膜联蛋白 V 和碘化丙啶标签

Cell Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Advanced Biology collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

染色膜联蛋白 V 和丙啶 (PI) 碘为研究者提供了一种方法来识别不同类型的细胞死亡 — — 坏死或凋亡。这项技术依赖于两个组件。第一,膜联蛋白 V,是蛋白质结合某些磷脂称为 phosphatidylserines,通常只发生在细胞膜内,面向细胞质的小叶而成为"翻"到外单张凋亡早期阶段的。第二部分是 DNA 结合染料分子 PI,只能输入单元格时其膜破裂 — — 坏死和晚期凋亡的特点。

视频本文开头审查膜联蛋白 V 和 PI 染色,背后的概念并强调的染色如何鉴别模式可以用来区分细胞下不同死亡通路前进。然后,我们审查广义的协议,这种技术,其次是如何研究人员当前正在使用膜联蛋白 V 和 PI 染色更好地了解细胞死亡的描述。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 细胞生物学精要. 膜联蛋白 V 和碘化丙啶标签. JoVE, Cambridge, MA, (2018).

膜联蛋白 V 和丙啶 (PI) 碘标记的细胞是一种技术用来识别细胞死亡,并区分其不同的途径: 细胞凋亡或程序性细胞死亡和坏死。细胞经历明显的形态学变化,根据通路。通过识别导致细胞进行细胞凋亡或坏死的具体条件,科学家获得洞察细胞生理和病理生理的疾病。膜联蛋白 V 和 PI 标签,其次是流式细胞术,已成为对细胞死亡的类型进行分类的最有效方法之一。

今天,我们将描述这种测定方法是如何帮助在鉴定中的细胞死亡通路,如何执行这项技术和一些令人兴奋的例子实验,使用此方法来回答细胞生物学领域的重要问题。

首先,让我们看看背后膜联蛋白 V 和 PI 染色的原则。

正如前面提到的凋亡细胞表现出鲜明的形态特征。这些包括细胞收缩膜起泡、 核碎裂、 凋亡小体的外观。此外后诱导细胞凋亡, — — 那就是,早期凋亡阶段 — — 某些特征的变化出现在膜上。正常的细胞膜的内在的宣传册上有所有的磷脂酰丝氨酸或 PS 残留。然而,在早期凋亡细胞的这些 PS 残留一些都安置到外表面 — — 但如何?

要理解这一点,让我们后退一步。在细胞凋亡,众所周知胞浆半胱氨酸蛋白酶被激活。这些酶反过来激活一种称为混杂的膜结合酶。混杂"挤"细胞膜移位 PS 残留物的细胞质一侧的外表面。相比之下,在坏死 PS 期间残留保持他们在哪,但膜本身破裂。膜联蛋白 V 和 PI 标签利用这些差异在膜变化的两种类型的细胞死亡。

膜联蛋白 V 共轭用荧光染料,荧光素异硫氰酸酯等 — — 俗称 FITC — — 为 PS,是膜防渗、 天然配体,因此很容易标识早期凋亡细胞被绑定到外部邮编:然而,膜破裂,发生坏死和也期间后期的细胞凋亡,膜联蛋白后也可以绑定到 PS 上内面和产生误报。

若要避免此问题,科学家使用 PI。这种 DNA 结合染料分子膜防渗,又只能输入一个单元格时,膜破裂。因此,如果一个单元格是唯一膜联蛋白染色它是早期凋亡,而是 PI 和膜联蛋白染色的细胞可能是坏死或晚期凋亡。

既然你已经学会了这种测定方法,让我们去通过染色和分析细胞死亡程序背后的基本原则。

第一,细胞收获和离心速度低,以防止任何形态的中断,并在如磷酸盐缓冲液,也被称为 PBS 缓冲液生理冲洗再悬浮。之后另一个离心步骤,再悬浮细胞中膜联蛋白 V 含钙,是有必要的因为膜联蛋白绑定到诗篇 Annexin V 共轭与 FITC 的绑定缓冲区然后添加到解决方案中,在室温下在黑暗中,使膜联蛋白和 PS 协会孵化的。在接下来的步骤中,PI 是直接添加到膜联蛋白染色细胞液和孵化在黑暗中。孵化后细胞是用离心法在 PBS 洗,用缓冲液冲洗,并存放于冰。现在他们准备进行分析。

流式细胞仪,荧光从捕获数据单一细胞悬浮在流体流的基于激光技术,分析了荧光细胞活性。荧光校准使用细胞分别与每个染料染色后, 获得数据从双被染色的细胞。荧光信号的细胞的人口从用于创建一块膜联蛋白绑定 FITC 强度对数 x 轴和对数 y 轴上的 PI 上的绘制。膜联蛋白 FITC 正面和负面的 PI 将聚类的情节,右下方代表早期凋亡细胞,和膜联蛋白 FITC 和 PI 细胞双重肯定将出现在右上角,代表晚凋亡或坏死细胞的细胞。仍未染色或无意义地染色膜联蛋白和 PI 的细胞是活细胞。

既然你现在知道为什么细胞生物学家依靠这种技术来研究细胞死亡,我们为什么不审查的一些应用。

使用此过程,科学家们可以按照哪些细胞内的蛋白质参与细胞凋亡。在这个视频中,研究人员分析了顺铂的抗癌药物,对正常肾细胞来看是否它诱导细胞凋亡的影响。一组单元格转导,过度表达的酶蛋白激酶 C 活性形式或 PKC,和另一套转导与非功能性的形式 — — 显性负 PKC。随着时间推移,凋亡细胞表达 PKC 和联合顺铂治疗但表示非活动占主导地位的消极 PKC 的细胞抗凋亡,表明这种酶顺铂诱导的细胞凋亡途径中的关键球员。

研究人员还使用这些污渍测试特定的 T 细胞的细胞毒性潜力。细胞毒性 T 细胞可以识别特定的膜蛋白上它的靶细胞,并诱导其死亡后绑定到它。在这里,研究人员孵化抗原特异性 T 细胞与靶肿瘤细胞和膜联蛋白 V,然后由 T 细胞参与观察诱导肿瘤细胞凋亡。流流式细胞术数据显示的百分比目标细胞死亡中的存在和细胞毒性 T 细胞缺乏。

最后,科学家们使用此方法评价基因分娩后的细胞活力。在这种情况下,研究人员想要评估后 nucleofection 细胞生存 — — 一种方法,使用化学品和外加的电场的组合来创建瞬态毛孔里细胞和核膜,从而促进基因传递。通过使用膜联蛋白 V 再加上一种染料称为 7 aminoactinomycin D 或 7-反倾销协定 》,其中,类似于 PI 将绑定到 DNA,他们表明,nucleofection 造成低细胞死亡的细胞凋亡或坏死。

你刚看了朱庇特的视频上膜联蛋白 V 和 PI 标签。在这个视频中,简要地讨论凋亡和坏死细胞的特点,审查这种方法背后的原则,看着这一广义的程序常用的技术,并预览某些应用程序。鉴于理解如何不同细胞的重要性在不同条件下,膜联蛋白 V 和 PI 标签下的模作为一种重要的工具为服务细胞生物学家感兴趣这种现象。一如既往,感谢您收看 !

A subscription to JoVE is required to view this article.
You will only be able to see the first 20 seconds.

RECOMMEND JoVE

Applications