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Biology

Préparation standardisée des suspensions unicellulaires provenant de tissus pulmonaires de la souris en utilisant les dissociateur gentleMACS

doi: 10.3791/1266 Published: July 2, 2009

Summary

Dissocier les cellules de différents types de tissus spécifiques requiert des paramètres spécifiques à l'agitation des tissus pour obtenir un volume élevé de viabilité, de cellules cultivables. Le Miltenyi gentleMACS dissociateur optimise cette tâche avec un simple, protocole pratique. Dans cette publication, l'utilisation de cet appareil sur le tissu pulmonaire est expliqué.

Abstract

La préparation des suspensions unicellulaires à partir des tissus est une condition importante pour de nombreuses expériences dans la recherche cellulaire. Le processus de dissociation des organes entiers nécessite des paramètres spécifiques afin d'obtenir un nombre élevé de cellules viables d'une manière reproductible. Le dissociateur gentleMACS optimise cette tâche avec un simple, protocole pratique. L'instrument contient les paramètres pré-programmés qui sont optimisés pour la dissociation efficace mais douce d'une variété de types de tissus, y compris les poumons de souris. Dans cette publication, l'utilisation de la dissociateur gentleMACS sur le tissu pulmonaire provenant de souris est démontrée.

Protocol

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Pour travailler dans des conditions stériles, il est recommandé d'effectuer toutes les étapes d'une hotte à flux laminaire.

1. Matériaux

  1. Tampon HEPES: 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, NaCl 150 mM, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 1,8 mM CaCl 2)
  2. Collagénase D solution: la collagénase D: 100 mg / mL (collagénase D> 0,15 U / mg), dans du tampon HEPES
  3. DNase I solution: 20000 U / mL de DNase I
  4. Tampon PBS à pH 7,2
  5. PEB tampon: une solution mère de BSA partie dans 20 parties de solution de rinçage autoMACS
  6. Tissus: poumon dérivée du 6 / 7 semaines femelle adulte souris BALB / C, gratuit des organes adjacents.
  7. En option: microbilles CD11c, MACS colonnes MS, séparateur MACS pour l'isolement de cellules dendritiques à partir de poumons de souris des cellules de suspension

2. Dissocier les tissus pulmonaires

  1. Rincez le tissu dans une boîte de Pétri contenant du PBS pour éliminer les érythrocytes.
  2. Transfert d'un maximum de 450 mg tissu pulmonaire à un tube gentleMACS C contenant 4,9 ml de tampon HEPES.
  3. Ajouter 100 uL collagénase solution D à une concentration finale de 2 D. mg / ml de collagénase
  4. Ajouter 10 uL DNase I solution pour jusqu'à 150 mg de tissu (concentration finale de 40 U / ml DNase I) ou 20 uL DNase I pour 150 à 450 mg tissu pulmonaire (concentration finale de 80, je U / mL de DNase).
  5. Bien refermer le tube C et l'attacher sur le dissociateur gentleMACS. Ensuite, exécutez le programme "m_lung_01".
  6. Incuber pendant 30 min à 37 ° C avec rotation automatique ou manuellement tourner toutes les 5 min.
  7. Retour à l'échantillon de dissociateur gentleMACS et exécutez le programme "m_lung_02".

3. Filtration

  1. Préparer un tube de 50 ml pour collecter les cellules filtrées en remplaçant le bouchon avec une passoire 70 um maillage cellulaire.
  2. Une fois le deuxième programme gentleMACS se termine, selon la distribution de matériel d'échantillon dans le tube, vous pouvez le tube à centrifuger brièvement pour ramasser le matériel d'échantillonnage dans le bas du tube.
  3. Retirer les cellules à travers le septum étanche du tube C en utilisant un embout de pipette adaptée 1000 ul et les appliquer à la crépine de cellule.
  4. Laver la crépine de cellules avec 5 ml de tampon HEPES à température ambiante.
  5. Centrifuger les cellules à un culot dans un tube de 50 ml à 300xg pendant 10 min.
  6. Aspirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans votre volume désiré de tampon PEB.

Partie 4: Résultats du représentant:

Figure 1
Figure 1. Poumon de dissociation avec le dissociateur gentleMACS ™ abouti à 92% de cellules viables. Les cellules mortes ont été fluorescence colorés à l'iodure de propidium (PI) (dot plot droite; dot plot gauche: pas de coloration PI).

Figure 2
Figure 2. Dissociation des tissus pulmonaires de souris en utilisant les résultats dissociateur gentleMACS dans un pourcentage élevé de leucocytes viables et les cellules endothéliales. Les dérivés mono-cellulaire suspensions ont été colorés avec CD45-PE et CD146-FITC ou CD31-FITC et analysées par cytométrie en flux.

La figure 2C
Figure 3. Single-cellules en suspension provenant de tissus pulmonaires de souris a été coloré avec CD11c-FITC et anti-mPDCA-1-APC pour détecter la souris CD11c basse moy-PDCA-1 + DC plasmacytoïdes ainsi que les cellules CD11c élevé.


Figure 4
Figure 4. Enrichissement de cellules dendritiques CD11c utilisant des microbilles, un séparateur MiniMACS et deux colonnes MS.

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Discussion

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Dans cette vidéo, nous introduisons une nouvelle méthode pour la dissociation des tissus pulmonaires de souris. Nous montrons que la combinaison de traitement mécanique et enzymatique du tissu pulmonaire donné un pourcentage élevé de leucocytes viables et les cellules endothéliales. Plus précisément, la désintégration mécanique du tissu a été réalisée par le dissociateur gentleMACS. Les tubes gentleMACS C comprennent un rotor - Système de stator, qui dissocie les tissus d'une manière douce. La procédure est contrôlée par les paramètres du programme de l'instrument. Les réglages ont été optimisés pour atteindre un rendement élevé et la viabilité des cellules. Les dérivés mono-cellulaire suspensions ont été colorés avec CD45-PE et CD146-FITC ou CD31-FITC et analysées par cytométrie en flux pour détecter les leucocytes et les cellules endothéliales. Les cellules dendritiques de la suspension à cellule unique ont été colorés avec CD11c-FITC et anti-mPDCA-1-APC. Par ailleurs, les cellules dendritiques à partir d'un poumon de souris unique de cellules en suspension ont été enrichies avec la technologie MACS:. Cellules dendritiques ont été marquées magnétiquement utilisant des microbilles CD11c et séparées en utilisant un séparateur MiniMACS et colonnes MS 1,2 En général, la combinaison du nouveau protocole de dissociation tri cellulaire magnétique représente une méthode standardisée pour obtenir des types cellulaires spécifiques du tissu pulmonaire.

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Acknowledgments

Les auteurs sont des employés de Miltenyi Biotec GmbH, Allemagne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C Tubes Miltenyi Biotec Order no. 130-093-237 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
gentleMACS™ Starting Kit Miltenyi Biotec Order no. 130-093-235 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ Tube Rotator Miltenyi Biotec Order no. 130-090-753 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-091-222 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-091-376 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
CD11c MicroBeads Miltenyi Biotec Order No. 130-052-001 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx
CD11c-FITC, CD11c-PE Miltenyi Biotec Order no. 130-092-026130-091-830 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx
Anti-mPDCA-1-APC Miltenyi Biotec Order no. 130-091-963 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx
CD146-FITC Miltenyi Biotec Order no. 130-092-026 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx
CD45-PE Miltenyi Biotec Order no. 130-091-610 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx
Propidium Iodide Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-093-233 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx
Art 1000 Reach Pipet Tips Molecular BioProducts Order no. 2079 http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61
http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html

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References

  1. Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
  2. Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
Préparation standardisée des suspensions unicellulaires provenant de tissus pulmonaires de la souris en utilisant les dissociateur gentleMACS
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Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (29), e1266, doi:10.3791/1266 (2009).More

Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (29), e1266, doi:10.3791/1266 (2009).

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