemente e levantando os copos intactos usando o ângulo ou a região curva da ponta capilar de vidro puxada pela chama, conforme descrito na seção de protocolo. Deve-se tomar cuidado para não danificar os copos. Atrasos adicionais na colheita resultariam em achatamento e perda da organização 3D devido à proliferação e migração de células progenitoras neurorretinianas, o que dificulta a colheita e resulta em organoides retinianos atípicos.
A eficiência da indução do campo ocular e da maturação das taças retinianas varia entre diferentes doenças ou linhas hiPSC específicas do paciente, dependendo dos defeitos genéticos subjacentes. Por exemplo, o comprometimento da linhagem retiniana e as eficiências de formação de EFP de uma linha específica da doença de FR foram idênticos aos das células controle saudáveis, enquanto uma linha nula RB1 falhou em formar EFPs (dados não mostrados). Algumas linhagens portadoras de mutações ligadas à Amaurose Congênita de Leber formaram EFPs atípicas com defeitos em seu tamanho, automontagem, laminação e maturação dos progenitores da retina (dados não mostrados). Validações moleculares adicionais e perfil de expressão gênica de organoides da retina específicos do paciente em comparação com tecidos controles saudáveis seriam necessários para entender a fisiopatologia de uma condição de doença. Considerando a variabilidade no genoma dos pacientes e o envolvimento de redes multigênicas nas manifestações da doença, também pode ser importante estudar organoides da retina derivados de linhagens isogênicas iPSC para estabelecer uma correlação genótipo-fenótipo absoluta em estudos de modelagem de doenças. Tais linhagens isogênicas podem ser criadas por knockouts gênicos direcionados em linhagens de controle saudáveis ou pela correção de mutações patogênicas em iPSCs específicas de pacientes, usando técnicas avançadas de edição do genoma 8,9.
Esses organoides retinianos intactos derivados de linhagens iPSC normais ou doença-específicas podem ser usados na triagem e teste de novas drogas. Precursores de fotorreceptores dentro dos organoides da retina e outros tipos de células oculares, como o EPR e o epitélio corneano dentro dos crescimentos do EFP, podem ser ainda mais isolados e enriquecidos para suas aplicações em pesquisa básica e medicina regenerativa. O protocolo aqui descrito pode ser facilmente adotado para processos compatíveis com GMP para a preparação de células de grau clínico destinadas a avaliações pré-clínicas e de ensaios clínicos.
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Disclosures
Todos os autores não têm conflitos de interesse ou divulgações financeiras.
Acknowledgments
Os autores agradecem o apoio científico e técnico do Dr. Chitra Kannabiran, Geneticista; Dra. Subhadra Jalali, Consultora de Retina; Dr. Milind Naik, Cirurgião Oculoplástico; e o Dr. Swathi Kaliki, oncologista ocular do LV Prasad Eye Institute, Hyderabad, para a geração de linhas iPSC normais e específicas do paciente. Os autores agradecem as bolsas de P&&D do Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia, Departamento de Ciência e Tecnologia (IM), (SB/SO/HS/177/2013), Departamento de Biotecnologia (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019) e Bolsas de Pesquisa Sênior do ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) e CSIR (V.K.P.), Governo da Índia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
| 15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
| Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
| Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
| Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
| Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
| GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
| HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
| Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
| Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
| Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
| Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
| Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
| Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |
References
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