Il cDNA microarray PtGen2 stato sviluppato per studi di espressione genica in pino loblolly,<em> P. taeda</em>, E altre specie di conifere. Qui mostriamo pre-e post-ibridazione manipolazione e il lavaggio delle tecniche che possono essere utilizzati con questo array per produrre una maggiore coerenza, manufatti ridotti e inferiori sfondi.
PtGen2 è una caratteristica del DNA microarray 26.496 contenente amplificato EST pino loblolly. La serie è prodotta nel nostro laboratorio per l'utilizzo da parte di ricercatori studiando l'espressione genica in specie di pino ed altre conifere. PtGen2 è stato sviluppato come risultato degli sforzi gene nostra scoperta in pino loblolly, ed è composto da sequenze identificate principalmente dai tessuti radice, ma anche da ago e staminali. 1,2 PtGen2 è stato testato da ibridare differenti Cy-dye etichettati cDNA bersaglio di conifere , utilizzando sia amplificato e non amplificati modalità di etichettatura indiretti, e anche testato con una serie di condizioni di ibridazione e di lavaggio. Questo video si concentra sulla gestione e l'elaborazione di diapositive prima e dopo la pre-ibridazione, così come dopo ibridazione, con alcune modifiche alle procedure sviluppate in precedenza. 3,4 inclusi anche, in forma di testo unico, sono i protocolli utilizzati per la generazione, l'etichettatura e la pulizia di s cDNA bersaglio, così come informazioni sul software utilizzato per l'elaborazione dei dati a valle.
PtGen2 è stampato con un buffer di stampa proprietario che contiene alte concentrazioni di sale che possono essere difficili da rimuovere completamente. I vetrini vengono lavati prima di una soluzione calda SDS prima di pre-ibridazione. Dopo la pre-ibridazione, le diapositive vengono lavati con vigore in diversi cambiamenti di acqua per completare la rimozione dei sali rimanenti. LifterSlips ™ sono quindi puliti e posizionati sul diapositive e cDNA marcato è attentamente caricati sul microarray per mezzo di un'azione capillare che prevede anche la distribuzione del campione lungo la diapositiva e riduce la possibilità di incorporazione bolla. Ibridazione degli obiettivi alla matrice avviene a 48 ° C in condizioni di elevata umidità. Dopo l'ibridazione, una serie di lavaggi standard sono fatto a 53 ° C e temperatura ambiente per tempi prolungati. Elaborazione PtGen2 diapositive utilizzando questa tecnica riduce sale e SDS-derivati artefatti spesso visto quando l'array è un'elaborazione meno rigorosamente. Ibridazione obiettivi derivanti da diverse fonti diverse conifere RNA, questo protocollo di elaborazione prodotto un minor numero di artefatti, sfondo ridotto, e ha fornito una migliore coerenza tra i diversi gruppi sperimentali di array.
PtGen2 è sviluppata di recente, cDNA microarray personalizzati che è stato progettato per essere utilizzato principalmente dalla comunità di ricerca loblolly pino. I risultati preliminari generato finora hanno mostrato l'array di essere un valido strumento nella valutazione degli eventi trascrizionale che si verificano in risposta a stress idrico, così come nel monitoraggio dei cambiamenti che si verificano durante lo sviluppo embrionale in pino marittimo, Pinus pinaster 5,6 Abbiamo inoltre r…
L'etichettatura, ibridazione, e protocolli di lavaggio nel presente documento contiene alcune modifiche a quelli sviluppati in precedenza dal Dr. J. Quackenbush mentre presso l'Institute for Genomic Research (TIGR), il dottor Shawn Levy al Microarray Vanderbilt Shared Resource (VMSR), e il Dr. Rob Alba mentre al Boyce Thompson Institute, (ITV) Cornell University.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma Aldrich | 34959-2.5L | |
50mL Conical Tubes | Other | Falcon™ | 352070 | |
15mL Conical Tubes | Other | Falcon™ | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
Coplin Jar | Wheaton™ | 900520 | ||
Staining Dish & Rack | Other | Wheaton™ | 900200 | |
Albumin from bovine serum (BSA) | Other | Sigma™ | A-9418 | |
PolyA RNA | Invitrogen™ | POLYA.GF | ||
SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen™ | L1014-02 | |
Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
System | ||||
Cy-5 Dye | Reagent | GE™ | PA25001 | |
Cy-3 Dye | Reagent | GE™ | PA23001 | |
LifterSlips™ | Other | Erie Scientific Company™ | 25X601 | |
HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |