Summary
Se describe un
Abstract
Las distrofias musculares son un grupo de enfermedades musculares degenerativas caracteriza por una pérdida progresiva de las células contráctiles del músculo. En la actualidad, no existe ningún tratamiento curativo disponible. Los avances recientes en biología de células madre han generado nuevas esperanzas para el desarrollo de terapias basadas en células eficaces para tratar estas enfermedades. El trasplante de varios tipos de células madre marcadas con proteínas fluorescentes en los músculos de los modelos animales distróficos se ha utilizado ampliamente en el campo. Una técnica no invasiva con la capacidad de rastrear el destino de las células trasplantadas pueden longitudinalmente aún más nuestra capacidad para evaluar el injerto muscular, las células trasplantadas con mayor precisión y eficiencia.
En el presente estudio, hemos demostrado que in vivo de fluorescencia de imagen es un método sensible y fiable para el seguimiento de las buenas prácticas agrarias trasplantado (Green Fluorescent Protein) marcado con células en los músculos esqueléticos del ratón. A pesar de la preocupación de fondo debido a la utilización de una luz externa necesaria para la excitación de la proteína fluorescente, se encontró que mediante el uso de cualquiera de ratón desnudo o la eliminación del pelo con los reactivos de depilación gran parte de este problema se elimina. Utilizando una cámara CCD, la señal fluorescente se puede detectar en el tibial anterior (TA) muscular después de la inyección de 5 x 10 5 células de cualquiera de las buenas prácticas agrarias ratones transgénicos o eGFP transduced cultura de mioblastos. Para que los músculos más superficiales como el extensor largo de los dedos (EDL), la inyección de menor número de células se produce una señal detectable. Intensidad de la señal puede ser medido y cuantificado el número de fotones emitidos por segundo en una región de interés (ROI). Puesto que las imágenes obtenidas muestran límites claros delimitar la zona implantada, el tamaño de la ROI se puede medir así. Si las piernas se colocan constantemente en todo momento, los cambios en el número total de fotones por segundo por el músculo y el tamaño de la ROI reflejar los cambios en el número de células injertadas y el tamaño de la zona injertada. Por lo tanto, los cambios en el mismo músculo en el tiempo son cuantificables. En vivo técnica de imagen fluorescente se ha utilizado principalmente para realizar el seguimiento del crecimiento de las células tumorogénico, nuestro estudio demuestra que es una poderosa herramienta que nos permite realizar el seguimiento del destino de las células madre trasplantadas.
Protocol
Preparación de células
- Aislamiento de células satélite
- Bajo anestesia, los músculos de los miembros de la GFP ratones transgénicos (C57BL / Ka-βactin-EGFP) se retiran. Después de cortar en trozos pequeños, las células satélite están disociadas enzimáticamente por incubación del tejido picado con una solución de colagenasa dispasa 2% durante 1 hora a 37 ° C.
- Neutralizar la digestión enzimática con medios de cultivo que contienen Ham F-10 y el 20% de SFB, se disocian del músculo por trituración repetida con una pipeta Pasteur. Las células se filtran a través de un colador de células (Ø70-100μm) y luego colocan en un plato sin revestimiento durante 1 hora a 37 ° C.
- Retire con cuidado el sobrenadante y la placa en un plato recubierto de colágeno. Repita este paso una hora más tarde para purificar los mioblastos. (Pre-placa)
- Cambiar el soporte y la placa de las células en el tiempo. Los mioblastos final purificado se cultivan en un medio que contiene Ham F-10, el 20% de SFB, 100 U de penicilina / ml, y 100 ug / ml de estreptomicina (medio de crecimiento) a 37 º C con CO2 al 5%, 95% de aire.
- La cultura y ampliar los mioblastos primarios en medio de cultivo con adición de FGF básico de 10 ng / ml.
- Para todos los experimentos in vivo, se inyecta 5x10 5 células por músculo TA.
- En la cosecha de los mioblastos, que separar las células mediante el uso de 0,25% de tripsina / EDTA y lavar con PBS dos veces. El número de células se contó con un hemocitómetro y las células se resuspendieron en HBSS a una concentración de 5x10 4 células / microlitro. Las células concentradas en HBSS se colocan sobre hielo y se inyecta dentro de una hora después de la recolección.
Imágenes in vivo
- Mujer ratones mdx a la edad de 4-6 semanas se compran a Jackson de laboratorio y mantenidos en un centro de alojamiento de los animales.
- Después de una semana de alojamiento en el medio ambiente, los ratones están listos para ser implantados con las células cultivadas.
- Antes del trasplante de células, el ratón está anestesiado por un intraperitoneal (ip) de la mezcla de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). A continuación, el pelo alrededor de la zona del músculo TA se elimina mediante la aplicación de Nair en la pierna y esperar 30 segundos para limpiarla con agua destilada.
- Mientras que el ratón está todavía bajo la anestesia, 5x10 5 células en HBSS 10μl se inyecta lentamente en cada músculo TA a los 3 puntos con una aguja de calibre 30.
- Después del paso 4, el ratón se puede regular mediante imágenes en vivo de imágenes de fluorescencia. La imagen de fluorescencia estación Nightowl LB981 (Tecnologías de Berthold, Inc.), equipado con una alta sensibilidad de acoplamiento de carga de la cámara, se utiliza para obtener imágenes de las piernas obstaculizar de los ratones.
- En el día de imágenes in vivo, en primer lugar comprobar la regeneración del cabello en el músculo TA. Si es necesario, volver a aplicar Nair para quitar el pelo como se describe anteriormente, después de anestesiar el ratón con la mezcla de ketamina y xilazina.
- Mientras que el ratón está bajo anestesia, se coloca el ratón en una posición boca abajo en un pedazo de negro no fluorescente de papel (papel negro Artagain de Strathmore). Para exponer el músculo por completo de asistencia técnica para una mejor imagen, grabamos las patas traseras en el papel.
- Ponemos el ratón en la cámara de imagen y la posición de la pata trasera a ser reflejado en el centro del campo de visión de la cámara. En primer lugar, cambiar el filtro de emisiones para tomar la tradicional escala de grises imagen fotográfica de la pierna con un tiempo de exposición de 5 segundos. Reajuste la posición del ratón y el enfoque de la cámara si es necesario. Los parámetros de imagen, incluyendo el tiempo de exposición (1.250 ms), altura de la muestra (0.9 cm), etc se mantienen constantes en el proceso experimental.
- A continuación, cambiar el filtro de emisiones correspondientes a la longitud de onda proteína verde fluorescente. Tomamos la imagen de fluorescencia con un tiempo de exposición de 1.250 ms y un número de intervalos de 1. Después de la filmación, el ratón se retira de la cámara de imágenes a una jaula para esperar la recuperación.
- Para el análisis, se dibuja una región de interés (ROI) a través de las señales fluorescentes para medir su intensidad en términos de fotones por segundo. También medimos el tamaño del retorno de la inversión en términos de número de píxeles como otro valor de la cuantificación. Los experimentos de imagen se puede repetir cada semana o con mayor frecuencia durante unos meses, si es necesario, para obtener datos longitudinales.
Al final de los experimentos, el ratón es la eutanasia y el músculo TA se cosecha para su análisis histológico.
Discussion
Hemos creado una plataforma de imagen estable y fiable para el seguimiento de la fluorescencia etiquetados células trasplantadas en el músculo esquelético de acogida en este estudio. GFP-etiquetados mioblastos de las buenas prácticas agrarias de ratones transgénicos representa un tipo de células madre adultas que serán candidatos para la terapia celular en el futuro. Una constante manipulación, incluyendo el número de células, la inyección de células, fondo claro, la posición de la imagen y los parámetros de la máquina es importante para obtener imágenes de alta calidad y, sobre todo para el análisis cuantitativo.
Fluorescencia de imagen tiene muchas aplicaciones en la investigación biomédica, ya que no es invasiva, fácil de usar, y tiene un alto rendimiento. Además de imágenes de fluorescencia puede proporcionar una medición cuantitativa basada en el recuento de fotones, aunque debido a la dispersión, atenuación y absorción, la luz no puede penetrar a una gran distancia en el tejido, que es un defecto de la técnica. Se han realizado esfuerzos para utilizar el reportero de color rojo o del infrarrojo cercano para aumentar la profundidad de penetración de la luz.
Otra de las ventajas de imágenes de fluorescencia es que se puede traducir a las clínicas si el reportero fluorescente específica está aprobado para uso humano. En comparación con el MRI, CT y PET, fluorescencia de imagen tiene una gran flexibilidad, ya que no requiere hardware caro y agentes de imagen. Un ejemplo es la fluorescencia basada endoscopio y endoscopio micro-que se han utilizado en las clínicas. Mediante la combinación de imágenes de fluorescencia con otras modalidades, esperamos alcanzar la capacidad de adquirir información tanto anatómica y funcional de los procesos biológicos subyacentes.
Acknowledgments
El trabajo de Wang y Yang Z Y fue posible por la subvención K02 AR051181 de NIAMS / NIH, las donaciones de la Asociación de Distrofia Muscular y el Harvard Stem Cell Institute for Y Wang. El trabajo de Q y Zeng Xu X son apoyados por un programa de subvención concedido al Laboratorio de Óptica de la Imagen del Hospital Brigham y de Mujeres. Los autores desean agradecer a Liu Wen, del Departamento de Anestesia, BWH, en busca de ayuda técnica en el trabajo celular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
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