Summary
نحن تصف
Abstract
ضمور العضلات عبارة عن مجموعة من الأمراض التنكسية العضلات تتميز الفقدان التدريجي للخلايا العضلات مقلص. حاليا ، لا يوجد علاج العلاجية المتاحة. لقد ولدت التطورات الأخيرة في بيولوجيا الخلايا الجذعية آمالا جديدة لتطوير علاجات فعالة تستند الخلية لعلاج هذه الأمراض. وقد استخدم زرع أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية المسمى مع البروتينات الفلورية في عضلات النماذج الحيوانية التصنع على نطاق واسع في هذا المجال. وهناك تقنية غير الغازية لديها القدرة على تتبع مصير الخلايا المزروعة يمكن طوليا كذلك قدرتنا على تقييم من قبل خلايا العضلات engraftment زرع أكثر دقة وكفاءة.
في هذه الدراسة ، ونحن تثبت أن في الجسم الحي مضان التصوير هو طريقة حساسة وموثوق بها لتتبع GFP المزروع (البروتين الفلوري الأخضر) المسمى الخلايا في عضلات الهيكل العظمي الماوس. على الرغم من القلق إزاء الخلفية نظرا لاستخدام الضوء الخارجي اللازمة لاستثارة للبروتين فلوري ، وجدنا أنه من خلال استخدام الفأرة إما عارية أو القضاء على الشعر مع الكواشف إزالة الشعر هو القضاء على جزء كبير من هذه المشكلة. باستخدام كاميرا CCD ، ويمكن الكشف عن إشارة الفلورسنت في العضلة الظنبوبية (TA) الأمامي بعد حقن الخلايا 5 × 5 10 إما من الفئران المعدلة وراثيا أو GFP eGFP transduced myoblast الثقافة. للعضلات أكثر سطحية مثل إبهام اليد الباسطة لأصابع (EDL) ، وحقن الخلايا تنتج أقل من إشارة يمكن كشفها. ويمكن قياس شدة الإشارة وكميا في عدد الفوتونات المنبعثة في الثانية الواحدة في المنطقة ذات الاهتمام (ROI). منذ حصلت على الصور تظهر حدود واضحة ترسيم منطقة engrafted ، يمكن قياس حجم العائد على الاستثمار كذلك. إذا كان يتم وضع الساقين باستمرار في كل مرة ، والتغييرات في عدد من الفوتونات في الثانية الواحدة في العضلات وحجم العائد على الاستثمار يعكس التغييرات في عدد من الخلايا engrafted وحجم المنطقة engrafted. لذا فإن التغيرات في العضلات نفسها مع مرور الوقت وقابلة للقياس الكمي ، وفي الجسم الحي وقد استخدمت تقنية التصوير الفلورسنت أساسا لتعقب نمو الخلايا tumorogenic ، دراستنا تبين أنه أداة قوية تمكننا من تعقب مصير الخلايا الجذعية المزروعة.
Protocol
إعداد الخلية
- القمر الصناعي زنزانة انفرادية
- تحت تأثير مخدر ، تتم إزالة عضلات الاطراف من الفئران المعدلة وراثيا GFP (C57BL / كا βactin - EGFP). بعد قطع الى قطع صغيرة ، والخلايا الأقمار الصناعية هي التي تفرخ إنزيمي فصل الأنسجة المفروم مع 2 ٪ dispase حل كولاجيناز لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- تحييد انزيم الهضم مع وسائل الإعلام التي تحتوي على نمو هام من طراز F - 10 و FBS 20 ٪ ، وتنأى في العضلات التي تتكرر مع الطحن ماصة باستور. يتم تصفية هذه الخلايا من خلال مصفاة الخلية (ø70 - 100μm) ومطلي ثم على طبق غير المغلفة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- إزالة بلطف وطاف بها على لوحة طبق الكولاجين المغلفة. كرر هذه الخطوة في وقت لاحق 1 ساعة لتنقية myoblasts. (قبل لوحة)
- تغيير وسائل الإعلام ولوحة الخلايا في الوقت المناسب. يتم تربيتها في myoblasts النهائي المنقى في المتوسط تحتوي على لحم الخنزير F - 10 ، و 20 ٪ FBS ، 100 البنسلين يو / لتر ، و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين (متوسطة النمو) عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO2 ، والهواء 95 ٪.
- ثقافة وتوسيع myoblasts الابتدائية في وسط النمو مع اضافة جمعية جيل المستقبل الأساسية من 10 نانوغرام / مل.
- للجميع في التجارب المجراة ، ونحن ضخ 5x10 5 خلايا العضلات في TA.
- عندما حصاد myoblasts ، ونحن في فصل الخلايا باستخدام 0.25 ٪ التربسين / EDTA وغسلها مع برنامج تلفزيوني مرتين. يتم حساب الأرقام الخلية مع عدادة الكريات ومعلق الخلايا في HBSS في تركيز خلايا 5x10 4 / ميكرولتر. وتوضع الخلايا تتركز في HBSS على الجليد وحقنه في حدود 1 ساعة بعد جمعها.
التصوير في فيفو
- يتم شراؤها من الذكور الفئران MDX في سن 4-6 أسابيع من مختبر جاكسون والحفاظ على حيوان مرفق الإسكان.
- بعد حوالي أسبوع واحد من خيارات السكن والبيئة ، والفئران جاهزة للزرع مع الخلايا المستزرعة.
- قبل زرع الخلايا ، والفأر هو تخدير عن طريق حقن (IP) داخل الصفاق من مزيج من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ). ثم تتم إزالة الشعر في جميع أنحاء المنطقة من خلال تطبيق العضلات TA ناير في ساقه والانتظار لمدة 30 ثانية للقضاء عليه نظيفا بالماء المقطر.
- في حين أن الماوس لا يزال تحت التخدير ، ويتم حقن الخلايا ببطء 5x10 5 في HBSS 10μl في كل عضلة في TA 3 نقاط باستخدام إبرة قياس 30.
- بعد الخطوة 4 ، ويمكن تصوير الماوس بشكل منتظم من قبل في مجال التصوير مضان الجسم الحي. يستخدم التصوير مضان محطة NightOwl LB981 (برتولد تكنولوجيز ، وشركة) ، ومجهزة بكاميرا المسؤول عن حساسية عالية بالإضافة إلى الحصول على الصور من الساقين تعيق من الفئران.
- يوم التصوير في الجسم الحي ، ونحن أولا التحقق من إعادة نمو الشعر على العضلات TA. إذا لزم الأمر ، ونحن إعادة تطبيق ناير لإزالة الشعر على النحو الموصوف أعلاه ، وبعد التخدير والفأر مع مزيج من الكيتامين وزيلازين.
- في حين أن الفأر هو تحت التخدير ، ونضع الماوس في وضعية الرقود على قطعة من الورق غير الفلورسنت السوداء (أسود Artagain الورق من ستراثمور). لفضح تماما العضلات TA لأفضل تصوير ، ونحن الشريط الكفوف الخلفيتين للصحيفة.
- نضع الماوس في غرفة التصوير ووضع الساق الخلفية ليمكن تصوير في مركز مجال الرؤية للكاميرا. نحن أول من تبديل فلتر الانبعاثات لاتخاذ الرمادية التقليدية على نطاق الصورة الفوتوغرافية من الساق مع وقت تعرض 5 ثوان. تعدل الموقف من الفأرة وتركيز الكاميرا إذا لزم الأمر. يتم الاحتفاظ معلمات التصوير بما في ذلك وقت التعرض (1250 مللي ثانية) ، وارتفاع العينة (0.9 سم) الخ المستمر في عملية تجريبية.
- نحن ثم التبديل في تصفية الانبعاثات المناسبة لطول الموجة بروتين الفلورية الخضراء. نحن نأخذ صورة مضان مع وقت التعرض لل1250 مللي ثانية وعدد binning 1. بعد التصوير ، ويتم إزالة الماوس من غرفة التصوير لقفص الانتظار الانتعاش.
- للتحليل ، ونحن نرسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) عبر إشارات لقياس كثافة الفلورية من حيث الفوتونات في الثانية الواحدة. ونحن أيضا قياس حجم العائد على الاستثمار من حيث عدد بكسل كما الكمي قيمة أخرى. ويمكن تكرار التجارب التصوير كل أسبوع أو أكثر بشكل متكرر على مدى بضعة أشهر ، إذا لزم الأمر ، للحصول على البيانات الطولية.
في نهاية التجارب ، والموت الرحيم الماوس ويتم حصادها في عضلة TA لتحليل الأنسجة.
Discussion
أنشأنا منصة التصوير موثوقة ومستقرة لتتبع الخلايا التي تم زرعها مضان المسمى في عضلات الهيكل العظمي المضيف في هذه الدراسة. GFP المسمى myoblasts من GFP الماوس المعدلة وراثيا لتقف على نوع من الخلايا الجذعية البالغة التي من شأنها أن تكون مرشحة لعلاج الخلايا في المستقبل. التلاعب المستمر بما في ذلك عدد الخلايا ، وحقن الخلايا ، والخلفية واضحة وموقف المعلمة آلة التصوير ومهم من أجل الحصول على صورة ذات جودة عالية وخاصة بالنسبة للتحليل الكمي.
مضان التصوير والعديد من التطبيقات في مجال البحوث الطبية الحيوية كما هو غير الغازية ، وسهلة الاستخدام ، ويحتوي على إنتاجية عالية. بالإضافة التصوير مضان يمكن أن يوفر القياس الكمي على أساس تهم الفوتون ، وإن كان يرجع ذلك إلى توهين ، وتشتت والاستيعاب ، ويمكن أن لا تتمكن من اختراق الضوء على مسافة كبيرة في الأنسجة ، والذي هو أحد أوجه القصور في الأسلوب. وقد بذلت جهود جارية لاستخدام مراسل حمراء أو تحت الحمراء القريبة لزيادة عمق الاختراق من الضوء.
ميزة أخرى من التصوير مضان هو أنه للترجمة إلى العيادات في حال الموافقة على مراسل الفلورسنت محددة للاستخدام البشري. بالمقارنة مع MRI ، CT ، والدائرة ، ومضان التصوير ومرونة عالية لأنها لا تتطلب أجهزة مكلفة وكلاء التصوير. مثال واحد هو مضان المستندة المنظار المنظار ومتناهية الصغر ، التي تم استخدامها في العيادات. من خلال الجمع بين التصوير مضان مع طرائق أخرى ، ونحن نتوقع تحقيق القدرة على اكتساب المعلومات على حد سواء التشريحية والوظيفية عن عمليات بيولوجية كامنة.
Acknowledgments
تم عمل وانغ يانغ Z Y بفضل منحة من AR051181 K02 NIAMS / المعاهد الوطنية للصحة ، والمنح من رابطة الضمور العضلي ومعهد هارفارد للخلايا الجذعية لانغ واي. ويدعم عمل تسنغ سؤال وشو X من قبل برنامج المنح التي منحت للمختبر التصوير الضوئي من بريغهام ومستشفى النساء. فإن الكتاب أود أن أشكر ليو ون من قسم التخدير ، BWH ، للمساعدة التقنية في أعمال الخلية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
References
- Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S.
- Green, fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J.
- Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models. Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).
- Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography. J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).
- Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers. , 107-121 Forthcoming.
- Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).
- In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. Annual Meeting of American Society of Gene Therapy, 2008 May 28-June 1, Boston, Ma, , American Society of Gene & Cell Therapy. Milwaukee, WI. (1985).
- Hoffman, R. M. In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins. Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).
- Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).
- Morgan, J. E., Partridge, T. A.
- Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).
- Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions. J Mol Med. 82, 102-115 (2004).
- Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts. Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).
- Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).
- Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
