ניתוח ביטוי גנים מקהילות מיקרוביאלית ימית באמצעות Transcriptomics הסביבה
Summary
אנו מציגים שיטה להפקת cDNA מ-mRNA הסביבה. באופן כללי, הכולל RNA נאסף הראשון הסביבה, rRNA מוסר סלקטיבי, mRNA מוגבר באופן סלקטיבי, ועל cDNA מסונתז ממאגר mRNA מועשר הוא רצף. רצפים ששוחזרו ניתן להוסיף הערות באמצעות תקן טכניקות ביואינפורמטיקה כדי לזהות את הגנים לידי ביטוי.
Abstract
מקביל metagenomics, transcriptomics סביבתיים (metatranscriptomics) מאחזר רצפים mRNAs סביבתיים מתוך מכלול של חיידקים ללא ידיעה מוקדמת של מה הגנים הקהילה יכול להיות להביע. כך הוא מספק את הפרספקטיבה משוחדת ביותר על ביטוי גנים הקהילה<em> באתרו</em>. הסביבה פרוטוקולי transcriptomics קשה מבחינה טכנית מאז mRNAs פרוקריוטים בדרך כלל חוסר poly (A) זנבות שהופכים הבידוד של הודעות אוקריוטים פשוטה יחסית<sup> 1</sup> ובגלל מחצית חיים קצר יחסית mRNAs<sup> 2</sup>. בנוסף, mRNAs הרבה פחות בשפע מאשר rRNAs בסך הכל תמציות RNA, ובכך רקע rRNA לעתים קרובות גוברת אותות ה-mRNA. עם זאת, טכניקות להתגבר על חלק מן הקשיים הללו לאחרונה פותחו. הליך לניתוח transcriptomes הסביבה על ידי יצירת ספריות שיבוט באמצעות primers אקראי הפוכה לתמלל ולהגביר mRNAs הסביבה תוארה לאחרונה הצליחה בשתי סביבות טבעיות שונות, אבל התוצאות היו מוטים על ידי בחירה אקראית של primers משמשות ליצירת סינתזה cDNA<sup> 3</sup>. ההתקדמות הגברה ליניארית של mRNA לייתר את הצורך primers אקראי בשלב הגברה מאפשרים להשתמש בחומר המוצא פחות להקטין את זמן העיבוד איסוף של דגימות ובכך למזער RNA השפלה<sup> 4</sup>.<em> במבחנה</em> שיטות תעתיק של mRNA הגברה לערב polyadenylating ה-mRNA, בשילוב מקדם T7 אל הקצה 3 של התמליל. RNA Amplified (ארנה) אז יכול להיות מומר כפול cDNA תקועים באמצעות hexamers אקראי רצף ישירות על ידי pyrosequencing<sup> 5</sup>. השימוש הראשון בשיטה זו בתחנת אלוהה הפגינו השירות שלה לאפיון חיידקים ביטוי הגן הקהילה<sup> 6</sup>.
Protocol
Discussion
החקירה של ביטוי גנים על ידי קהילות מיקרוביאלי טבעי הפך נפוץ בשנים האחרונות כאמצעי לחקור את התפקידים האקולוגיים פונקציות של מיקרואורגניזמים. בשילוב עם זיהוי, כימות, ואפיון של מיקרואורגניזמים ימיים, ניתוח של ביטוי גנים ניתן להשתמש כדי לקשר תולדות הגזע לתפקד קהילות מי…
Acknowledgements
המימון ניתן על ידי גורדון ובטי מור קרן מענקי הקרן הלאומית למדע מענק MCB-0702125.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | QIAGEN | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega | A7280 |
References
- Liang, P., Pardee, A. B. . Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
- Belasco, J. G., Belasco, J. G., Brawerman, G. Control of messenger RNA stability. , 3-11 (1993).
- Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. . 71 (7), 4121-4121 (2005).
- Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. . Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
- Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. . Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
- Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. . Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
- Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. . Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).
