Gemeinschaft DNA-Extraktion von Bakterienkolonien

Environmental Microbiology

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Overview

Quelle: Labors von Dr. Ian Pfeffer und Dr. Charles Gerba - Arizona University
Demonstrierende Autor: Luisa Ikner

Traditionellen Analysemethoden für mikrobielle Gemeinschaften in Böden sind in der Regel entweder kulturelle Assays Verwendung von Verdünnung und Plattieren Methodik auf selektive und differenzierte Medien oder direkte Graf Assays miteinbezogen. Direkte zählt bieten Informationen über die Gesamtzahl der Bakterien vorhanden, aber geben keine Auskunft über die Anzahl oder die Vielfalt der Bevölkerung innerhalb der Gemeinschaft. Platte Grafen Aufzählung aller kulturellen oder ausgewählten kulturellen Populationen zu ermöglichen und somit geben Auskunft über die verschiedenen Populationen vorhanden. Da weniger als 1 % der Bodenbakterien leicht kultivierbare sind, bietet kulturelle Informationen jedoch nur ein Teil des Bildes. Der tatsächliche Anteil der Gemeinschaft, die kultiviert werden kann hängt von der gewählten Mittel für kulturelle zählt. Jedes einzelnes Medium wählt für die Bevölkerung, die für diesen bestimmten Medium am besten geeignet sind.

In den letzten Jahren haben die Vorteile eines Studiums Gemeinschaft aus Bodenproben extrahierte DNA sichtbar. Dieser Nonculture Ansatz wird gedacht, um mehr repräsentativ für die tatsächliche Gemeinschaft anwesend als kulturbasierte Ansätze. Neben der Bereitstellung von Informationen über die Arten der Bevölkerung vorhanden, kann dieser Ansatz auch über ihr genetisches Potenzial informieren. Wie bei jeder Technik gibt es Beschränkungen in Bezug auf die Daten, die mit DNA-Extraktion gewonnen werden können. Daher verwenden viele Forscher jetzt DNA-Extraktion in Verbindung mit direkten und kulturelle zählt um zu die Daten aus einer ökologischen Probe zu maximieren.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Grundlagen der Umwelt-Mikrobiologie. Gemeinschaft DNA-Extraktion von Bakterienkolonien. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

DNA-Extraktion aus dem Boden kann auf zwei Arten (Tabelle 1) durchgeführt werden. In der in Situ -Methode ist eine Kombination aus chemischer und mechanischer Techniken verwendet. Für diese Extraktion ist eine Masse des Bodens mit gleichwertigem Umfang von einem Extraktionspuffer kombiniert. Glasperlen werden dann hinzugefügt, um das Fahrwerk zusammen mit einem Volumen von Waschmittel (Sodium Dodecyl Sulfat oder SDS, wird in der Regel verwendet), und die Probe wird zur Trennung von Bodenteilchen gefolgt von Inkubation bei erhöhter Temperatur Zelle Lysis zu fördern Erleichterung gemischt. Nach Zentrifugation unterliegt der Überstand weitere Extraktion und Inkubation Schritte um das DNA-Produkt zu reinigen.

Alternativ Zellen zuerst fraktioniert (oder getrennt) aus der Bodenmatrix vor der Extraktion des genetischen Materials. Eine Masse von Bodenprobe erfährt aufeinanderfolgende Zyklen von mischen und langsam Zentrifugation. Der Wulst-Prügel-Schritt ist hier jedoch eliminiert, um intakte Zellen beizubehalten, die zentrifugiert werden, um eine Kugel zu erhalten. Eine Lysozym-basierte Extraktion erfolgt dann in Verbindung mit Inkubation zu stören die Zellwände und DNA für die Reinigung zu befreien.

Dieses Manuskript und Video zeigen die in Situ -Methode der DNA-Extraktion aus dem Boden, wie dieses Verfahren nachgewiesen wurde, um höhere Konzentrationen von DNA aus Bodenproben im Verhältnis zu der Zelle Fraktionierung Methode zu erzielen.

Problem Bakterielle Fraktionierung In Situ Lyse
Ertrag von DNA 1-5 μg/g 1-20 μg/g
Vertreter der Gemeinschaft Weniger repräsentativ wegen Zelle sorption Repräsentativer, unberührt Zelle sorption
Quelle der DNA erholt Nur Bakterien Vor allem Bakterien aber auch Pilze und Protozoen
Grad der DNA-Scheren Weniger die Scheren Mehr Scheren
Durchschnittliche Größe der DNA-Fragmente 50 kb 25 kb
Huminsäure Verschmutzungsgrad Weniger belastet Mehr verunreinigt
Einfache Methode Low, mühsam Schneller und weniger arbeitsintensiv

Tabelle 1. Vergleich der bakteriellen Fraktionierung und in Situ Lyse-Methoden für die Wiederherstellung der DNA aus dem Boden.

Procedure

(1) Bakteriengemeinschaft DNA-Extraktion

  1. Um den Vorgang zu starten, 100 g gesiebten Bodens abwiegen. Fügen Sie diese in einen Behälter aus Polypropylen, und fügen Sie 100 mL Extraktionspuffer bestehend aus Tris-Puffer mit EDTA zu fördern die Freisetzung von Bakterien aus der Bodenmatrix, dann schütteln von hand geändert.
  2. Als nächstes wiegen Sie 100 g von Glasperlen, und fügen Sie diese in den Mischbehälter gefüllt. Agitieren Sie die Probe für 5 min mit eine Perle schlagen Gerät oder Handgelenk-Mechanik Shaker für 15 min. Fügen Sie 10 mL 20 % Sodium Dodecyl Sulfat oder SDS, die Mischung dann für eine weitere Minute schütteln. Bei einer hohen Temperatur von 60-65 ° C für 60 min inkubieren.
  3. Gleichmäßig verteilen die Probe unter separaten 50-mL-Tuben und Zentrifuge für 10 min bei 6.000 x g. Überstand aus den Rohren auf einen einzigen sterilen Behälter übertragen. Anschließend wiederholen Sie die Extraktion der Boden Pelletofen wie zuvor beschrieben, mit einem frischen Volume Extraktionspuffer.
  4. Fügen Sie das Gesamtvolumen der verarbeiteten überstand, etwa 200 mL, ein sauber 50-mL-Tube bis halbe Lautstärke gefüllt mit einer Lösung von 30 % Polyethylenglykol und 1,6 M Natriumchlorid. Invertieren der Flaschen mehrmals von hand um zu mischen, und Inkubation bei Raumtemperatur für 2 h Zentrifuge Proben bei 10.000 x g für 20 Minuten um das DNA-pellet.
  5. Entfernen Sie den Überstand von Zentrifugenröhrchen, hinterlässt das teilweise gereinigte Nukleinsäure-Pellet vorsichtig. Hinzugeben Sie 20 mL der TE-Puffer und 1,5 mL 7,5 M Kalium Acetat Lösung für Pellet, dann Wirbel Aufschwemmen. Legen Sie die Aussetzung auf Eis für 5 min. Zentrifuge bei 16.000 x g für 30 min bei 4 ° C, Proteine und Polysaccharide auszufällen.
  6. Als nächstes fügen Sie eine RNAse und Proteinase K zum Beispiel mischen Sie vorsichtig von Hand und vorerst ruhen lassen. Gleichwertigem Umfang von Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (Verhältnis Mischung aus 25:24:1) hinzufügen der Aufhängung werden extrahiert, und mischen Sie sanft mit der hand. Zentrifuge die Vorbereitung für 10 min bei 13.000 x g. Entfernen Sie vorsichtig das Schiff aus der Zentrifuge und beachten Sie die beiden Schichten.
  7. Unten, schwerere Schicht besteht aus Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol und Schmutz extrahiert, und die oberste Schicht ist die wässrige und enthält die DNA. Die wässrige Phase in ein steriles Gefäß legen, Hinzufügen von gleichwertigem Umfang von Isopropanol und sanft zu invertieren, um DNA Niederschlag zu initiieren. Inkubieren Sie die Federung bei Raumtemperatur für 2 h Pellets gereinigte DNA durch Zentrifugation bei 16.000 x g, für 30 min. überstand vorsichtig entfernen, da die gebeizte DNA kann oder nicht an der Unterseite des Schiffes sichtbar sein, und dann in 1 mL der TE-Puffer Aufschwemmen.
  8. Mit einem Spektralphotometer oder DNA/RNA Quantifizierung Fluorimeter, Messen Sie die DNA extrahiert aus der Probe. Die Menge an DNA wird aus der 260 nm Lesung geschätzt. Eine Extinktion Lektüre von 1,0 entspricht 50 µg DNA pro mL Lösung. Wenn die Konzentration für genaue Messwerte zu hoch ist, verdünnen Sie die Aussetzung 1 bis 10 oder 1 bis 100 mit molekularen Grade Wasser.
  9. Die Reinheit der DNA dürfte sich aus dem Verhältnis der Lesung bei 260 nm, bei 280 nm. Einen Wert > 1.7 zeigt relativ reines DNA. Der theoretische Maximalwert ist 2.0.

Bakteriengemeinschaft DNA-Extraktion ist ein Prozess, der durch den DNA aus mehrere Bakterienarten innerhalb einer Gemeinschaft während einer einzigen Extraktionsverfahren gewonnen wird.

Traditionelle Analysen von mikrobiellen Gemeinschaften im Boden haben in der Regel kulturelle Assays, Verwendung von Verdünnung und Plattieren Methodik auf verschiedenen Selektivmedien beteiligt. Viele Bakterien wachsen jedoch schlecht unter Laborbedingungen oder auf die spezifischen Medien Wachstumsbedingungen ausgewählt, d. h. sie können verpasst oder stark unterrepräsentiert.

Vor kurzem hat die Gemeinschaft DNA Extraktion aus bakteriellen Bodenproben für eine umfassendere Auswahl von Bakteriengemeinschaften erlaubt. Dieser Ansatz nicht-Kultur gilt als repräsentativ für die tatsächliche Gemeinschaften als traditioneller Kultur Methoden basieren.

Dieses Video zeigt eine nicht-Kultur-Methode der Bakteriengemeinschaft DNA-Extraktion, gewusst wie: überprüfen die Qualität und Quantität der extrahierten DNA, und entdecken, wie diese DNA genutzt werden kann, um bakterielle Vielfalt untersuchen.

DNA-Extraktion aus dem Boden kann auf zwei Arten durchgeführt werden. Bei der Fraktionierung-Methode werden zunächst Zellen aus der Bodenmatrix vor der Extraktion des genetischen Materials getrennt. Die Probe unterliegt dann aufeinander folgenden Zyklen von mischen und langsam Zentrifugation um intakte Zellen in einem Pellet zu sammeln.

Lysozymes werden dann zu den Zellen, und die Federung inkubiert. Lysozymes sind Enzyme, die bakteriellen Zellwände. Sobald die Zellwandstruktur kompromittiert wurde, kann die DNA dann zur Reinigung befreit. Eine zweite Methode der Gemeinschaft DNA-Extraktion, die in Situ -Methode hat jedoch gezeigt worden, um größere DNA-Konzentration zu erzielen.

Hier ist eine Masse des Bodens mit gleichwertigem Umfang der Tris-EDTA Extraktionspuffer und Glasperlen, kombiniert und gemischte aggressiv, Trennung der Zellen von der Erde-Teilchen zu erleichtern. Ein Waschmittel wird dann hinzugefügt, in der Regel Sodium Dodecyl Sulfat oder SDS und der Probe wird weiter zur Förderung der Lyse der Zellen und Veröffentlichung ihrer Inhalte, einschließlich DNA gemischt.

Inkubation bei hoher Temperatur ist dann verpflichtet, alle übrigen bakteriellen Zellen lysiert. Proben zentrifugiert, und ein Polyethylenglykol-Extraktion und Inkubation erfolgt auf den Überstand um überstürzen sich die DNA, die dann in einem Pellet zentrifugiert wird.

Die DNA ist in TE-Puffer Nukleinsäuretablette und Kalium Acetat um weiter Waschen der DNS Proteine und Polysaccharide, dann Zentrifugation wird durchgeführt, um diese unerwünschten Bestandteilen pellet. Der wässrige überstand mit der DNA wird entfernt und eine Phenol-Chloroform Extraktion und Isopropanol Niederschlag, sauber weiter und konzentrieren sich die DNA ausgesetzt. Nach einer Inkubationszeit von zwei Stunden Zimmertemperatur ist die DNA zentrifugiert und Nukleinsäuretablette in TE-Puffer für die Lagerung bis zur Analyse.

Jetzt sind wir vertraut mit den Konzepten und Prozessen hinter Bakteriengemeinschaft DNA-Extraktion, werfen Sie einen Blick an, wie es im Labor durchgeführt wird.

Um den Vorgang zu starten, 100 g gesiebten Bodens abwiegen. Fügen Sie diese in einen Behälter aus Polypropylen, und fügen Sie 100 mL Extraktionspuffer bestehend aus Tris-Puffer mit EDTA zu fördern die Freisetzung von Bakterien aus der Bodenmatrix, dann schütteln von hand geändert.

Als nächstes wiegen Sie 100 g von Glasperlen, und fügen Sie diese in den Mischbehälter gefüllt. Schütteln Sie die Probe für 5 min mit eine Perle schlagen Gerät oder Handgelenk-Mechanik Shaker. 10 mL 20 % Sodium Dodecyl Sulfat oder SDS, zu der Mischung hinzufügen, dann für eine weitere Minute schütteln. Bei einer hohen Temperatur für 60 min inkubieren.

Die Probe unter separaten 50 mL Röhrchen gleichmäßig zu verteilen, und Zentrifuge für 10 min bei 6.000 x g. Überstand von den Rohren auf einen einzigen sterilen Behälter übertragen. Anschließend wiederholen Sie die Extraktion der Boden Pelletofen wie zuvor beschrieben, mit einem frischen Volume Extraktionspuffer.

Fügen Sie das Gesamtvolumen der verarbeiteten überstand, ein sauber 50-mL-Tube bis halbe Lautstärke gefüllt mit einer Lösung von 30 % Polyethylenglykol und 1,6 M Natriumchlorid. Invertieren der Flaschen mehrmals von hand um zu mischen, und Inkubation bei Raumtemperatur für 2 h Zentrifuge Proben bei 10.000 x g für 20 Minuten um das DNA-pellet.

Entfernen Sie den Überstand von Zentrifugenröhrchen, hinterlässt das teilweise gereinigte Nukleinsäure-Pellet vorsichtig. Hinzugeben Sie 20 mL der TE-Puffer und 1,5 mL 7,5 M Kalium Acetat Lösung für Pellet, dann Wirbel Aufschwemmen. Legen Sie die Aussetzung auf Eis für 5 min. Zentrifuge bei 16.000 x g für 30 min bei 4 ° C, Proteine und Polysaccharide auszufällen.

Als nächstes fügen Sie eine RNAse und Proteinase K zum Beispiel mischen Sie vorsichtig von Hand und vorerst ruhen lassen. Gleichwertigem Umfang von Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol hinzufügen der Aufhängung werden extrahiert, und mischen Sie sanft mit der hand. Zentrifuge die Vorbereitung für 10 min bei 13.000 x g. Entfernen Sie vorsichtig das Schiff aus der Zentrifuge und beachten Sie die beiden Schichten.

Unten, schwerere Schicht besteht aus Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol und Schmutz extrahiert, und die oberste Schicht ist die wässrige und enthält die DNA. Die wässrige Phase in ein steriles Gefäß legen, Hinzufügen von gleichwertigem Umfang von Isopropanol und sanft zu invertieren, um DNA Niederschlag zu initiieren. Inkubieren Sie die Federung bei Raumtemperatur für 2 h Pellets gereinigte DNA durch Zentrifugation bei 16.000 x g, für 30 min. überstand vorsichtig entfernen, da die gebeizte DNA kann oder nicht an der Unterseite des Schiffes sichtbar sein, und dann in 1 mL der TE-Puffer Aufschwemmen.

Mit einem Spektralphotometer oder DNA/RNA Quantifizierung Fluorimeter, Messen Sie die DNA extrahiert aus der Probe. DNA/RNA Fluorimeters Ausgang wird DNA-Ebenen in Einheiten von Nanogramm pro Milliliter. Wenn die Konzentration für genaue Messwerte zu hoch ist, verdünnen Sie die Aussetzung 1 bis 10 oder 1 bis 100 mit molekularen Grade Wasser.

Das gewonnene DNA aus einer Bakteriengemeinschaft ist, kann dies in einer Reihe von verschiedenen Möglichkeiten genutzt werden. Einige dieser Anwendungen werden hier untersucht.

Spectrophotographic Analysen der DNA extrahiert aus DNA-Community bieten einen Einblick in die Anzahl der bakteriellen Zellen in einem bestimmten Bodenprobe. Die geschätzte Menge der DNA in ng pro mL Lösung kann auf das Gesamtvolumen der DNA extrahiert in Lösung, um den Gesamtbetrag der DNA pro g des Bodens geben zurückzuführen. Wissen um den theoretischen Wert von DNA pro Zelle, kann die Gesamtzahl der Zellen pro g Boden berechnet werden.

Weitere gezielte Anwendungen von Bakteriengemeinschaften extrahierte DNA PCR um festzustellen, ob eine bestimmte Sorte innerhalb der Gemeinschaft vorhanden ist unterworfen werden kann. Wissenschaftler können z. B. ermitteln, ob Bodenproben spezifische Krankheitserreger, wie Clostridium Perfringens oder Bacillus Anthracisenthalten.

Zu guter Letzt können um ein umfassenderes Verständnis von Bakterien in einer Gemeinschaft zu erhalten, DNA-Proben ausgesetzt werden "Omic" und bioinformatische Charakterisierung, die eine tiefer gehende Analyse der ursprünglichen Bakterien in der Probe ermöglichen. "Omics" beschreibt eine Reihe von Technologien, die Rollen, Beziehungen und Aktionen von Molekülen in Organismen oder Gemeinden zu erkunden. Dazu gehören die Studien der Gene und ihrer Funktion oder "Genomik", und "Proteomics", die Untersuchung von Proteinen und ihre Rollen. Sequenzierung der 16 s RNA aus Proben kann beispielsweise eine metagenomische Bestimmung der spezifischen Arten innerhalb der Gemeinschaft, so dass eine genauere Schätzung der Vielfalt zulassen. Dieser Ansatz kann geben Wissenschaftler ein besseres Verständnis für die Spezies Make-up einer Gemeinschaft, und welche Rolle können sie Unternehmen.

Sie sah nur Jupiters Einführung in Bakteriengemeinschaft DNA-Extraktion. Sie sollten jetzt verstehen, wie zum Extrahieren von DNA aus einer bakteriellen Gemeinschaft, wie Sie die Qualität dieser DNA und wie diese DNA für Untersuchungen der Bakteriengemeinschaft Komposition verwendet werden kann. Danke fürs Zuschauen!

Applications and Summary

Gemeinschaft DNA von den Kolonien kultiviert oder entzogene Boden Bioinformatik und "Omic" Ansätze, mit denen für die Charakterisierung der ursprünglichen Bakterien in der Probe unterzogen werden kann. Die Omic Ansätze beinhalten Metagenomik – Bestimmung der "who" innerhalb der Gemeinschaft über 16 s rRNA Sequenzierung ist. Dies gibt eine Schätzung der Vielfalt innerhalb der Gemeinschaft.

Die Anzahl der Bakterienzellen in der ursprünglichen Bodenprobe kann auch berechnet werden. Gemeinschaft DNA extrahiert aus einem Boden und durch spektroskopische Analysen quantifiziert. Die geschätzte Menge der DNA gemessen als µg DNA pro mL Lösung bezieht sich zurück auf das Gesamtvolumen der DNA extrahiert in Lösung, einen Gesamtbetrag von DNA pro g des Bodens zu geben. Durch die Kenntnis des theoretischen Wertes von DNA pro Zelle, kann die Gesamtzahl der Zellen pro g Boden berechnet werden.

Beispiel

Ein Boden hat 0,12 µg DNA pro g des Bodens

Wenn jede Zelle 4 besitzt fg der DNA

Equation 1

Die extrahierten Gemeinschaft DNA kann PCR Analyse spezifische Primer verwenden, um festzustellen, ob eine bestimmte Sorte innerhalb der Gemeinschaft vorliegt ausgesetzt werden. Beispiele hierfür sind bestimmte bakterielle Krankheitserreger wie Clostridium Perfringens oder Bacillus Anthracis.

(1) Bakteriengemeinschaft DNA-Extraktion

  1. Um den Vorgang zu starten, 100 g gesiebten Bodens abwiegen. Fügen Sie diese in einen Behälter aus Polypropylen, und fügen Sie 100 mL Extraktionspuffer bestehend aus Tris-Puffer mit EDTA zu fördern die Freisetzung von Bakterien aus der Bodenmatrix, dann schütteln von hand geändert.
  2. Als nächstes wiegen Sie 100 g von Glasperlen, und fügen Sie diese in den Mischbehälter gefüllt. Agitieren Sie die Probe für 5 min mit eine Perle schlagen Gerät oder Handgelenk-Mechanik Shaker für 15 min. Fügen Sie 10 mL 20 % Sodium Dodecyl Sulfat oder SDS, die Mischung dann für eine weitere Minute schütteln. Bei einer hohen Temperatur von 60-65 ° C für 60 min inkubieren.
  3. Gleichmäßig verteilen die Probe unter separaten 50-mL-Tuben und Zentrifuge für 10 min bei 6.000 x g. Überstand aus den Rohren auf einen einzigen sterilen Behälter übertragen. Anschließend wiederholen Sie die Extraktion der Boden Pelletofen wie zuvor beschrieben, mit einem frischen Volume Extraktionspuffer.
  4. Fügen Sie das Gesamtvolumen der verarbeiteten überstand, etwa 200 mL, ein sauber 50-mL-Tube bis halbe Lautstärke gefüllt mit einer Lösung von 30 % Polyethylenglykol und 1,6 M Natriumchlorid. Invertieren der Flaschen mehrmals von hand um zu mischen, und Inkubation bei Raumtemperatur für 2 h Zentrifuge Proben bei 10.000 x g für 20 Minuten um das DNA-pellet.
  5. Entfernen Sie den Überstand von Zentrifugenröhrchen, hinterlässt das teilweise gereinigte Nukleinsäure-Pellet vorsichtig. Hinzugeben Sie 20 mL der TE-Puffer und 1,5 mL 7,5 M Kalium Acetat Lösung für Pellet, dann Wirbel Aufschwemmen. Legen Sie die Aussetzung auf Eis für 5 min. Zentrifuge bei 16.000 x g für 30 min bei 4 ° C, Proteine und Polysaccharide auszufällen.
  6. Als nächstes fügen Sie eine RNAse und Proteinase K zum Beispiel mischen Sie vorsichtig von Hand und vorerst ruhen lassen. Gleichwertigem Umfang von Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (Verhältnis Mischung aus 25:24:1) hinzufügen der Aufhängung werden extrahiert, und mischen Sie sanft mit der hand. Zentrifuge die Vorbereitung für 10 min bei 13.000 x g. Entfernen Sie vorsichtig das Schiff aus der Zentrifuge und beachten Sie die beiden Schichten.
  7. Unten, schwerere Schicht besteht aus Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol und Schmutz extrahiert, und die oberste Schicht ist die wässrige und enthält die DNA. Die wässrige Phase in ein steriles Gefäß legen, Hinzufügen von gleichwertigem Umfang von Isopropanol und sanft zu invertieren, um DNA Niederschlag zu initiieren. Inkubieren Sie die Federung bei Raumtemperatur für 2 h Pellets gereinigte DNA durch Zentrifugation bei 16.000 x g, für 30 min. überstand vorsichtig entfernen, da die gebeizte DNA kann oder nicht an der Unterseite des Schiffes sichtbar sein, und dann in 1 mL der TE-Puffer Aufschwemmen.
  8. Mit einem Spektralphotometer oder DNA/RNA Quantifizierung Fluorimeter, Messen Sie die DNA extrahiert aus der Probe. Die Menge an DNA wird aus der 260 nm Lesung geschätzt. Eine Extinktion Lektüre von 1,0 entspricht 50 µg DNA pro mL Lösung. Wenn die Konzentration für genaue Messwerte zu hoch ist, verdünnen Sie die Aussetzung 1 bis 10 oder 1 bis 100 mit molekularen Grade Wasser.
  9. Die Reinheit der DNA dürfte sich aus dem Verhältnis der Lesung bei 260 nm, bei 280 nm. Einen Wert > 1.7 zeigt relativ reines DNA. Der theoretische Maximalwert ist 2.0.

Bakteriengemeinschaft DNA-Extraktion ist ein Prozess, der durch den DNA aus mehrere Bakterienarten innerhalb einer Gemeinschaft während einer einzigen Extraktionsverfahren gewonnen wird.

Traditionelle Analysen von mikrobiellen Gemeinschaften im Boden haben in der Regel kulturelle Assays, Verwendung von Verdünnung und Plattieren Methodik auf verschiedenen Selektivmedien beteiligt. Viele Bakterien wachsen jedoch schlecht unter Laborbedingungen oder auf die spezifischen Medien Wachstumsbedingungen ausgewählt, d. h. sie können verpasst oder stark unterrepräsentiert.

Vor kurzem hat die Gemeinschaft DNA Extraktion aus bakteriellen Bodenproben für eine umfassendere Auswahl von Bakteriengemeinschaften erlaubt. Dieser Ansatz nicht-Kultur gilt als repräsentativ für die tatsächliche Gemeinschaften als traditioneller Kultur Methoden basieren.

Dieses Video zeigt eine nicht-Kultur-Methode der Bakteriengemeinschaft DNA-Extraktion, gewusst wie: überprüfen die Qualität und Quantität der extrahierten DNA, und entdecken, wie diese DNA genutzt werden kann, um bakterielle Vielfalt untersuchen.

DNA-Extraktion aus dem Boden kann auf zwei Arten durchgeführt werden. Bei der Fraktionierung-Methode werden zunächst Zellen aus der Bodenmatrix vor der Extraktion des genetischen Materials getrennt. Die Probe unterliegt dann aufeinander folgenden Zyklen von mischen und langsam Zentrifugation um intakte Zellen in einem Pellet zu sammeln.

Lysozymes werden dann zu den Zellen, und die Federung inkubiert. Lysozymes sind Enzyme, die bakteriellen Zellwände. Sobald die Zellwandstruktur kompromittiert wurde, kann die DNA dann zur Reinigung befreit. Eine zweite Methode der Gemeinschaft DNA-Extraktion, die in Situ -Methode hat jedoch gezeigt worden, um größere DNA-Konzentration zu erzielen.

Hier ist eine Masse des Bodens mit gleichwertigem Umfang der Tris-EDTA Extraktionspuffer und Glasperlen, kombiniert und gemischte aggressiv, Trennung der Zellen von der Erde-Teilchen zu erleichtern. Ein Waschmittel wird dann hinzugefügt, in der Regel Sodium Dodecyl Sulfat oder SDS und der Probe wird weiter zur Förderung der Lyse der Zellen und Veröffentlichung ihrer Inhalte, einschließlich DNA gemischt.

Inkubation bei hoher Temperatur ist dann verpflichtet, alle übrigen bakteriellen Zellen lysiert. Proben zentrifugiert, und ein Polyethylenglykol-Extraktion und Inkubation erfolgt auf den Überstand um überstürzen sich die DNA, die dann in einem Pellet zentrifugiert wird.

Die DNA ist in TE-Puffer Nukleinsäuretablette und Kalium Acetat um weiter Waschen der DNS Proteine und Polysaccharide, dann Zentrifugation wird durchgeführt, um diese unerwünschten Bestandteilen pellet. Der wässrige überstand mit der DNA wird entfernt und eine Phenol-Chloroform Extraktion und Isopropanol Niederschlag, sauber weiter und konzentrieren sich die DNA ausgesetzt. Nach einer Inkubationszeit von zwei Stunden Zimmertemperatur ist die DNA zentrifugiert und Nukleinsäuretablette in TE-Puffer für die Lagerung bis zur Analyse.

Jetzt sind wir vertraut mit den Konzepten und Prozessen hinter Bakteriengemeinschaft DNA-Extraktion, werfen Sie einen Blick an, wie es im Labor durchgeführt wird.

Um den Vorgang zu starten, 100 g gesiebten Bodens abwiegen. Fügen Sie diese in einen Behälter aus Polypropylen, und fügen Sie 100 mL Extraktionspuffer bestehend aus Tris-Puffer mit EDTA zu fördern die Freisetzung von Bakterien aus der Bodenmatrix, dann schütteln von hand geändert.

Als nächstes wiegen Sie 100 g von Glasperlen, und fügen Sie diese in den Mischbehälter gefüllt. Schütteln Sie die Probe für 5 min mit eine Perle schlagen Gerät oder Handgelenk-Mechanik Shaker. 10 mL 20 % Sodium Dodecyl Sulfat oder SDS, zu der Mischung hinzufügen, dann für eine weitere Minute schütteln. Bei einer hohen Temperatur für 60 min inkubieren.

Die Probe unter separaten 50 mL Röhrchen gleichmäßig zu verteilen, und Zentrifuge für 10 min bei 6.000 x g. Überstand von den Rohren auf einen einzigen sterilen Behälter übertragen. Anschließend wiederholen Sie die Extraktion der Boden Pelletofen wie zuvor beschrieben, mit einem frischen Volume Extraktionspuffer.

Fügen Sie das Gesamtvolumen der verarbeiteten überstand, ein sauber 50-mL-Tube bis halbe Lautstärke gefüllt mit einer Lösung von 30 % Polyethylenglykol und 1,6 M Natriumchlorid. Invertieren der Flaschen mehrmals von hand um zu mischen, und Inkubation bei Raumtemperatur für 2 h Zentrifuge Proben bei 10.000 x g für 20 Minuten um das DNA-pellet.

Entfernen Sie den Überstand von Zentrifugenröhrchen, hinterlässt das teilweise gereinigte Nukleinsäure-Pellet vorsichtig. Hinzugeben Sie 20 mL der TE-Puffer und 1,5 mL 7,5 M Kalium Acetat Lösung für Pellet, dann Wirbel Aufschwemmen. Legen Sie die Aussetzung auf Eis für 5 min. Zentrifuge bei 16.000 x g für 30 min bei 4 ° C, Proteine und Polysaccharide auszufällen.

Als nächstes fügen Sie eine RNAse und Proteinase K zum Beispiel mischen Sie vorsichtig von Hand und vorerst ruhen lassen. Gleichwertigem Umfang von Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol hinzufügen der Aufhängung werden extrahiert, und mischen Sie sanft mit der hand. Zentrifuge die Vorbereitung für 10 min bei 13.000 x g. Entfernen Sie vorsichtig das Schiff aus der Zentrifuge und beachten Sie die beiden Schichten.

Unten, schwerere Schicht besteht aus Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol und Schmutz extrahiert, und die oberste Schicht ist die wässrige und enthält die DNA. Die wässrige Phase in ein steriles Gefäß legen, Hinzufügen von gleichwertigem Umfang von Isopropanol und sanft zu invertieren, um DNA Niederschlag zu initiieren. Inkubieren Sie die Federung bei Raumtemperatur für 2 h Pellets gereinigte DNA durch Zentrifugation bei 16.000 x g, für 30 min. überstand vorsichtig entfernen, da die gebeizte DNA kann oder nicht an der Unterseite des Schiffes sichtbar sein, und dann in 1 mL der TE-Puffer Aufschwemmen.

Mit einem Spektralphotometer oder DNA/RNA Quantifizierung Fluorimeter, Messen Sie die DNA extrahiert aus der Probe. DNA/RNA Fluorimeters Ausgang wird DNA-Ebenen in Einheiten von Nanogramm pro Milliliter. Wenn die Konzentration für genaue Messwerte zu hoch ist, verdünnen Sie die Aussetzung 1 bis 10 oder 1 bis 100 mit molekularen Grade Wasser.

Das gewonnene DNA aus einer Bakteriengemeinschaft ist, kann dies in einer Reihe von verschiedenen Möglichkeiten genutzt werden. Einige dieser Anwendungen werden hier untersucht.

Spectrophotographic Analysen der DNA extrahiert aus DNA-Community bieten einen Einblick in die Anzahl der bakteriellen Zellen in einem bestimmten Bodenprobe. Die geschätzte Menge der DNA in ng pro mL Lösung kann auf das Gesamtvolumen der DNA extrahiert in Lösung, um den Gesamtbetrag der DNA pro g des Bodens geben zurückzuführen. Wissen um den theoretischen Wert von DNA pro Zelle, kann die Gesamtzahl der Zellen pro g Boden berechnet werden.

Weitere gezielte Anwendungen von Bakteriengemeinschaften extrahierte DNA PCR um festzustellen, ob eine bestimmte Sorte innerhalb der Gemeinschaft vorhanden ist unterworfen werden kann. Wissenschaftler können z. B. ermitteln, ob Bodenproben spezifische Krankheitserreger, wie Clostridium Perfringens oder Bacillus Anthracisenthalten.

Zu guter Letzt können um ein umfassenderes Verständnis von Bakterien in einer Gemeinschaft zu erhalten, DNA-Proben ausgesetzt werden "Omic" und bioinformatische Charakterisierung, die eine tiefer gehende Analyse der ursprünglichen Bakterien in der Probe ermöglichen. "Omics" beschreibt eine Reihe von Technologien, die Rollen, Beziehungen und Aktionen von Molekülen in Organismen oder Gemeinden zu erkunden. Dazu gehören die Studien der Gene und ihrer Funktion oder "Genomik", und "Proteomics", die Untersuchung von Proteinen und ihre Rollen. Sequenzierung der 16 s RNA aus Proben kann beispielsweise eine metagenomische Bestimmung der spezifischen Arten innerhalb der Gemeinschaft, so dass eine genauere Schätzung der Vielfalt zulassen. Dieser Ansatz kann geben Wissenschaftler ein besseres Verständnis für die Spezies Make-up einer Gemeinschaft, und welche Rolle können sie Unternehmen.

Sie sah nur Jupiters Einführung in Bakteriengemeinschaft DNA-Extraktion. Sie sollten jetzt verstehen, wie zum Extrahieren von DNA aus einer bakteriellen Gemeinschaft, wie Sie die Qualität dieser DNA und wie diese DNA für Untersuchungen der Bakteriengemeinschaft Komposition verwendet werden kann. Danke fürs Zuschauen!

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