Summary
Denne protokollen beskriver en effektiv metode for å differensiere hiPSCer i øyefeltklynger og generere nevroretinale organoider ved bruk av forenklede kulturbetingelser som involverer både adherente og suspensjonskultursystemer. Andre okulære celletyper, som RPE og hornhinneepitelet, kan også isoleres fra modne øyefelt i retinale kulturer.
Abstract
Pluripotente stamceller kan generere komplekse vevsorganoider som er nyttige for in vitro sykdomsmodelleringsstudier og for å utvikle regenerative terapier. Denne protokollen beskriver en enklere, robust og trinnvis metode for å generere retinale organoider i et hybridkultursystem bestående av adherente monolagskulturer i løpet av de første 4 ukene av retinal differensiering til fremveksten av distinkte, selvorganiserte øyefelt primordiale klynger (EFP). Videre blir de smultringformede, sirkulære og gjennomsiktige nevroretinale øyene i hver EFP manuelt plukket og dyrket under suspensjon ved bruk av ikke-adherente kulturretter i et retinalt differensieringsmedium i 1-2 uker for å generere flerlags 3D-optiske kopper (OC-1M). Disse umodne retinale organoider inneholder PAX6 + og ChX10 + prolifererende, multipotente retinale forløpere. Forløpercellene er lineært selvmonterte i organoidene og fremstår som distinkte radiale striper. Ved 4 uker etter suspensjonskultur gjennomgår retinalprogenitorene postmitotisk arrest og avstamningsdifferensiering for å danne modne retinale organoider (OC-2M). Fotoreseptoravstamningen forløpere utvikles innenfor de ytterste lagene av retinale organoider. Disse CRX + og RCVRN + fotoreceptorcellene morfologisk modnes for å vise indre segmentlignende utvidelser. Denne metoden kan brukes til å generere retinale organoider ved bruk av humane embryonale stamceller (hESCs) og induserte pluripotente stamceller (iPSCs). Alle trinn og prosedyrer er tydelig forklart og demonstrert for å sikre reproduserbarhet og for bredere anvendelser i grunnleggende vitenskap og translasjonsforskning.
Introduction
Netthinnen er et lysfølsomt vev som er tilstede på baksiden av vertebratøyet som omdanner lyssignaler til nerveimpulser ved et biokjemisk fenomen kjent som fototransduksjonsveien. De første nerveimpulser generert i fotoreceptorcellene i netthinnen blir transducert til andre retinale interneuroner og retinal ganglionceller (RGC) og når hjernens visuelle cortex, noe som hjelper til med bildeoppfattelse og visuell respons.
Ifølge Verdens helseorganisasjon (WHO) er anslagsvis 1,5 millioner barn blinde, hvorav 1 million er i Asia. Arvelig retinal dystrofi (IRD) er en stor blindende sykdom som rammer 1 av 4000 individer over hele verden 1,2,3, mens forekomsten av blindhet forbundet med aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) varierer fra 0,6% -1,1% i utviklingsland 4. IRD er forårsaket av arvelige genetiske defekter i over 300 forskjellige gener involvert i retinal utvikling og funksjon5. Slike genetiske endringer resulterer i forstyrrelse av normale retinale funksjoner og gradvis degenerasjon av retinale celler, nemlig fotoreceptorcellene og retinalpigmentert epitel (RPE), og fører dermed til alvorlig synstap og blindhet. Enorme fremskritt har blitt gjort i andre blendende forhold som involverer hornhinnen, linsen, etc. Imidlertid har retinal dystrofier og optiske nerveatrofier ingen bevist terapi til dags dato. Siden en voksen menneskelig retina ikke har stamceller6, kan alternative kilder som embryonale stamceller (ESC) og pasientavledede induserte pluripotente stamceller (iPSCs) gi en ubegrenset tilførsel av ønskede celletyper og holde et stort løfte om å utvikle komplekse vevsorganoider som kreves for in vitro sykdomsmodelleringsstudier og for å utvikle regenerative terapier7, 8,9,10.
Flere år med retinal forskning har ført til en bedre forståelse av molekylære hendelser som orkestrerer tidlig retinal utvikling. De fleste protokoller for å generere retinale celler og 3D-organoider fra PSC-er tar sikte på å rekapitulere disse utviklingshendelsene in vitro ved å dyrke cellene i en kompleks cocktail av vekstfaktorer og små molekyler for å modulere de kjente biologiske prosessene på en trinnvis måte. De retinale organoider som dermed genereres, består av store retinale celler: retinale ganglionceller (RGC), interneuroner, fotoreceptorer og retinalpigmentert epitel (RPE) 11,12,13,14,15,16,17,18,19. Til tross for vellykkede forsøk på modellering av IRD ved hjelp av retinale organoider, utgjør kravet til den komplekse cocktailen av vekstfaktorer og små molekyler under differensiering og den relativt lave effektiviteten av retinal organoidgenerering en stor utfordring med de fleste protokoller. De inkluderer hovedsakelig dannelsen av embryoidlegemer, etterfulgt av deres trinnvise differensiering i retinale linjer ved bruk av komplekse kulturforhold på forskjellige stadier av in vitro-utvikling 20,21,22.
Her rapporteres en forenklet og robust metode for å utvikle komplekse 3D neuro-retinale organoider fra sunn kontroll og retinal sykdomsspesifikke hiPSCs. Protokollen beskrevet her benytter direkte differensiering av nærkonfluente hiPSC-kulturer uten behov for embryoid kroppsdannelse. Også kompleksiteten til kulturmediet er forenklet, noe som gjør det til en kostnadseffektiv og reproduserbar teknikk som lett kan adopteres av nye forskere. Det innebærer et hybridkultursystem bestående av adherente monolagskulturer i løpet av de første 4 ukene av retinal differensiering til fremveksten av distinkte, selvorganiserte øyefelt primordiale klynger (EFP). Videre blir de sirkulære nevro-retinale øyene i hver EFP manuelt plukket og dyrket i suspensjonskulturer i 1-2 uker for å forberede flerlags 3D retinale kopper eller organoider bestående av PAX6 + og CHX10 + prolifererende nevro-retinale forløpere. Utvidet dyrkning av retinale organoider i 100 μM taurinholdig medium i ytterligere 4 uker resulterte i fremveksten av RCVRN + og CRX + fotoreceptorforløpere og modne celler med rudimentære indre segmentlignende utvidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter med hiPSC ble utført aseptisk, i samsvar med standard laboratoriepraksis, etiske retningslinjer og retningslinjer for biosikkerhet, og med godkjenning fra tilsynsorganer som Institutional Ethics Committee (IEC), Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR) og Institutional Bio-Safety Committee (IBSC).
1. Fremstilling av iPSC-kultur og retinal differensieringsmedium og reagenser
- iPSC kultur og vedlikehold medium
- Dyrkning og vedlikehold normal hiPSC-linje23 (hiPSC-F2-3F1) og en CRISPR-redigert, RB1-/- hiPSC-linje (LVIP15-RB1-CS3, med biallelisk, frameshift-delesjon av 10 bp innenfor ekson 18 i det humane RB1-genet ) i Essential 8 medium på matrigelbelagt (kjellermembranmatrisebelagt; se materialfortegnelse) dyrkningsplater under materfrie dyrkningsbetingelser.
MERK: Denne protokollen kan gjøres helt xeno-fri ved å erstatte kjellermembranmatrisen med det rekombinante vitronectin (VTN-N) belegget. Forbered komplett Essential 8 medium ved å legge til 50x Essential 8 supplement (følger med Essential 8 medium kit, se tabell over materialer) og 100 U / ml Penicillin-Streptomycin løsninger. Alternativt kan hiPSCene også dyrkes ved hjelp av det komplette mTeSR1-mediet.
- Dyrkning og vedlikehold normal hiPSC-linje23 (hiPSC-F2-3F1) og en CRISPR-redigert, RB1-/- hiPSC-linje (LVIP15-RB1-CS3, med biallelisk, frameshift-delesjon av 10 bp innenfor ekson 18 i det humane RB1-genet ) i Essential 8 medium på matrigelbelagt (kjellermembranmatrisebelagt; se materialfortegnelse) dyrkningsplater under materfrie dyrkningsbetingelser.
- Løsning for celledissosiasjon (1x CDS)
- For en enzymfri dissosiasjon og passering av humane iPSCs, klargjør CDS som inneholder 0,5 mM EDTA, pH 8,0 og 30 mM NaCl i 1x Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) (se materialtabell).
- For å forberede 100 ml 1x CDS, tilsett 100 μL 0,5 M EDTA og 1 ml 3 M NaCl stamløsninger til 99 ml 1x DPBS, bland godt og filtrer steriliser med et 0,22 μm filter.
- Differensiering Induksjonsmedium (DIM)
- Klargjør DIM med DMEM-F12 basalmedium supplert med 10 % Knockout Serum Replacement (KOSR), 1x Non-Essential Amino Acid (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin, 200 μM L-askorbinsyre og 1 % N2 supplement (se Materialtabell).
- Retinal differensieringsmedium (RDM)
- Forbered RDM ved bruk av DMEM-F12 Basalmedium supplert med 10% Knockout Serum (KOSR), 1x ikke-essensiell aminosyre (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U / ml penicillin-streptomycin, 200 μM L-askorbinsyre og 2% B27 supplement (med vitamin A) (se materialtabell).
- Ekstracellulære matriksbelagte cellekulturoverflater
- Tine den hESC-kvalifiserte kjellermembranmatrisen over natten i en isbøtte, helst inne i kjøleskap ved 4-8 °C. Fortynn den tinte 100x matrisestokken (5 ml) i forholdet 1:5 ved å tilsette 20 ml iskaldt DMEM-F12 basalmedium og bland ved forsiktig virvling for å forberede en 20x stamløsning.
- Klargjør 0,5 ml alikoter på is ved hjelp av forkjølte pipettespisser og sterile mikrosentrifugerør. Merk hetteglassene som 20x skjefter og oppbevar dem frosne i en fryser på -80 °C i opptil 6 måneder.
- For å belegge cellekulturoverflatene (kulturretter eller 6-brønnsplater), tine en alikot med 20x matrise på is og fortynn den i forholdet 1:20 ved bruk av iskald DMEM-F12 basalmedium for å forberede 10 ml 1x matriksbeleggløsning, som er tilstrekkelig til å belegge en 100 mm tallerken eller en 6-brønnsplate (1,5 ml / brønn).
MERK: Forkjøl pipettene/mikrotuppene ved å aspirere iskald og steril DPBS før du håndterer matriksoppløsningen. Tining og all håndtering av matriksen må gjøres på is, ved bruk av forkjølte pipetter/mikrotupper for å unngå polymerisering og gelering ved romtemperatur. - Tilsett 1,5 ml 1x matrisebeleggløsning til hver brønn i en 6-brønnsplate, virvle platen forsiktig for å sikre jevnt belegg, og inkuber platene ved 37 ° C i en 5% CO2 -inkubator. La platene stå uforstyrret i minst 1 time for å sikre jevnt belegg av matriksen på kulturoverflatene.
- Før såing av cellene, aspirer du ut beleggløsningen med en 5 ml steril pipette og kaster det flytende avfallet. Tilsett friskt kulturmedium umiddelbart (2 ml / brønn av en 6-brønnsplate) og frø cellene med en tetthet på 150.000-200.000 celler / brønn. Ikke la platene tørke under håndtering.
MERK: Alternativt kan rekombinant vitronectin (VTN-N) belegg ved en endelig konsentrasjon på 0,5 μg / ml brukes til en xenofri kulturprotokoll.
- Tine den hESC-kvalifiserte kjellermembranmatrisen over natten i en isbøtte, helst inne i kjøleskap ved 4-8 °C. Fortynn den tinte 100x matrisestokken (5 ml) i forholdet 1:5 ved å tilsette 20 ml iskaldt DMEM-F12 basalmedium og bland ved forsiktig virvling for å forberede en 20x stamløsning.
2. Etablering av menneskelige iPSC-kulturer
- Tining og gjenoppliving av hiPSCs
- Belegg en brønn av en 6-brønns plate med 1x membranmatriseløsning. Inkuber ved 37 °C i 1 time for å tillate polymerisering og jevnt belegg av kulturoverflaten.
- Etter 1 time inkubasjon, fjern beleggoppløsningen og tilsett 1 ml forvarmet komplett essensielt 8 medium inneholdende 10 μM rho-kinasehemmer, Y-27632 (1 μL / ml av 10 mM stam, se materialtabell), før du gjenoppliver cellene.
- Fjern en hiPSC kryovial stamfolge (1 x 106 celler/hetteglass) fra beholderen med flytende nitrogen. Tine kryovialet raskt i et vannbad på 37 °C med forsiktig virvling.
MERK: Ikke tine hetteglasset helt. Skriv ned passasjenummeret, overflatesteriliser hetteglasset og tørk det tørt med en lofri vattpinne som inneholder 70% isopropylalkohol. - Bruk en steril 1 ml pipettespiss til å aspirere kryovialinnholdet til et nytt 15 ml rør bestående av 2 ml forvarmet komplett Essential 8-medium uten Y-27632. Sentrifuger røret ved 1000 x g i 4 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 1,0 ml komplett essensielt 8 medium inneholdende 10 μM Y-27632.
- Legg denne celleopphenget på matrisebelagte overflater uten å forstyrre matrisen ved å dispensere den langs veggene. Rock platen forsiktig på tvers for å sikre jevn fordeling av celler.
- Inkuber platene ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator for å la cellene feste seg og begynne å spre seg.
- Etter 12-24 timer, bytt ut det brukte mediet og oppretthold kulturen i forvarmet komplett Essential 8-medium uten Y-27632.
- Bytt kulturmedium hver 24. h og pass kulturene når de når 70% -80% samløp.
MERK: Et delt forhold på 1:6 følges rutinemessig for hiPSC-kulturer og passeres med jevne mellomrom på 3-4 dager.
- Passaging og plating av hiPSCs for å initiere retinal avstamningsdifferensiering
- Aspirer det brukte mediet fra 70% -80% konfluente humane iPSC-kulturer i 6-brønnsplater.
- Tilsett 1 ml CDS (trinn 1,2) i hver brønn og inkuber ved 37 °C i 5-7 minutter til cellene runder opp. Fjern CDS-en forsiktig, pass på at cellene ikke løsner, og tilsett 2 ml friskt Essential 8-medium og triturer forsiktig med en pipette.
- Samle cellesuspensjonen fra en brønn på en 6-cellers plate inn i et 15 ml sentrifugerør og spinn røret ved 1000 x g i 4 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 1,2 ml essensielt 8 medium og dispenser 200 μL av cellens 200 μL av cellesuspensjonen (1:6 delt forhold) i hver brønn i en matrisebelagt 6-brønnsplate inneholdende 1,5 ml iPSC kulturmedium inneholdende 10 μM Y-27632, som beskrevet i trinn 1.5.
- Etter 12-24 timer, bytt ut det brukte mediet og oppretthold kulturen i forvarmet komplett Essential 8-medium uten Y-27632.
- Endre kulturmediet hver 24. time til kulturene når 70% -80% samløp.
3. Differensiering av hiPSCs i øyefelt og retinal avstamning
MERK: En skjematisk oversikt over differensieringsprosessen er vist i figur 1.
- Start differensieringsprosedyren når hiPSC-kulturene når 70% -80% sammenløp.
- På dag 0 bytter du hiPSC vedlikeholdsmedium til DIM (trinn 1.3) som inneholder 1 ng/ml bFGF og 1 ng/ml Noggin. Tilsett 2,0 ml medium per brønn i en 6-brønnsplate og vedlikehold cellene ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator.
MERK: Gradvis tilbaketrekking av bFGF induserer differensiering av PSC, og tilsetning av økende konsentrasjoner av Noggin (inhibitor av flere BMP) i begynnelsen induserer ektodermal avstamningsdifferensiering og neuralisering11,12 og blokkerer mesoderm og endodermforpliktelse. Alternativt kan Noggin erstattes av LDN193189. I motsetning til den doble SMAD-hemmingsstrategien rapportert tidligere20,21, krever denne protokollen ikke tillegg av Activin eller SB-431542. - På dag 1, bytt brukt medium og legg til DIM som inneholder 1 ng / ml bFGF og 10 ng / ml Noggin. Tilsett 2,0 ml per brønn av en 6-brønns plate. Inkubere og vedlikeholde cellene ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator.
- På dag 2-3, fjern det brukte mediet og legg til DIM som inneholder bare 10 ng / ml Noggin. Tilsett 2,0 ml per brønn på en 6-brønns plate og bytt medium hver 24. Inkubere og vedlikeholde cellene ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator.
MERK: Forvarm alltid kulturmiddelet til 30-37 °C før bruk. Overflødige flytere og døde celler kan observeres i tidlige differensieringskulturer. Under slike forhold, vask kulturen en gang med 1x DPBS og tilsett retinal differensieringsmediet. Sterilitetstester på det brukte mediet kan gjøres ukentlig eller etter behov. - På dag 4, fjern det brukte mediet og legg til RDM (trinn 1.4). Tilsett 2,0 ml per brønn av en 6-brønns plate og fortsett å opprettholde kulturene i RDM ved 37 ° C i en 5% CO2 -inkubator, med en frisk middels forandring hver dag.
MERK: Alternativt kan PSC-ene dyrkes som suspensjonskulturer fra dag 1-3, i ikke-adherente og rundbunnede 96-brønnsplater, ved en celletetthet på 5 x 103 celler/100 μL/brønn for å danne embryoidlegemer (EB) under identiske dyrkningsbetingelser i DIM. Velformede EB-er på dag 4 kan belegges på matrisebelagte plater som inneholder RDM og får feste seg, spre seg, og differensiere som beskrevet nedenfor. - Rundt dag 14-18 observerer du kulturene under et mikroskop ved 10x forstørrelse for fremveksten av nevrale rosettlignende domener bestående av tidlige øyefeltprogenitorer (figur 2B).
- På rundt dag 21-28 (3-4 uker), observer kulturer under et mikroskop ved 4x og 10x forstørrelse for å observere fremveksten av selvorganiserte, distinkte EFP-er, med en sentral øy av sirkulære 3D-nevroretinale strukturer omgitt av sammenhengende utvekster av nevroepitel og okulært overflateepitel (figur 2C, D).
MERK: Omtrent 20-30 EFP kan observeres per brønn av en 6-brønnsplate av en normal hiPSC retinal differensieringskultur. Dette tallet kan variere med andre sykdomsspesifikke hiPSC-linjer, basert på deres genetiske bakgrunn og retinal avstamningsdifferensieringspotensial.
4. Høsting av retinale organoider
- Flammetrekking av glass Pasteur-pipetter for manuell plukking av retinalkopper.
MERK: Bruk autoklaverte og sterile Pasteur-pipetter av glass til plukking av øyefelt.- Slå på en Bunsen-brenner. Ta en steril Pasteur-pipette og hold basen i den ene hånden og kapillærspissen i den andre. Flammesteriliser og varm opp regionen nær midten av kapillærspissen, med rotasjonsbevegelser til glasset blir bøyelig. Beveg deg deretter bort fra flammen og trekk raskt utover for å lage en fin kapillærspiss med lukket lumen.
- Hold den fine spissen horisontalt foran flammen og pass den raskt gjennom flammen i en utadgående bevegelse for å skape en jevn krok eller en L-formet kapillærspiss.
- Bruk den glatte ytre krumningssonen til kapillærkroken som en fin skje for forsiktig å løfte og løsne de intakte nevroretinale koppene fra EFP-klyngene.
MERK: Den glatte vinkelen på glasskapillærkroken forårsaker verken skade på cellene eller skaper riper på kulturoverflater. Dette enkle verktøyet kan også effektivt brukes til individuell hiPSC-kolonisplitting i rutenettmønstre og for å passere dem som små celleklynger under klonal ekspansjon.
- Kultur og vedlikehold av retinale kopper for å generere 3D retinale organoider.
- På dag 25-30, tilsett 4,0 ml forvarmet retinal differensieringsmedium i en 60 mm tallerken med lite vedlegg før du forbereder høsting av nevro-retinale kopper.
- Arbeid under et stereomikroskop ved 0,63x-4,5x forstørrelse for å observere og manuelt plukke velformede neuro-retinale kopper fra individuelle EFP-er.
MERK: Utseendet til pigmenterte RPE-celleutvekster hjelper til med enkel identifisering av EFP og de sentralt plasserte nevroretinale koppene. Retinalkoppene fremstår som smultringformede, sirkulære og gjennomskinnelige 3D-strukturer, med klare radiale striper, dannet av de lineært arrangerte og selvmonterte retinale stamceller, i motsetning til de tett pakkede og sfæriske eller uregelmessige klyngene dannet av CNS-nevronene eller nevrale kamceller23. - Bruk de flammetrukne Pasture-pipettekrokene til å forsiktig dytte og øse ut den sentrale nevroretinale øya i individuelle EFP-er.
- Sett en 1 ml mikropipette til å aspirere 100 μL og bruk 1 ml mikrotupper med brede hullåpninger for å aspirere og overføre de flytende retinalkoppene til de friske, lavklebende kulturskålene tilberedt i trinn 4.2.1.
MERK: Bruk av spisser med mindre boring og høyere sugetrykk kan forårsake skjæring og påvirke integriteten til retinalkopper. De omtrentlige dimensjonene til retinalkoppene er ca. 1-2 mm i diameter. - Oppretthold retinalkoppene i RDM som ikke-adherente suspensjonskulturer og inkuber dem ved 37 ° C i en 5% CO2 -inkubator.
- Dag 30-45: Bytt medium daglig ved å vippe fatet forsiktig og la netthinnekoppene legge seg i ca 30 s. Følg en delvis tilførselsmetode, fjern halve volumer brukt medium og erstatt med like store mengder friskt medium.
MERK: Unngå gjentatt aspirasjon og overføringer for å forhindre skade på retinalkoppene. Etter 1-2 uker med suspensjonskultur vokser retinalkoppene litt i størrelse (1-3 mm) og utvikler seg til selvorganiserte 3D retinale organoider (OC-1M) bestående av lineært arrangerte, tidlige nevroretinale progenitorer som uttrykker PAX6 og CHX10 (figur 3Bi). - Dag 45-60: Dyrk retinale organoider i ytterligere 4 uker i RDM som inneholder 100 μM taurin (se materialtabell) for å støtte bedre overlevelse og avstamningsdifferensiering av nevroretinale progenitorer og utvikling av moden retinalcelletype (OC-2M).
MERK: Omtrent 70% -80% av retinale eller optiske kopper plukket fra EFP forblir intakte, beholder lamineringen og utvikler seg til modne retinale organoider etter 4 ukers suspensjonskultur (OC-2M). - Kontroller at de modne retinale organoidene ved 4 ukers suspensjonskultur viser fremveksten av RCVRN + og CRX + fotoreceptorforløpere og modne celler med en rudimentær indre segmentlignende forlengelse i de ytterste cellelagene, og dermed rekapitulerer den normale retinale utviklingen og modningsprosessen in vitro (figur 3Bii).
MERK: Etter fjerning av nevro-retinale kopper, kan differensieringskulturer kontinuerlig opprettholdes i RDM. De proksimale epitelutvekstene som omgir netthinnen inneholder retinalpigmenterte epitelcelleforløpere (RPE), som videre ekspanderer og modnes for å danne pigmenterte RPE-monolag med typisk brosteinsmorfologi (figur 4). De distale utvekstene består hovedsakelig av okulært overflateepitel som bidrar til linsen oghornhinneepitelet. Ønskede celletyper kan høstes fra forskjellige soner av EFP-utvekster og berikes videre for å etablere rene kulturer.
5. Karakterisering av retinale organoider
- Morfologisk og molekylær karakterisering
- Observer de adherente EFP-ene og flytende retinale organoider under et fasekontrastmikroskop ved 4x og 10x forstørrelse og dokumenter deres morfologi og dimensjoner.
- Samle ca. 20 retinale organoider på forskjellige stadier av modning (trinn 4.2.3-4.2.6) til 1,5 ml mikrosentrifugerør ved hjelp av brede bore 1000 μL-spisser. La organoidene slå seg ned i bunnen og aspirere ut mediet. Vask koppene med 1x PBS.
- Fjern overflødig PBS og tilsett 1,0 ml TRIzol reagens (se materialfortegnelse). Inkuber ved romtemperatur i 5 minutter. Homogeniser vevet ved hjelp av en rørpestel og triturat ved hjelp av en 1,0 ml pipette.
- Forbered totalt RNA ved å følge standard reagensmetoden for RNA-isolering og rensing, i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabell).
- Kontroller RNA-kvaliteten på agarosegelen og kvantifiser den ved hjelp av NanoDrop spektrofotometer (se materialfortegnelse).
- Konverter 1-2 μg totalt RNA til cDNA ved bruk av revers transkriptase-enzymet i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse). Se tabell 1 for en liste over genspesifikke primere.
- Forbered kort RNA-primermasterblandingen i 10 μL totalvolum som nevnt i tabell 2 og inkuber røret ved 65 °C i 5 minutter i en termisk syklist. Overfør røret fra termosyklisten til is i 2 min.
- I mellomtiden forbereder du masterblandingen 2 med reagensene nevnt i tabell 3. Legg denne masterblandingen til RNA-primerblandingsrøret som ble utarbeidet i trinn 5.1.7. Bland forsiktig.
- Inkuber prøven ved 50 °C i 50 minutter, deretter 85 °C i 5 minutter, og hold deretter ved 4 °C for å stoppe reaksjonen.
- Bruk det syntetiserte cDNA som en mal i PCR-reaksjoner for å kontrollere ekspresjonen av nevroretinal stamfar og modne retinalcellemarkører.
- Normaliser de totale cDNA-malene for hver prøve, nemlig F2-UD (hiPSC-F2-3F1; udifferensierte celler), OC-1M (1 uke gammel optisk kopp i suspensjonskultur) og OC-2M (4 uker gammel optisk kopp i suspensjonskultur) ved semi-kvantitativ PCR ved bruk av husholdningsgener som hE1fα eller GAPDH.
- Forbered masterblandingen for semi-kvantitativ PCR, som nevnt i tabell 4, og plasser testprøverørene for forsterkning i en termisk syklist. PCR-amplifikasjonsbetingelsene er nevnt i tabell 5.
- Histologi og immunhistokjemi
- Samle de optiske koppene i et 2,0 ml mikrosentrifugerør og aspirer overflødig medium (trinn 4.2.3-4.2.6). Skyll organoidene med 1x PBS og vask og suspender dem deretter i 500 μL 4% paraformaldehyd for å fikse dem over natten ved romtemperatur.
- Neste dag, vask koppene i avionisert vann. La koppene stå i 95% alkohol (tre skift, 15-20 min hver), etterfulgt av 100% alkohol (tre endringer, 15-20 min hver), en 1: 1 blanding av absolutt alkohol og xylen i 15 min, xylen (to endringer, 15 min hver) og parafin (tre endringer, 15 min hver). Legg inn dette vevet for å forberede en parafinblokk etter standardprosedyrer. La den avkjøles og stivne.
- Forbered tynne seksjoner (~ 4-5 μm tykkelse) ved hjelp av en mikrotome og legg dem på silanbelagte mikroskopiske lysbilder (se materialfortegnelse) etter standard histologiprosedyrer.
- For deparaffinering, varm lysbildene ved 70 °C på en varmeblokk i 15-20 minutter. Når voksen smelter, vask lysbildene med xylen (tre endringer, 3-4 minutter hver), som vil fjerne parafinen helt.
MERK: Ufullstendig fjerning av parafin resulterer i dårlig/ujevn farging av seksjoner med stor mengde bakgrunnsstøy. - Rehydrer lysbildene med forskjellige prosentandeler etanol (100%, 90% og 80%) i 3 minutter hver. Skyll lysbildene med destillert vann og fortsett med antigenhenting.
- Før du starter antigenuthentingen, forvarm sitratbufferen (pH 6,0) i en Coplin krukke (se materialfortegnelse) ved hjelp av en mikrobølgeovn til den når 95-100 °C.
- Dypp lysbildene i forvarmet sitratbuffer og varm krukken i 15 minutter i mikrobølgeovn. Ta Coplin krukken ut av ovnen og la den avkjøles ved romtemperatur.
- Blokker seksjonene for endogen peroksidase ved å tilsette en 1: 1 blanding av metanol og hydrogenperoksid i 5 minutter, etterfulgt av å vaske seksjonene tre ganger med 1x PBS.
- Permeabiliser seksjonene med 0,5% Triton-X 100 i 15 minutter. Vask lysbildene tre ganger med 1x PBS.
- Blokker den uspesifikke bindingen av primærantistoff ved å inkubere seksjonene med 10% Fetal Bovine Serum (FBS) i 1x PBS i 1 time.
- Inkuber snittene med primært antistoff i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C. Vask lysbildene tre ganger med 1x PBS i 3-5 minutter hver for å fjerne det ubundne antistoffet.
- Tilsett egnet fluorescerende fargestoffkonjugert sekundært antistoff og inkuber i 45 minutter. Vask lysbildene tre ganger med 1x PBS i 3-5 min hver.
MERK: Antistoffene og deres respektive fortynninger er nevnt i materialfortegnelsen. De retinale organoidseksjonene ble immunmerket ved hjelp av PAX6 og CHX10 for å oppdage tidlige nevroretinale forløperceller, og ved bruk av Recoverin og CRX for å oppdage engasjerte retinale og fotoreceptorforløperceller. Tilsvarende ble anti-PAX6 og anti-MITF brukt til å oppdage RPE-forløpere, og anti-CRALBP og anti-RPE65 ble brukt til å oppdage pigmenterte modne RPE-celler ved immunocytokjemi av 2D monolagskulturer. - Motflekk seksjonene med DAPI eller PI og monter dem på et glassglass ved hjelp av antifademonteringsmediet (se materialfortegnelse).
- Avbilde og dokumenter de immunmerkede delene av retinale organoider og RPE-kulturer ved hjelp av et fluorescens eller konfokal laserskanningsmikroskop for å undersøke forskjellige cellelag som uttrykker forskjellige retinale markører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Differensiering av hissc til øyelinjer oppnås ved å dyrke cellene i forskjellige cocktailer av kulturmedium som inneholder kosttilskudd og vekstfaktorer i sekvensielle trinn på forskjellige tidspunkter, som beskrevet i figur 1. HiPSC-kulturene opprettholdes i Essential 8 medium, det pluripotente stamcellevedlikeholdsmediet. Når de når 70 %-80 % konfluens (figur 2A), erstattes mediet med differensieringsinduksjonsmedium (DIM) på dag 0 (se trinn 3.2) som inneholder 1 ng/ml bFGF, 1 ng/ml Noggin og 1 % N2 supplement. Sammen med det nevrale induserende N2-supplementet spiller Noggin, BMP-signalhemmeren, en avgjørende rolle i å lede cellene mot nevroektodermal avstamning ved å blokkere mesodermal og endodermal forpliktelse. På 1st, 2nd og 3rd dag økes konsentrasjonen av Noggin til 10 ng / ml (se trinn 3.3 og 3.4). Fra den 4. dagen erstattes DIM med retinal differensieringsmedium (RDM) (trinn 3.5), og kulturene opprettholdes kontinuerlig i opptil 30 dager. B27 i RDM-cocktailen inneholder ekstra kosttilskudd som flere antioksidanter og D-galaktose, som fremmer aerob metabolisme og bidrar til å redusere oksidativt stress, forbedre levedyktigheten til differensierende stamceller. I tillegg fremmer tilstedeværelsen av retinolacetat (vitamin A) og veksthormoner som triiodo-I-tyronin (T3) nevral og retinal avstamningsdifferensiering.
På den 14. til 18. dagen observeres dannelsen av nevrale rosetter, som markerer initiering av øyefeltforpliktelse (figur 2B). Øyefeltforløperne i nevrale rosetter sprer seg videre og organiserer seg selv i distinkte øyefeltprimordiale klynger (EFP) med sirkulære nevroretinale strukturer i sentrum. Andre celletyper som retinalpigmentert epitel (RPE), nevrale kamepitel og de som bidrar til den okulære overflaten, dukker opp og migrerer ut som sammenhengende epitel med veldefinerte marginer. Velformede øyefelt, som beskrevet ovenfor, kan observeres mellom den 21. til 28. dagen med differensiering (figur 2C,D). Den sentrale øya av nevro-retinale kopper høstes mellom dag 25-30 ved hjelp av en flammetrukket glass Pasteur-pipette (figur 2E) og opprettholdes som ikke-adherente suspensjonskulturer i RDM i ytterligere 1-2 uker, til dag 45. De prolifererende retinale progenitorene organiserer seg videre for å danne flerlags 3D retinale organoider på ca. 2-3 mm i diameter (figur 2F, G). Fra dag 46 suppleres RDM med 100 μM taurin for å fremme nevrogenese og for å forbedre celleoverlevelse i langsiktige organoidkulturer in vitro (figur 2H).
Retinale organoider karakteriseres i forskjellige stadier av modning for ekspresjon av flere retinale stammarkører ved bruk av revers transkripsjon PCR (RT-PCR) og immunhistokjemi (IHC). For dette høstes organoidene for total RNA-isolasjon på den 30. og 60. dagen for differensiering. RT-PCR-resultater bekreftet induksjon og ekspresjon av nevroretinale markører som NEUROD1, ChX10, CRX, PKCß1, RLBP1, RHOK, OPN1SW, RCVRN, ABCA4, RD3 og PDE6C i 1 uke gamle retinale organoider (4-5 uker etter differensiering, OC-1M) og 4 uker gamle retinale organoider 8,12 (7-8 uker etter differensiering, OC-2M) (figur 3A). Immunhistokjemi og fluorescensavbildning har bekreftet uttrykket av tidlige retinale stammarkører PAX6, CHX10 og OTX2 i OC-1M og modne retinale markører RCVRN og CRX i OC-2M 8,12 (figur 3Bi,ii).
I tillegg til de sentrale nevroretinale koppene, oppstår og migrerer de andre okulære celletypene, som retinalpigmentert epitel (RPE), nevrale kamepitel og okulære overflateepitelceller, ut av EFP-ene. De nevroektodermderiverte RPE-forfedrene fremstår som kompakt anordnede epitelceller som omgir EFP-ene, som gradvis modnes og blir pigmentert langs migreringsmarginene fra dag 30-45 (figur 4A-C). Disse adherente differensieringskulturene, etter fjerning av retinale kopper, kan derfor utvides til dag 45, for å høste prolifererende RPE-forløpere (figur 4D), som kan berikes ytterligere for å forberede monolagskulturer av fullt modne pigmenterte RPE-celler. Moden pigmentert RPE kan ses som monolag med typisk brosteinsmorfologi (figur 4E). RPE-celleidentiteten bekreftes videre ved immuncytokjemi ved bruk av antistoffer mot RPE-spesifikke markører som MITF (RPE-stammarkør), PAX6 (stamfar og moden RPE-markør) og RPE65 (moden RPE-markør)10,12 (figur 4F-H).
Pluripotente stamcellederiverte retinale organoider kan dermed tjene som in vitro-modeller for å studere ulike arvelige netthinnesykdommer 7,8,9. Sykdomsspesifikke stamcellemodeller utvikles enten ved å generere pasientspesifikke iPSC-linjer eller ved å introdusere sykdomsspesifikke mutasjoner i sunne kontroll-iPSC-linjer ved hjelp av den CRISPR-baserte genredigeringstilnærmingen 7,8. De muterte iPSCene kan eller kan ikke differensiere effektivt til retinale celletyper, avhengig av genmutasjonene som er involvert. Mens de fleste sunne kontrollcellelinjer fulgte tidslinjen beskrevet ovenfor, kan det være avvik i tilfelle sykdomsspesifikke iPSCer når det gjelder differensieringstidslinjer, EFP-morfologi, retinal koppstørrelse, laminering og modning. Det retinale differensieringspotensialet til en RB1-/- hiPSC-linje (LVIP15-RB1-CS3) som bærer en biallelisk delesjon på 10 bp i ekson 18 av det humane RB1-genet ble undersøkt, noe som resulterer i en rammeforskyvning og fullstendig tap av RB1-proteinuttrykk. Det ble observert at tapet av RB1-uttrykk ikke påvirket øyet og tidlig retinal avstamningsdifferensiering av den muterte hiPSC-linjen. Imidlertid ble det observert en markert forsinkelse i tidslinjer og en reduksjon i EFP-formingseffektivitet. De atypiske EFP-ene som dukket opp, hadde unormale aggregater av retinale progenitorer som ikke klarte å laminere og selvorganisere seg i riktige retinalkopper (figur 5A, B) eller manglet den omkringliggende sonen av RPE og okulært overflateepitel (OSE) (figur 5C). Når de ble plukket og vedlikeholdt som suspensjonskulturer, dannet disse retinale stamklyngene uregelmessige nevroretinale aggregater (figur 5D).
Figur 1: Tidslinje som representerer differensiering av iPSCs i retinale organoider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Selvorganisert 3D retinal organoid generering. (A) Voksende hiPSCs-kulturer under materfrie forhold. (B) Utvikling av nevrale rosetter på dag 14 av differensiering (stjerne). (C,D) Øyefelt primordial (EFP) klynger som inneholder en sentral neuro-retinal kopplignende struktur (svarte piler) omgitt av epitelets migrerende sone (hvite piler) på dag 21-28 av differensiering. (E) Flammetrukket glass Pasteur-pipette med krokspiss. Den glatte kurven ved hengselområdet brukes til å dytte og løfte retinalkoppene (pilen). (F,G) Retinal kopper høstet på dag 25 og dyrket under suspensjon for å generere selvorganiserte 3D retinal organoider. (H) Modne retinale organoider i suspensjonskultur ved dag 45. Skalastenger: 100 μm (A,B,D,G); 200 μm (C,F,H). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Karakterisering av retinale organoider. (A) Retinal genuttrykksprofilering ved RT-PCR av den udifferensierte normale hiPSC-linjen 23 (hiPSC-F2-3F1) (F2-UD) og de differensierte normale optiske koppene plukket ved 3-4 ukers differensiering og modnet videre i suspensjonskultur i henholdsvis 1 uke (OC-1M) og 4 uker (OC-2M). DNAene til alle testprøver ble normalisert ved bruk av eEF1a som lastekontroll. (B) Konfokale bilder av immunmerkede seksjoner av (i) umodne retinale organoider (OC-1M) som bruker antistoffer mot nevroretinale stammarkører CHX10, PAX6 og OTX2 (i rødt) og (ii) modne retinale organoider (OC-2M) som bruker antistoffer mot fotoreseptorforløpermarkørene Recoverin og CRX (i rødt). Det markerte ytterste laget av retinale organoider med differensierende fotoreseptorceller (boks) i venstre panel er zoomet og vist i de høyre panelene. DAPI ble brukt som motflekk (i blått). De rudimentære indre segmentlignende utvidelsene er markert med hvite piler. Skala bar: 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fremvekst av ulike øyecelletyper. (A) EFP-klynger med nevroretinalkoppen i midten og migrerende RPE-utvekster som viser pigmentering langs forkantene (hvit pil). (B) Godt differensierte pigmenterte epitelutvekster fra flere EFP-er rundt den nevro-retinale øya. (C) Høyere forstørrelse av en EFP viser migreringssonen til RPE-forfedre (hvit pil) og okulær overflateepitel (stjerne) som omgir en nevroretinalkopp. (D) Utvidede adherente kulturer som utviklet monolayers av umodne RPE-celler som inneholder både pigmenterte og ikke-pigmenterte celler. (E) Monolagskulturer av fullt modne og pigmenterte RPE-celler som viser brosteinsmorfologi ved dag 60. (VG Nett) RPE-celler som uttrykker PAX6, MITF og RPE65 i grønt. Skala bar: 200 μm (A,B); 100 μm (C-E); 20 μm (F-H). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Unormal retinal koppdannelse i RB1-/- muterte iPSCs. (A,B) EFP med unormale aggregater av retinale progenitorer med forvrengt laminering og mangel på striasjoner. (C) EFP med miniatyr nevro-retinal kopp, men mangler den omkringliggende sonen av RPE og okulær overflateepitel (pil). (D) Uregelmessige nevroretinale aggregater dannet i suspensjonskultur. Skala bar: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Primer navn | Hovedsekvens (5'-3') | Båndstørrelse (bp) | Ref Id | |||
| 1 | heEF1α | F: GAAGTCTGGTGATGCTGCCATTGT | 198 | NM_001402 | ||
| R: TTCTGAGCTTTCTGGGCAGACTTG | ||||||
| 2 | hNeuroD1 | F: CGCGCTTAGCATCACTAACT | 349 | NM_002500 | ||
| R: GCGTCTCTTGGGCTTTTGAT | ||||||
| 3 | hCHX10 | F: CAAGTCAGCCAAGGATGGCA | 382 | NM_182894 | ||
| R: CTTGACCTAAGCCATGTCCT | ||||||
| 4 | hCRX | F: TCAACGCCTTGGCCTAAGT | 357 | NM_000554 | ||
| R: ACACATCTGTGGAGGGTCTT | ||||||
| 5 | hPKC-β1 | F: AAAGGCAGCTTTGGCAAGGT | 376 | NM_212535 | ||
| R: CGAGCATCACGTTGTCAAGT | ||||||
| 6 | RLBP1 | F: TGCACCATTGAAGCTGGCTA | 361 | NM_000326 | ||
| R: AGAAGGGCTTGACCACATTG | ||||||
| 7 | RHOK | F: CAAGCTGTATGCCTGCAAGA | 360 | NM_002929 | ||
| R: ATCCGGACATTGCCGTCATT | ||||||
| 8 | hOPN1SW | F: TGCTTCATTGTGCCTCTCTC | 373 | NM_001708 | ||
| R: AGCTGCATGTCGGATTCA | ||||||
| 9 | RCVRN | F: AGACCAACCAGAAGCTGGAGT | 367 | NM_002903 | ||
| R: ACGGGTGTCATGTGAGTGGTA | ||||||
| 10 | hABCA4 | F: CACCGTAGCAGGCAAGTATT | 271 | NG_009073 | ||
| R: AATGAGTGCGATGGCTGTGGAGA | ||||||
| 11 | hRD3 | F: ATGGTGCTGGAGACGCTTAT | 328 | NM_183059 | ||
| R: CTTCCTGCTTCATCCTCTCCA | ||||||
| 12 | hPDE6C | F: GTTGATGCCTGTGAACAAATGC | 351 | NM_006204 | ||
| R: ACCACTCAGCATAGGTGTGAT | ||||||
Tabell 1: Liste over genspesifikke primere for RT-PCR.
| Komponenter for RNA-Primer-blanding | Volum (i μL) |
| RNA (1-2 μg) | n |
| 10 mM dNTP | 1 |
| 10 mM Oligo dT | 1 |
| DEPC-behandlet vann | opptil 10 |
| Totalt reaksjonsvolum | 10 |
Tabell 2: RNA-primer master mix for cDNA-konvertering.
| Komponenter til Mastermix 2 | Volum (i μL) |
| 10x RT-buffer | 2 |
| 25 mM MgCl2 | 4 |
| 0,1 m DTT | 2 |
| SuperScript III revers transkriptase | 1 |
| RNaseOUT | 1 |
| Totalt reaksjonsvolum | 10 |
Tabell 3: Master mix 2 for cDNA-konvertering.
| Komponenter av PCR | Volum (i μL)/reaksjon |
| 10x PCR-buffer | 2 |
| 2 mM dNTP | 2 |
| Forovergrunning (5 μM) | 1 |
| Omvendt primer (5 μM) | 1 |
| Taq-polymerase | 0.2 |
| cDNA-mal (50-100 ng) | 1 |
| Sterilt Milli-Q-vann | 12.8 |
| Totalt reaksjonsvolum | 20 |
Tabell 4: Mastermiks for semikvantitativ PCR.
| Temperatur | Tid | Antall sykluser | |
| Denaturering | 95 °C | 5 min | x 1 |
| Denaturering | 95 °C | 30 s | x 35 |
| Annealing | 50-60 °C | 30 s | |
| Forlengelse | 72 °C | 30 s | |
| Endelig forlengelse | 72 °C | 10 min | x 1 |
Tabell 5: PCR-amplifikasjonsbetingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hiPSCs er et kraftig verktøy for å studere organ- og vevsutvikling in vitro. Rekapitulering av sykdomsfenotypen ved å differensiere sunne versus sykdomsspesifikke hiPSCs mot retinallinjen kan bidra til å få nyere innsikt i patofysiologien til forskjellige former for arvelige retinale dystrofier. Flere protokoller har blitt beskrevet og vedtatt for in vitro differensiering av PSC til retinale celletyper. De fleste av dem involverer bruk av kulturmedium som inneholder komplekse cocktailer av rekombinante vekstfaktorer, kosttilskudd, små molekyler og reagenser, for eksempel: N1, N2 og B27 kosttilskudd; BMP og TGFβ signalblokkere som Noggin, SB431542, LDN193189 og Follistatin, eller indusere som Activin A, Lefty og IDE1; kanoniske Wnt-signalblokkere som DKK1, SFRP, IWP-2 og IWR-1-endo, eller induktorer som CHIR99021, SB216763 og CKI-7; FGF-reseptorsignalblokkere som PD0325901 og PD173074 eller induktorer som bFGF; hakk signalhemmere som DAPT; andre signalmolekyler som insulinlignende vekstfaktor (IGF-1); retinsyre; veksthormoner som trijodtyronin (T3) og hydrokortison; og antioksidanter og andre pro-overlevelsesfaktorer som askorbinsyre, nikotinamid, taurin, dokosaheksaensyre, 1-tioglycerol, etc. Disse komponentene er inkludert i kulturmediet på forskjellige stadier av stamcelledifferensiering for å stimulere eller modulere forskjellige signalkaskader for å indusere øye- og netthinnelinjeforpliktelse 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22.
Her beskrives en enklere, robust og effektiv metode for å generere retinale organoider direkte fra nærkonfluerende, adherente kulturer av hiPSCs. Den forenklede protokollen innebærer å bruke færre kosttilskudd, vekstfaktorer og små molekyler som primært utløser den første differensieringen av PSC i nevroektodermal avstamning. Påfølgende differensieringstrinn er avhengige av PSCs iboende evne til å synkront differensiere til celletypen av relaterte linjer, som deretter selvorganiserer og gjensidig regulerer utviklingen og romlig organisering av flere celletyper som bidrar til dannelsen av komplekse vev. Den gradvise tilbaketrekkingen av bFGF og tillegg av Noggin hjelper til med vellykket induksjon av tidlig nevroektodermal skjebneforpliktelse innen 3 dager etter differensiering. Fortsatt vedlikehold av differensieringskulturer i nevralinduserende RDM, uten å legge til noen vekstfaktorer eller små molekyler, resulterer i induksjon av øyefeltprimordiale (EFP) strukturer med klare marginer, innen 3-4 uker etter differensiering. EFP-ene inneholder multipotente stamceller, som ved uforstyrret og fortsatt vedlikehold resulterer i differensiering av flere linjer og selvmontering for å danne komplekse EFP-er bestående av sentralt plasserte nevroretinale kopper eller optiske kopper (OC), omgitt av andre relaterte okulære celletyper som retinalpigmentert epitel (RPE), nevrale kamepitel og okulært overflateepitel. Alternativt kan PSC-ene dyrkes som suspensjonskulturer fra dag 1-3 for å danne EB-er under identiske dyrkningsbetingelser. EB-ene kan videre belegges på dag 4 og dyrkes som adherente kulturer på matrisebelagte overflater i RDM for å initiere retinal avstamningsdifferensiering, som beskrevet ovenfor. Sunne differensierende kulturer gir rutinemessig opphav til ca. 20-30 EFP per brønn på en 6-brønnsplate. OC-ene kan høstes fra EFP-ene ved 3-4 uker med retinal differensiering og opprettholdes i suspensjonskulturer i ytterligere 30-60 dager, for å muliggjøre differensiering av nevroretinale progenitorer og for å generere modne retinale organoider. Etter 4 ukers suspensjonskultur forblir omtrent 70% -80% av de optiske koppene plukket fra EFP intakte, beholder lamineringen og utvikler seg til modne retinale organoider (OC-2M), med RCVRN + og CRX + engasjerte fotoreceptorceller og indre segmentlignende utvidelser i de ytterste lagene.
Sammenløpet av voksende iPSC-kulturer er kritisk på tidspunktet for initiering av differensiering og skifte kulturer til DIM. Kulturer med mindre kolonier og samløp under 60%, og de som er tidlig differensierende, resulterer i betydelig reduserte EFP-tall. Når øyefeltklyngene dukker opp, bør den sentrale øya av nevro-retinale kopper høstes innen 1 uke. Dette kan gjøres ved å forsiktig skyve og løfte de intakte koppene ved hjelp av vinkelen eller det buede området av den flammetrukne kapillærspissen, som beskrevet i protokollavsnittet. Pass på at du ikke skader koppene. Ytterligere forsinkelser i plukking vil resultere i flattning og tap av 3D-organisasjon på grunn av spredning og migrasjon av neuro-retinale stamceller, noe som gjør høsting vanskelig og resulterer i atypiske retinale organoider.
Effektiviteten av øyefeltinduksjon og modning av retinalkopper varierer mellom forskjellige sykdoms- eller pasientspesifikke hiPSC-linjer, avhengig av de underliggende genetiske defektene. For eksempel var retinal avstamningsforpliktelsen og EFP-dannende effektivitet av en RP-sykdomsspesifikk linje identisk med den for de friske kontrollcellene, mens en RB1-nulllinje ikke klarte å danne EFP (data ikke vist). Noen linjer som bærer mutasjoner knyttet til Leber medfødt amaurose dannet atypiske EFP med defekter i størrelse, selvmontering, laminering og modning av retinale progenitorer (data ikke vist). Ytterligere molekylære valideringer og genuttrykksprofilering av pasientspesifikke retinale organoider sammenlignet med sunt kontrollvev ville være nødvendig for å forstå patofysiologien til en sykdomstilstand. Tatt i betraktning variasjonen i pasientgenomer og involvering av multigennettverk i sykdomsmanifestasjoner, kan det også være viktig å studere retinale organoider avledet fra isogene iPSC-linjer for å etablere en absolutt genotype-fenotype-korrelasjon i sykdomsmodelleringsstudier. Slike isogene linjer kan opprettes enten ved målrettede genutslag i friske kontrolllinjer eller ved å korrigere de patogene mutasjonene i pasientspesifikke iPSCer, ved hjelp av avanserte genomredigeringsteknikker 8,9.
Slike intakte retinale organoider avledet fra normale eller sykdomsspesifikke iPSC-linjer kan brukes i ny legemiddelscreening og testing. Fotoreceptorforløpere i retinale organoider og andre okulære celletyper, som RPE og hornhinneepitel i EFP-utvekstene, kan isoleres og berikes ytterligere for deres anvendelser i grunnforskning og regenerativ medisin. Protokollen beskrevet her kan enkelt adopteres til GMP-kompatible prosesser for å forberede kliniske karakterceller ment for prekliniske og kliniske prøveevalueringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har ingen interessekonflikter eller økonomiske opplysninger.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner den vitenskapelige og tekniske støtten fra Dr. Chitra Kannabiran, genetiker; Dr. Subhadra Jalali, retinal konsulent; Dr. Milind Naik, oculoplastisk kirurg; og Dr. Swathi Kaliki, okulær onkolog ved LV Prasad Eye Institute, Hyderabad mot generering av normale og pasientspesifikke iPSC-linjer. Forfatterne anerkjenner FoU-tilskuddene fra Science and Engineering Research Board, Department of Science and Technology (IM), (SB / SO / HS / 177/2013), Institutt for bioteknologi (IM), (BT / PR32404 / MED / 30 / 2136 / 2019) og seniorforskningsstipendier fra ICMR (S.M., D.P.), UGC (TA) og CSIR (VKP), Indias regjering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
| 15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
| Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
| Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
| Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
| Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
| GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
| HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
| Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
| Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
| Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
| Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
| Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
| Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |
References
- Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P.
- Sen, P., et al. Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years. Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).
- Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. Trend of retinal diseases in developing countries. Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).
- RetNet - Retinal Information Network. , Available from: https://sph.uth.edu/retnet/ (2022).
- Cicero, S. A., et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).
- Guo, Y., et al. Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361 (2019).
- Lane, A., et al. Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids. Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).
- Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).
- Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
- Meyer, J. S., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).
- Zhu, J., Lamba, D. A. Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (12), 2882 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Chichagova, V., et al. Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95 (2019).
- Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal. STAR Protocols. 1 (1), 100033 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Mellough, C. B., et al. IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
