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Biology

माउस फेफड़े के ऊतकों से सिंगल सेल निलंबन gentleMACS Dissociator का उपयोग मानकीकृत तैयार

doi: 10.3791/1266 Published: July 2, 2009

Summary

विशिष्ट प्रकार के ऊतकों से अलग कोशिकाओं ऊतक आंदोलन के लिए विशिष्ट मानकों व्यवहार्य, कृषि कोशिकाओं की एक उच्च मात्रा प्राप्त करने के लिए की आवश्यकता है. Miltenyi gentleMACS dissociator एक सरल, व्यावहारिक प्रोटोकॉल के साथ इस कार्य का अनुकूलन. इस प्रकाशन में फेफड़े के ऊतकों पर इस उपकरण का उपयोग समझाया जाता है.

Abstract

ऊतकों से एकल कक्ष निलंबन की तैयारी सेलुलर अनुसंधान के क्षेत्र में कई प्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है. पूरे अंगों को अलग करने की प्रक्रिया के क्रम में विशिष्ट मापदंडों की आवश्यकता है एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके में व्यवहार्य कोशिकाओं के एक उच्च संख्या प्राप्त करने के लिए. gentleMACS Dissociator एक सरल, व्यावहारिक प्रोटोकॉल के साथ इस कार्य का अनुकूलन कर. साधन पूर्व क्रमादेशित सेटिंग है कि माउस फेफड़ों सहित ऊतक प्रकार की एक किस्म के कुशल लेकिन कोमल हदबंदी के लिए अनुकूलित कर रहे हैं शामिल हैं. इस प्रकाशन में फेफड़ों चूहों से व्युत्पन्न ऊतक पर gentleMACS Dissociator के उपयोग के प्रदर्शन है.

Protocol

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बाँझ शर्तों के तहत काम करने के लिए, यह एक लामिना का प्रवाह हुड में सभी चरणों का पालन करने के लिए सिफारिश की है.

1. माल

  1. HEPES बफर: 10 मिमी HEPES NaOH 7.4 पीएच, 150 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 1.8 मिमी 2 CaCl)
  2. Collagenase डी समाधान: Collagenase डी: 100 मिलीग्राम / एमएल (Collagenase डी> 0.15 यू मिलीग्राम /) बफर HEPES में
  3. DNase मैं समाधान: 20,000 यू / एमएल DNase मैं
  4. PBS बफर पीएच 7.2 पर
  5. PEB बफर: 1 20 भागों में हिस्सा BSA स्टॉक समाधान Rinsing समाधान autoMACS
  6. ऊतक: 6 / 7 सप्ताह पुराने वयस्क महिला BALB / सी माउस, आसपास के अंगों के मुक्त से व्युत्पन्न फेफड़ों.
  7. वैकल्पिक: CD11c microbeads, एमएसीएस एमएस स्तंभ, माउस फेफड़ों एकल कक्ष निलंबन से वृक्ष के समान कोशिकाओं के अलगाव के लिए एमएसीएस सेपरेटर

2. फेफड़ों के ऊतकों अलग

  1. पीबीएस युक्त एरिथ्रोसाइट्स हटायें एक पेट्री डिश में ऊतक कुल्ला.
  2. GentleMACS सी 4.9 एमएल HEPES बफर युक्त ट्यूब के लिए 450 मिलीग्राम फेफड़े के ऊतकों की एक अधिकतम स्थानांतरण.
  3. 2 मिलीग्राम / एमएल Collagenase डी. के अंतिम एकाग्रता के लिए 100 μL Collagenase डी समाधान जोड़ें
  4. 150 मिलीग्राम (40 यू / एमएल DNase मैं के अंतिम एकाग्रता) ऊतक या 150-450 मिलीग्राम फेफड़ों ऊतक के लिए 20 μL DNase मैं (80 यू / एमएल DNase मैं के अंतिम एकाग्रता) के लिए 10 μL DNase मैं समाधान जोड़ें.
  5. कसकर सी ट्यूब बंद और यह gentleMACS Dissociator पर देते हैं. फिर कार्यक्रम "m_lung_01" चला रहे हैं.
  6. 37 पर 30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस स्वचालित रोटेशन या मैन्युअल रूप से हर 5 मिनट में बदल के साथ.
  7. GentleMACS Dissociator नमूना लौटें और चलाने के कार्यक्रम "m_lung_02".

3. छानने का काम

  1. एक 70 सुक्ष्ममापी जाल सेल झरनी के साथ टोपी की जगह द्वारा छनित कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक 50 एमएल ट्यूब तैयार करें.
  2. एक बार दूसरे gentleMACS कार्यक्रम समाप्त होता है, ट्यूब में नमूना सामग्री के वितरण के आधार पर, आप ट्यूब संक्षिप्त अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे नमूना सामग्री इकट्ठा कर सकते हैं.
  3. सी ट्यूब के पट सील टोपी एक उपयुक्त 1000 μl विंदुक टिप का उपयोग कर के माध्यम से कोशिकाओं को निकालें और उन्हें सेल झरनी के लिए लागू है.
  4. आरटी पर 5 मिलीलीटर HEPES बफर के साथ सेल झरनी धो लें.
  5. एक गोली एक 50 एमएल ट्यूब में कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 300xg पर अपकेंद्रित्र.
  6. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और PEB बफर के अपने वांछित मात्रा में गोली सेल resuspend.

भाग 4: प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 1
चित्रा 1. GentleMACS ™ Dissociator साथ फेफड़े हदबंदी 92% व्यवहार्य कोशिकाओं में हुई. मृत कोशिकाओं fluorescently propidium आयोडाइड (PI) (;: नहीं PI धुंधला बाईं डॉट साजिश सही डॉट साजिश) के साथ दाग रहे थे.

चित्रा 2
चित्रा 2. व्यवहार्य leukocytes और endothelial कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत में gentleMACS Dissociator परिणाम का उपयोग कर माउस फेफड़ों ऊतक के पृथक्करण. व्युत्पन्न एकल कक्ष निलंबन CD45 पीई और CD146 FITC या CD31-FITC के साथ दाग थे और प्रवाह cytometry से विश्लेषण किया.

चित्रा 2C
चित्रा 3 सिंगल सेल माउस फेफड़े के ऊतकों से निकाली गई निलंबन CD11c FITC और विरोधी mPDCA-1-APC माउस CD11c मीटर PDCA-1 + plasmacytoid DCs कम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से CD11c उच्च कोशिकाओं का पता लगाने के लिए के साथ दाग था.


चित्रा 4
चित्रा 4 वृक्ष के समान CD11c microbeads, एक MiniMACS सेपरेटर और दो ​​एमएस स्तंभ का उपयोग कोशिकाओं के संवर्धन .

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Discussion

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इस वीडियो में, हम माउस फेफड़े के ऊतकों के पृथक्करण के लिए एक नई विधि का परिचय. हम बताते हैं कि फेफड़े के ऊतकों के यांत्रिक और enzymatic उपचार के संयोजन व्यवहार्य leukocytes और endothelial कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत मिले. विशेष रूप से, ऊतक के यांत्रिक विघटन gentleMACS Dissociator के द्वारा प्राप्त किया गया था. stator प्रणाली है, जो एक सौम्य तरीके में dissociates ऊतक - gentleMACS सी ट्यूब एक रोटर में शामिल हैं. प्रक्रिया साधन के कार्यक्रम सेटिंग्स द्वारा नियंत्रित है. सेटिंग्स के लिए उच्च और कक्षों की उपज व्यवहार्यता हासिल करने के लिए अनुकूलित थे. व्युत्पन्न एकल कक्ष निलंबन CD45 पीई और CD146 FITC या CD31-FITC के साथ दाग थे और प्रवाह cytometry से विश्लेषण करने के लिए leukocytes और endothelial कोशिकाओं का पता लगाने. एकल कक्ष निलंबन में वृक्ष के समान कोशिकाओं CD11c FITC और विरोधी mPDCA-1-APC के साथ दाग रहे थे. इसके अलावा, एक माउस फेफड़ों के निलंबन एकल कोशिका से वृक्ष के समान कोशिकाओं एमएसीएस प्रौद्योगिकी का उपयोग समृद्ध थे: वृक्ष के समान कोशिकाओं चुंबकीय CD11c microbeads लेबल का उपयोग कर रहे थे और एक MiniMACS सेपरेटर और एमएस स्तंभ का उपयोग अलग 1,2 सामान्य में, हमारी नई हदबंदी प्रोटोकॉल के साथ संयोजन चुंबकीय सेल छँटाई करने के लिए एक मानकीकृत फेफड़े के ऊतकों से विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं को प्राप्त करने के विधि का प्रतिनिधित्व करता है.

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Acknowledgments

लेखकों Miltenyi बायोटेक GmbH, जर्मनी के कर्मचारी हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C Tubes Miltenyi Biotec Order no. 130-093-237 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
gentleMACS™ Starting Kit Miltenyi Biotec Order no. 130-093-235 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ Tube Rotator Miltenyi Biotec Order no. 130-090-753 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-091-222 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-091-376 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
CD11c MicroBeads Miltenyi Biotec Order No. 130-052-001 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx
CD11c-FITC, CD11c-PE Miltenyi Biotec Order no. 130-092-026130-091-830 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx
Anti-mPDCA-1-APC Miltenyi Biotec Order no. 130-091-963 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx
CD146-FITC Miltenyi Biotec Order no. 130-092-026 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx
CD45-PE Miltenyi Biotec Order no. 130-091-610 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx
Propidium Iodide Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-093-233 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx
Art 1000 Reach Pipet Tips Molecular BioProducts Order no. 2079 http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61
http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html

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References

  1. Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
  2. Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
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Cite this Article

Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (29), e1266, doi:10.3791/1266 (2009).More

Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (29), e1266, doi:10.3791/1266 (2009).

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