整个装载原位杂交

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Advanced Biology collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

整个装载原位杂交技术 (WMISH) 是一种常用的技术,用于可视化表达 RNAs 在胚胎的位置。在此过程中,人工合成的 RNA 探针互补是第一次绑定,或"杂交,"对靶基因的转录。免疫组织化学染色或荧光然后用于检测这些 RNA 杂交,揭示基因表达的时空格局。不同于传统原位杂交技术,这需要薄切片的图像将需要计算重新组装,整个装载技术允许基因表达模式,以评估对整个胚胎或结构。

这个视频将介绍整个装载染色和细节关键程序性步骤,包括探头设计和生产,胚胎固定和染色后, 杂交信号检测的基本概念。然后,观众将学习关于如何发育生物学家正在将 WMISH 应用到当前的调查研究。

Cite this Video | Reprints and Permissions

JoVE Science Education Database. 发育生物学精要. 整个装载原位杂交. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

整个装载原位杂交技术是一项强大的技术,使科学家们明白了胚胎发育的分子基础。"整体 — — 登上"表示,将使用整个胚胎,而不仅仅是组织切片。"原位"是拉丁文短语意义""立场。而最后,"杂交"指对有机体的细胞内 mRNA 转录合成 RNA 分子互补结合。

这个视频将演示过程、 预期的结果和所选应用程序的这项技术,可以更好地了解发育障碍。

胚胎发育过程潜在的生物形态发生的基因表达在时间上和空间上限制模式。

综合产生的 RNA 探针,称为 riboprobes,用于检测基因的互补结合。Riboprobes 被带有特殊核苷酸包含"半抗原,"如二硝基苯酚、 生物素或 digoxygenin。半抗原可引起免疫反应时附加到较大的分子的分子,因此抗体结合的目标。这些检测被抗体与酶,如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶,催化的化学反应可以放置荧光或彩色的染料。

传统原位杂交技术需要一个胚胎切片准备促进内部结构的检测。因此,整个有机体的基因表达完整的评估将需要重建从 5-6 μ m 组织切片的计算机软件的帮助。然而,随着整体安装技术的发展,可以获得更大的距离,在整个胚胎的基因表达分析。

后看整个装载原位杂交,让我们去通过一步一步的实验协议背后的原则。

在此过程中的第一步涉及到目标序列的模式生物进行调查鉴定。DNA 序列的目标然后是使用含有 RNA 聚合酶启动序列的引物 pcr 扩增的。扩增的 DNA 模板现在被转录在体外与半抗原标记的核苷酸。这半抗原标记 riboprobe 现为杂交一步做好准备。

胚胎已准备通过固定与甲醛交联试剂,稳定蛋白质和核酸是防止杂交。之后固定,甲醛是用磷酸盐缓冲液含有极少量的补间的洗涤剂清洗胚胎多次被清拆。要移除细胞脂质和便利探针渗透到组织,胚胎脱水的甲醇洗、 等级序列中例如: 25%、 50%、 75%、 100%甲醇。胚胎可以保存一个月 100%甲醇 (或更多) 在-20 ° c。

为了准备杂交胚胎,必须通过逐步减少每次洗涤的甲醇与甲醇洗一分级系列水化他们。胚胎然后消化蛋白酶便于 riboprobe 到组织的扩散。标记的 riboprobe 添加到胚胎并进行杂交。

杂交后洗进行删除非特异性杂交。核酸酶 A T1 添加删除不完全杂交探针由消化单链 RNA。使用绑定半抗原标记 riboprobes 抗体酶共轭,检测到杂交的探针。正如前面提到的像碱性磷酸酶的酶共轭到半抗原特异性抗体和检测通过添加酶底物来引起颜色的变化。反应产物形成标记位置的表达的 mRNA,暗紫色沉淀,如本示例所示。

现在,你知道如何做整个装载原位杂交技术,让我们看看一些技术的应用。

整个装载原位杂交技术被用于帮助科学家解决致命蚊子传染的疾病,如疟疾、 登革热和西尼罗河病。通过表征蚊子滋生和发展有关的基因,可能到更好的目标携带疾病蚊子设计新的生物或化学杀虫剂。

这种技术的另一个应用程序涉及到与暴露于致畸形物或代理,干扰胎儿发育有关的基因表达模式变化的表征。

在这里,整个装载原位杂交技术用于在斑马鱼胎儿酒精综合征模型的标识的基因的表达模式改变后暴露于酒精。这可以帮助发展的疗法来减轻子宫内酒精暴露的后果。

整个装载原位杂交技术也可以用于验证与先天性疾病相关联的表型变化。与 Bardet Biedl 综合征相关的突变引入斑马鱼胚胎通过综合产生的突变基因。在定义的时间段后, 胚胎分为组基于缺陷的严重程度。可视化表达的基因的突变基因下游被用来验证表型变化。因此,整个装载原位杂交技术在表型得分结合有助于更好地了解潜在的发育缺陷的特异性突变的作用。

你刚看了朱庇特的视频在整个装载原位杂交。这种技术是一种强大的工具,使内有机体的基因表达的精确时间和空间表征。整个装载原位杂交技术目前用于生成图谱基因表达模式发展中大量的模式生物。这些研究可能有助于治疗人类疾病,包括癌症新疗法的发展。谢谢观赏 !

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

To watch full video, login or sign up!
If your institution is subscribed to the
Developmental Biology
section, you can access that content off-site by login or signing up with your institutional email.
Sign In with Shibboleth

or

We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

RECOMMEND JoVE

Applications