Summary
Nós descrevemos um
Abstract
Distrofias musculares são um grupo de doenças musculares degenerativas caracterizada pela perda progressiva de células musculares contráteis. Atualmente, não há tratamento curativo disponível. Os recentes avanços na biologia das células estaminais têm gerado novas esperanças para o desenvolvimento de terapias celulares eficientes com base para tratar estas doenças. Transplante de vários tipos de células-tronco marcadas com proteínas fluorescentes em músculos de modelos animais distróficos tem sido utilizado amplamente no campo. A técnica não-invasiva com a capacidade de rastrear o destino das células transplantadas longitudinalmente pode continuar a nossa capacidade de avaliar o enxerto muscular por células transplantadas com mais precisão e eficiência.
No presente estudo, demonstramos que fluorescence in vivo de imagens é um método sensível e confiável para rastreamento de GFP transplantado (Proteína Fluorescente Verde) marcado com células em músculos esqueléticos do rato. Apesar da preocupação de fundo, devido à utilização de uma luz externa necessária para a excitação da proteína fluorescente, descobrimos que usando o mouse nuas ou eliminar o cabelo com reagentes depilação muito deste problema é eliminado. Usando uma câmera CCD, o sinal fluorescente pode ser detectado no músculo tibial anterior (TA) após a injeção de 5 x 10 5 células de ambos os camundongos transgênicos ou GFP eGFP transduzidas cultura de mioblastos. Para os músculos mais superficiais, como o extensor longo dos dedos (EDL), a injeção de células menos produz um sinal detectável. Intensidade do sinal podem ser medidos e quantificados o número de fótons emitidos por segundo em uma região de interesse (ROI). Uma vez que as imagens obtidas mostram limites claros demarcar a área enxertada, o tamanho do ROI pode ser medido também. Se as pernas são posicionadas de forma consistente o tempo todo, as mudanças no número total de fótons por segundo por músculo e do tamanho do ROI refletir as mudanças no número de células enxertadas eo tamanho da área enxertada. Portanto, as alterações no músculo mesmo ao longo do tempo são quantificáveis. In vivo técnica de imagem fluorescente foi usado principalmente para controlar o crescimento de células tumorogenic, nosso estudo mostra que é uma ferramenta poderosa que nos permite acompanhar o destino de células-tronco transplantadas.
Protocol
Preparação celular
- Isolamento das células satélites
- Sob anestesia, os músculos dos membros de camundongos transgênicos GFP (C57BL / Ka-βactin-EGFP) são removidos. Após o corte em pedaços pequenos, as células satélite são enzimaticamente dissociado pela incubação do tecido picada com solução de 2% dispase colagenase durante 1 hora a 37 ° C.
- Neutralize a digestão enzimática com meio de cultura contendo Ham F-10 e 20% FBS, dissociar o músculo por trituração repetido com uma pipeta Pasteur. As células são filtrados através de um filtro de células (ø70-100μm) e então semeadas em uma placa não-revestido por 1 hora a 37 ° C.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante e placa-los em um prato de colágeno revestido. Repita este passo uma hora mais tarde, para purificar os mioblastos. (Pré-plate)
- Troque a mídia ea placa de células no tempo. Os mioblastos final purificado são cultivadas em meio contendo Ham F-10, 20% FBS, 100 U / ml de penicilina, estreptomicina e 100 mg / ml (média de crescimento), a 37 ° C com 5% de CO2 do ar, 95%.
- Cultura e expandir a mioblastos primários em meio de crescimento com a adição de FGF básico de 10 ng / ml.
- Para todos os experimentos in vivo, injetamos 5x10 5 células por músculo TA.
- Ao colher os mioblastos, destacamos as células usando 0,25% de tripsina / EDTA e lavá-los com PBS duas vezes. O número de células são contadas com um hemocitômetro e as células são ressuspendidas em HBSS a uma concentração de 5x10 4 células / ml. As células concentradas em HBSS são colocados no gelo e injetado dentro de uma hora após a coleta.
Vivo na imagem
- Camundongos machos mdx com a idade de 4-6 semanas são comprados a partir de Jackson laboratório e mantida em uma instalação de alojamento dos animais.
- Após cerca de uma semana de alojamento para o meio ambiente, os ratos estão prontos para serem implantados com a cultura de células.
- Antes do transplante das células, o mouse é anestesiado por uma injeção intraperitoneal (ip) da mistura de ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Em seguida, o cabelo em torno da área do músculo TA é removida através da aplicação de Nair para a perna e à espera de 30 segundos para limpe-o com água destilada.
- Enquanto o mouse está ainda sob anestesia, 5x10 5 células em HBSS 10μl estão lentamente injetadas em cada músculo TA em 3 pontos usando uma agulha de calibre 30.
- Após o passo 4, o mouse pode ser regularmente fotografada pela fluorescência in vivo de imagens. A fluorescência de imagem da estação Nightowl LB981 (Berthold Technologies, Inc.), equipado com uma câmera de alta charge-coupled sensível, é usado para obter imagens das pernas dificultam dos ratos.
- No dia da in vivo de imagens, nós primeiro verificar o crescimento do cabelo no músculo TA. Se necessário, voltar a aplicar Nair para remover o cabelo como descrito acima, depois de anestesiar o rato com a mistura de Ketamina e Xilazina.
- Enquanto o mouse está sob anestesia, colocamos o mouse em uma posição de bruços em um pedaço de papel não-fluorescente preto (papel Artagain preto de Strathmore). Para expor totalmente o músculo TA para uma melhor imagem, que tape as patas traseiras para o papel.
- Nós colocamos o mouse na câmara de imagem e posição da perna a ser trabalhada no centro do campo de visão da câmera. Nós primeiro mudar o filtro de emissão para tirar uma foto em tons de cinza fotográfica tradicional da perna com um tempo de exposição de 5 segundos. Reajuste a posição do mouse e foco da câmera, se necessário. Os parâmetros de imagem, incluindo o tempo de exposição (1.250 ms), altura de amostra (0,9 cm), etc são mantidas constantes no processo experimental.
- Em seguida, interruptor no filtro de emissão adequada para o comprimento de onda da proteína verde fluorescente. Tomamos imagem de fluorescência com um tempo de exposição de 1.250 ms e um número binning de 1. Depois de imagem, o mouse é removido da câmara de imagem para uma gaiola que esperar a recuperação.
- Para a análise, traçamos uma região de interesse (ROI) ao longo dos sinais fluorescentes para medir sua intensidade em termos de fótons por segundo. Também medimos o tamanho do ROI em termos de número de pixels como um outro valor de quantificação. Os experimentos de imagem pode ser repetida a cada semana ou mais freqüentemente ao longo de alguns meses, se necessário, para aquisição de dados longitudinal.
No final dos experimentos, o mouse é sacrificados eo músculo TA é colhida para análise histológica.
Discussion
Montamos uma plataforma de imagem confiável e estável para acompanhar a fluorescência rotulados células transplantadas no músculo esquelético anfitrião neste estudo. GFP-rotulados mioblastos de camundongo GFP transgênicos representa um tipo de células-tronco adultas que serão candidatos para terapia celular no futuro. A manipulação constante, incluindo o número de células, injeção de células, fundo claro, a posição de imagem e de parâmetros de máquina é importante para a obtenção de imagem de alta qualidade e especialmente para análise quantitativa.
Fluorescência de imagens tem muitas aplicações na pesquisa biomédica, uma vez que é não-invasivo, fácil de usar, e tem uma alta taxa de transferência. Além de imagens de fluorescência pode fornecer uma medida quantitativa com base na contagem de fótons, porém, devido à dispersão, atenuação e absorção, a luz não pode penetrar uma grande distância no tecido, que é uma lacuna da técnica. Esforços têm sido feitos para uso repórter vermelho ou infravermelho próximo para aumentar a profundidade de penetração da luz.
Outra vantagem de imagens de fluorescência é que é traduzível para clínicas específicas, se o repórter fluorescente é aprovado para uso humano. Comparação com ressonância magnética, tomografia computadorizada, PET e, fluorescência de imagem tem alta flexibilidade, uma vez que não requer hardware caro e agentes de imagem. Um exemplo é a fluorescência baseada endoscópio e micro-endoscópio que têm sido utilizados em clínicas. Através da combinação de imagens de fluorescência com outras modalidades, esperamos alcançar a capacidade de adquirir tanto as informações anatômicas e funcionais sobre os processos biológicos subjacentes.
Acknowledgments
O trabalho de Z Yang e Wang Y foi possível graças a conceder K02 AR051181 de NIAMS / NIH, subsídios da Muscular Dystrophy Association e Harvard Stem Cell Institute for Y Wang. O trabalho de Q Zeng e Xu X são suportados por uma bolsa concedida ao programa Lab imagem óptica do Brigham e do Hospital da Mulher. Os autores gostariam de agradecer Liu Wen do Departamento de Anestesia, BWH, para ajuda técnica no trabalho da célula.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
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