Het analyseren van genexpressie van Marine microbiële gemeenschappen met behulp van het milieu transcriptomics
Summary
We presenteren een methode voor het genereren van cDNA van milieu-mRNA. In het algemeen, totaal RNA eerste is verzameld uit de omgeving, is rRNA selectief verwijderd, mRNA wordt selectief versterkt, en cDNA gesynthetiseerd uit de verrijkte mRNA zwembad is gesequenced. Herstelde sequenties kunnen worden geannoteerd met behulp van standaard bioinformatica technieken om de uitdrukking genen te identificeren.
Abstract
Analoog aan metagenomics, milieu transcriptomics (metatranscriptomics) haalt en sequenties milieu-mRNA's van een microbiële assemblage zonder voorafgaande kennis van wat genen van de gemeenschap zou kunnen uiten. Zo biedt de meest onpartijdige perspectief op gemeenschap genexpressie<em> In situ</em>. Milieu-transcriptomics protocollen zijn technisch moeilijk omdat prokaryotische mRNA's over het algemeen niet de poly (A) staarten dat isolatie maken van eukaryotische berichten relatief eenvoudig<sup> 1</sup> En vanwege de relatief korte half leven van mRNA's<sup> 2</sup>. Daarnaast mRNA's zijn veel minder overvloedig zijn dan rRNAs in totaal RNA extracten, waardoor een rRNA achtergrond vaak overweldigt mRNA signalen. Echter, technieken voor het overwinnen van een aantal van deze problemen recent ontwikkeld. Een procedure voor de analyse van de milieu transcriptomes door het creëren van kloon bibliotheken met behulp van willekeurige primers voor reverse-transcriptie en milieu-mRNA's te versterken is onlangs beschreven werd succesvol in twee verschillende natuurlijke omgevingen, maar de resultaten zijn vertekend door selectie van de willekeurige primers gebruikt om de cDNA synthese te starten<sup> 3</sup>. Advances in lineaire versterking van mRNA overbodig voor willekeurige primers in de amplificatiestap en maken het mogelijk om minder uitgangsmateriaal gebruiken het verminderen van de inzameling en verwerking de tijd van de monsters en daarmee het minimaliseren van RNA degradatie<sup> 4</sup>.<em> In vitro</em> Transcriptie methoden voor het versterken van mRNA te betrekken polyadenylating het mRNA en voorzien van een T7 promotor op het 3 einde van het transcript. Amplified RNA (ARNA) kunnen dan worden omgezet in cDNA verdubbelen met behulp van willekeurige hexameren en direct gesequenced door pyrosequencing<sup> 5</sup>. Een eerste gebruik van deze methode op het station ALOHA laten zien dat het nut voor het karakteriseren van microbiële gemeenschap genexpressie<sup> 6</sup>.
Protocol
Discussion
Het onderzoek van genexpressie door natuurlijke microbiële gemeenschappen is gemeengoed geworden in de afgelopen jaren als een middel om de ecologische rollen en functies van micro-organismen te verkennen. Gebruikt in combinatie met de detectie, kwantificering en karakterisering van mariene micro-organismen, kunnen analyses van genexpressie worden gebruikt om de fylogenie koppelen aan de functie in natuurlijke microbiële gemeenschappen. Veel technieken voor het richten van de functionele expressie van genen zich op sp…
Acknowledgements
De financiering werd verstrekt door The Gordon en Betty Moore Foundation subsidies en de National Science Foundation te verlenen MCB-0702125.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | QIAGEN | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega | A7280 |
References
- Liang, P., Pardee, A. B. . Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
- Belasco, J. G., Belasco, J. G., Brawerman, G. Control of messenger RNA stability. , 3-11 (1993).
- Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. . 71 (7), 4121-4121 (2005).
- Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. . Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
- Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. . Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
- Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. . Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
- Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. . Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).
