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Biology

标准化的制备小鼠肺组织单细胞悬浮液使用gentleMACS Dissociator

doi: 10.3791/1266 Published: July 2, 2009

Summary

游离特定的组织类型的细胞,组织鼓动的具体参数,以获得一个可行的,可培养细胞的高容量。美天旎gentleMACS dissociator优化这个任务简单,实用的协议。在本出版物中使用本仪器对肺组织进行了解释。

Abstract

从组织单细胞悬液的制备细胞研究中的许多实验的重要前提。游离整个器官的过程中,需要在特定的参数,在重现的方式获取大量的活菌。 gentleMACS Dissociator优化这个任务简单,实用的协议。该仪器包含预编程的优化设置的多种组织类型,包括小鼠肺的效率,但温和的分解。在本出版物中使用从小鼠的肺组织gentleMACS Dissociator证明。

Protocol

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若要在无菌条件下,它是建议执行层流罩中的所有步骤。

1。材料

  1. HEPES缓冲液:10毫米HEPES - NaOH溶液pH值7.4,150 mM氯化钠,氯化钾5毫米,1毫米MgCl 2的 ,1.8毫米氯化钙2)
  2. 胶原酶D解决方案:胶原酶D:100毫克/毫升(胶原酶ð> 0.15 U /毫克),在HEPES缓冲
  3. DNA酶我的解决方案:2万U / mL的DNA酶我
  4. 在pH 7.2的PBS缓冲液
  5. PEB的缓冲区:BSA在20部分第1部分股票解决方案autoMACS冲洗液
  6. 组织:从6 / 7周龄成年雌性BALB / C鼠,毗邻器官的肺。
  7. 可选:表面CD11c微珠,MACS MS色谱柱,磁珠隔离从小鼠肺癌的单细胞悬液的树突状细胞的分离器

2。游离的肺组织

  1. 一个Petri菜含有PBS去除红细胞冲洗组织。
  2. 最大为450 mg肺组织转移到一个gentleMACS C管含有4.9 mL的HEPES缓冲。
  3. 加入100μL的胶原酶D溶液的终浓度为2 mg / mL胶原酶D.
  4. 加入10μL的DNA酶高达150毫克的组织(终浓度为40 U / ml的DNA酶我)或20μL的DNA酶我为150-450毫克肺组织(终浓度为80 U / mL的DNA酶我)我的解决方案。
  5. 紧紧贴着C管和附加到gentleMACS Dissociator它。然后运行该程序“m_lung_01”。
  6. 孵育30分钟,在37 ° C,自动旋转或手动转动,每5分钟。
  7. 返回样本gentleMACS Dissociator和运行方案“m_lung_02”。

3。过滤

  1. 准备取代第70微米网状细胞过滤器收集筛选细胞50毫升管。
  2. 第二gentleMACS计划一旦结束,根据分布在管内的样品材料,您可能离心管简单地收集在试管底部的样品材料。
  3. 通过隔膜密封的C管,使用第一个合适的1000μL枪头取出细胞,并将其应用到细胞过滤器。
  4. 5毫升HEPES缓冲液在室温下的细胞滤网清洗。
  5. 一个颗粒细胞在300xg离心10分钟,在50毫升管。
  6. 吸上清,重悬细胞沉淀在你想要的PEB的缓冲量。

第4部分:代表性的成果:

图1
图1。龙gentleMACS™Dissociator分解导致92%的活细胞。死细胞荧光染色,碘化丙啶(PI)(右点图,左点图:没有PI染色)。

图2
图2。使用gentleMACS Dissociator结果在一个可行的白细胞和内皮细胞的高比例对小鼠肺组织分离。派生的单细胞悬液与CD45 - PE,CD146 - FITC或CD31 - FITC染色和流式细胞仪分析。

图2C
表面CD11c - FITC和反mPDCA - 1 - APC检测鼠标的CD11c M - PDCA - 1 +浆区议会,以及表面CD11c 细胞染色图3。小鼠肺组织所得的单细胞悬液。


图4
图4。使用树突状细胞表面CD11c微珠,MiniMACS分离器和两个MS色谱柱的富集。

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Discussion

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在这个视频中,我们引入一个新的小鼠肺组织的分离方法。我们展示的机械和酶治疗肺组织结合,取得了一个可行的白细胞和内皮细胞的高比例。具体来说,组织机械解体取得gentleMACS Dissociator。 gentleMACS彗星管包括一个转子 - 定子系统,它游离在一种温和的方式组织。过程控制仪器的程序设置。这些设置进行了优化,实现高产和细胞活力。派生的单细胞悬液与CD45 - PE,CD146 - FITC或CD31 - FITC染色和流式细胞仪检测白细胞和内皮细胞。在单细胞悬液的树突状细胞染色表面CD11c - FITC和反mPDCA - 1 - APC。此外,从小鼠肺癌单细胞悬液的树突状细胞的富集采用MACS科技:磁标记树突状细胞表面CD11c微珠和分开使用MiniMACS分离器和MS列1,2在一般情况下,结合我们新的解离协议磁性细胞分选代表一个标准化的方法来获得特定的细胞类型,从肺组织。

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Acknowledgments

作者是德国美天旎生物技术公司,雇员。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C Tubes Miltenyi Biotec Order no. 130-093-237 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
gentleMACS™ Starting Kit Miltenyi Biotec Order no. 130-093-235 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ Tube Rotator Miltenyi Biotec Order no. 130-090-753 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-091-222 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-091-376 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
CD11c MicroBeads Miltenyi Biotec Order No. 130-052-001 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx
CD11c-FITC, CD11c-PE Miltenyi Biotec Order no. 130-092-026130-091-830 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx
Anti-mPDCA-1-APC Miltenyi Biotec Order no. 130-091-963 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx
CD146-FITC Miltenyi Biotec Order no. 130-092-026 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx
CD45-PE Miltenyi Biotec Order no. 130-091-610 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx
Propidium Iodide Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-093-233 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx
Art 1000 Reach Pipet Tips Molecular BioProducts Order no. 2079 http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61
http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html

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References

  1. Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
  2. Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
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Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (29), e1266, doi:10.3791/1266 (2009).More

Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (29), e1266, doi:10.3791/1266 (2009).

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