Summary
אנו מתארים
Abstract
Dystrophies שרירים הן קבוצה של מחלות שרירים ניוונית המאופיינת אובדן הדרגתי של בתאי שריר התכווצות. נכון לעכשיו, אין טיפול מרפא זמין. התפתחויות אחרונות ביולוגיה של התא גזע יצרו תקוות חדשות לפיתוח טיפולים יעילים תא מבוסס לטיפול במחלות אלה. השתלה של סוגים שונים של בתאי גזע שכותרתו עם חלבוני ניאון לתוך שרירי במודלים של בעלי חיים dystrophic נעשה שימוש רחב בתחום. טכניקה לא פולשנית עם יכולת לעקוב אחר גורל התא המושתל longitudinally יכולים להמשיך ביכולת שלנו להעריך engraftment שריר על ידי התאים המושתלים באופן מדויק יותר וביעילות.
במחקר הנוכחי, אנו מדגימים כי in vivo פלואורסצנציה הדמיה היא שיטה רגישה ואמינה למעקב אחר המושתלים GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) שכותרתו תאים עכבר שרירי השלד. למרות החשש על רקע עקב השימוש של אור חיצוני הכרחי עירור של חלבון פלואורסצנטי, מצאנו כי באמצעות העכבר או עירום או ביטול השיער עם חומרים כימיים להסרת שיער רב של בעיה זו מתבטלת. שימוש במצלמת CCD, האות ניאון ניתן לאתר את השריר הקדמי (ת"א) tibialis לאחר הזרקה של 5 x 10 5 תאים משני העכברים הטרנסגניים GFP או eGFP transduced תרבות myoblast. עבור השרירים השטחיים יותר כגון extensor digitorum longus (אדי), הזרקה של תאים פחות מייצר אות לזיהוי. עוצמת האות ניתן למדוד לכמת כמו מספר של פוטונים הנפלטים בשנייה באזור של עניין (ROI). מאז רכשה את התמונות להראות גבולות ברורים התוחם את האזור engrafted, בגודל של ההחזר על ההשקעה ניתן למדוד גם. אם הרגליים ממוקמות באופן עקבי כל הזמן, השינויים המספר הכולל של פוטונים לשנייה לכל שרירים בגודל של ההחזר על ההשקעה משקפים את השינויים במספר התאים engrafted ואת גודל השטח engrafted. לכן השינויים בשריר אותו לאורך זמן הם לכימות. In vivo טכניקת דימות פלואורסצנטי שימש בעיקר כדי לעקוב אחר הצמיחה של תאים tumorogenic, המחקר שלנו מראה כי זהו כלי רב עוצמה המאפשר לנו לעקוב אחר גורלם של בתאי גזע המושתלים.
Protocol
תא הכנה
- תא הבידוד לווין
- תחת הרדמה, שרירי הגפיים של העכברים הטרנסגניים GFP (C57BL / Ka-βactin-EGFP) יוסרו. לאחר חיתוך לחתיכות קטנות, תאים הלוויין ניתק enzymatically הם דוגרים על ידי רקמת טחון עם פתרון 2% dispase collagenase שעה 1 ב 37 ° C.
- לנטרל את אנזים העיכול עם התקשורת גידול המכיל Ham-F-10 ו - 20% FBS, לנתק את השריר על ידי triturating חזר עם פיפטה פסטר. התאים מסוננים דרך מסננת תא (ø70-100μm) ו מצופה מכן על צלחת הלא מצופה שעה 1 ב 37 ° C.
- בעדינות להסיר את supernatant צלחת אותם על צלחת מצופה קולגן. חזור על צעד 1 שעה לאחר מכן לטהר את myoblasts. (טרום צלחת)
- שינוי התקשורת צלחת התאים בזמן. Myoblasts מטוהרים הסופי בתרבית בינוני המכיל Ham-F-10, 20% FBS, 100 U / ml פניצילין, ו -100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין (מדיום גידול) בשעה 37 ° C עם CO2 5%, 95% אוויר.
- תרבות ולהרחיב את myoblasts העיקרי במדיום הגידול בתוספת של FGF הבסיסי של 10 ng / ml.
- במשך כל בניסויים vivo, אנו מזריקים 5x10 5 תאים לכל שריר ת"א.
- כאשר קצירת myoblasts, אנו לנתק את התאים באמצעות 0.25% טריפסין / EDTA לשטוף אותם עם PBS פעמיים. המספרים תא נספרים עם hemocytometer לבין תאים resuspended ב HBSS בריכוז של 5x10 4 תאים / μl. התאים מרוכזים HBSS ממוקמות על קרח מוזרק בתוך שעה 1 אחרי האוסף.
In vivo הדמיה
- זכר עכברים MDX בגיל 4-6 שבועות הם שנרכשו ג'קסון מעבדה ומתוחזק במתקן דיור בעלי חיים.
- לאחר כשבוע של התאמה לסביבה, העכברים הם מוכנים להיות מושתל עם תאים בתרבית.
- לפני השתלת תאים, העכבר הוא מורדם באמצעות זריקה (IP) intraperitoneal תערובת של קטמין (100 מ"ג / ק"ג) ו Xylazine (10 מ"ג / ק"ג). ואז השיער מסביב לאזור השריר ת"א יוסר על ידי יישום נאיר ברגל ומחכים 30 שניות כדי למחוק אותו עם מים מזוקקים.
- בעוד סמן העכבר נמצא עדיין תחת הרדמה, 5x10 5 תאים HBSS 10μl מוזרקים לאט 3 נקודות באמצעות מחט מד 30 לתוך כל שריר ת"א.
- אחרי שלב 4, העכבר ניתן הדמיה באופן קבוע על ידי in vivo פלואורסצנציה הדמיה. פלואורסצנציה הדמיה תחנת NightOwl LB981 (ברטולד Technologies, Inc), מצויד במצלמה גבוה תשלום מצמידים רגיש, משמש כדי להשיג תמונות מן לעכב את הרגליים של העכברים.
- ביום in vivo הדמיה, אנחנו הראשונים לבדוק את לצמיחה מחודשת שיער על השריר ת"א. אם יש צורך, אנחנו נאיר להחיל מחדש כדי להסיר את השיער כפי שתואר לעיל, לאחר הרדמה העכבר בתערובת של קטמין ו Xylazine.
- בעוד סמן העכבר נמצא תחת הרדמה, אנחנו במקום העכבר אפרקדן על פיסת נייר לא פלורסנט שחור (שחור נייר Artagain מ Strathmore). כדי לחשוף באופן מלא את השריר ת"א הדמיה טוב יותר, אנו הקלטת הכפות האחוריות אל הנייר.
- אנחנו שמים את העכבר בתא הדמיה עמדת רגל אחורית להיות צילמו במרכז שדה הראייה של המצלמה. אנחנו הראשונים לעבור את מסנן הפליטה לצלם המסורתית אפורים בקנה מידה הצילום של הרגל עם זמן חשיפה של 5 שניות. להתקין מחדש את המיקום של העכבר למקד את המצלמה במידת הצורך. הפרמטרים הדמיה כולל זמן החשיפה (1,250 ms), גובה הדגימה (0.9 ס"מ) וכו 'נשמרים קבוע בתהליך הניסוי.
- אנו מכן לעבור במסנן פליטה מתאים אורך הגל הירוק חלבון פלואורסצנטי. אנחנו לוקחים תמונה פלואורסצנציה עם זמן חשיפה של 1,250 ms ומספר binning של 1. לאחר הדמיה, עכבר נמחקת תא הדמיה לכלוב לחכות להחלמה.
- לניתוח, נעביר האזור של עניין (ROI) על אותות ניאון כדי למדוד את העוצמה שלהם במונחים של פוטונים בשנייה. אנחנו גם למדוד את גודל ההחזר על ההשקעה במונחים של מספר הפיקסלים כערך אחר כימות. הניסויים הדמיה ניתן לחזור כל שבוע או בתדירות גבוהה יותר על פני כמה חודשים, במידת הצורך, לרכוש נתונים האורך.
בתום הניסויים, העכבר הוא להרדים את השריר ת"א שנקטפו לניתוח היסטולוגיה.
Discussion
אנו מקימים פלטפורמה אמינה ויציבה הדמיה למעקב אחר הקרינה על התאים המושתלים שכותרתו בשריר השלד מארח במחקר זה. GFP-שכותרתו myoblasts מ-GFP עכבר מהונדס מייצג סוג של בתאי גזע בוגרים שיהיו מועמדים טיפול בתא בעתיד. מניפולציה קבוע כולל מספר התאים, הזרקת תאים, רקע ברור, עמדה הדמיה פרמטר מכונת חשוב להשגת תמונה באיכות גבוהה במיוחד עבור ניתוח כמותי.
פלואורסצנטי הדמיה יש יישומים רבים במחקר ביו כפי שהוא אינו פולשני, קל לשימוש, ויש לו קצב העברת נתונים גבוה. בנוסף דימות פלואורסצנטי יכול לספק מדידה כמותית המבוססת על ספירת פוטון, אם כי בשל הנחתה פיזור, קליטה, האור לא יכול לחדור מרחק גדול רקמות, המהווה חיסרון של השיטה. מאמצים כבר בעיצומן להשתמש כתב אדום או קרוב אינפרא אדום כדי להגדיל את עומק החדירה של האור.
יתרון נוסף של דימות פלואורסצנטי היא שזה לתרגום למרפאות אם הכתב ניאון ספציפיים מאושר לשימוש האדם. לעומת MRI, CT, ו PET, פלואורסצנציה הדמיה יש גמישות גבוהה כפי שהוא אינו דורש חומרה יקרה וסוכני הדמיה. דוגמה אחת היא הקרינה מבוססי אנדוסקופ מיקרו אנדוסקופ שנוצלו במרפאות. על ידי שילוב של דימות פלואורסצנטי עם שיטות אחרות, אנו מצפים להשיג את היכולת לרכוש גם מידע אנטומי ותפקודי על התהליכים הביולוגיים הבסיסיים.
Acknowledgments
העבודה של Z ו-Y וואנג יאנג התאפשרה על ידי מענק K02 AR051181 מ NIAMS / NIH, מענקי ניוון שרירים האגודה הארוורד לתאי גזע המכון Y וואנג. העבודה של Q ו-X זנג שו נתמכים על ידי מענק תוכנית הוענק מעבדת דימות אופטי מן בריגהאם ובית החולים לנשים. המחברים מבקשים להודות ליו וון מהמחלקה של הרדמה, BWH, עזרה טכנית בעבודה התא.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
References
- Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S.
- Green, fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J.
- Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models. Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).
- Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography. J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).
- Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers. , 107-121 Forthcoming.
- Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).
- In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. Annual Meeting of American Society of Gene Therapy, 2008 May 28-June 1, Boston, Ma, , American Society of Gene & Cell Therapy. Milwaukee, WI. (1985).
- Hoffman, R. M. In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins. Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).
- Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).
- Morgan, J. E., Partridge, T. A.
- Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).
- Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions. J Mol Med. 82, 102-115 (2004).
- Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts. Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).
- Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).
- Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
