Summary
우리는 설명을
Abstract
근육 dystrophies는 수축성 근육 세포의 점진적 상실의 특징 퇴행성 근육 질환의 그룹입니다. 현재 사용 가능한 치료 치료가 없습니다. 줄기 세포 생물학의 최근 발전은 이러한 질병을 치료하는 효과적인 세포 기반 치료법의 개발을위한 새로운 희망을 생성합니다. dystrophic 동물 모델의 근육에 형광 단백질로 표시 줄기 세포의 다양한 종류의 이식이 분야에 광범위하게 사용되고 있습니다. 이식 세포의 운명을 추적하는 기능이있는 비침습 기술은 길이 방향보다 정확하고 효율적으로 이식 세포 근육 engraftment을 평가하는 우리의 능력이 더 있습니다.
현재 연구에서 우리는 생체내 형광 이미징에서 이식 GFP (녹색 형광 단백질) 표시 마우스를 골격 근육에있는 세포를 추적 민감하고 안정적인 방법입니다 보여줍니다. 형광 단백질 여기에 필요한 외부 조명의 사용으로 인해 배경에 대한 우려에도 불구하고, 우리는 어느 누드 마우스를 사용하거나 머리 제거 시약과 머리를 제거하여 더이 문제가 제거되고있는 것으로 나타났습니다. CCD 카메라를 사용하여 형광 신호는 GFP 형질 전환 마우스 또는 eGFP가 myoblast 문화를 transduced 중 하나에서 5 × 10 5 세포의 주입 후에 정강뼈 앞쪽에 (TA) 근육에서 발견하실 수 있습니다. 같은 더 많은 외면적인 근육에 대한 신근의 digitorum longus의 (편집 판단리스트), 적은 수의 세포의 주입은 감지 신호를 생성합니다. 신호 강도가 측정 및이자 (ROI)의 지역에서 초당 방출되는 광자의 개수로 계량하실 수 있습니다. 획득 이미지가 engrafted 지역 demarcating 명확한 경계를 표시 때문에, 투자 수익 (ROI)의 크기뿐만 아니라 측정할 수 있습니다. 다리가 지속적으로 때마다 위치하는 경우, 근육 및 투자 수익 (ROI)의 크기 초당 당 광자의 총수의 변경 engrafted 세포의 숫자의 변화와 engrafted 영역의 크기를 반영합니다. 따라서 시간이 지남에 따라 같은 근육의 변화가 같지는 있습니다. 생체내에서 형광 이미징 기술이 tumorogenic 세포의 성장을 추적하기 위해 주로 사용되고 있습니다, 우리의 연구는 이식 줄기 세포의 운명을 추적하기 위해 우리를있게 해주는 강력한 도구입니다 보여줍니다.
Protocol
셀 준비
- 위성 세포 분리
- 마취에서 GFP 형질 전환 마우스 (C57BL / 카 - βactin - EGFP)의 사지 근육이 제거됩니다. 작은 조각으로 절단 후, 위성 세포 37 1 시간 동안 2 % dispase의 collagenase 솔루션 다진 조직을 잠복기 ° C.를하여 효소 dissociated 아르
- 햄 F - 10 20 % FBS를 포함하는 성장 매체와 효소 소화를 중화, 파스퇴르 피펫과 반복 triturating하여 근육을 떼어 놓다. 세포는 세포 스트레이너 (ø70 - 100μm)를 통해 필터링 후 37에서 1 시간 동안 비 코팅 접시 ° C.에 비쳐지게 만들려합니다
- 부드럽게 콜라겐 코팅 접시에 뜨는와 플레이트를 제거합니다. myoblasts 정화 나중에이 단계 1 시간 반복합니다. (미리 판)
- 시간에 미디어 및 플레이트 세포를 변경합니다. 최종 정화 myoblasts는 매체 햄 F - 10, 20 % FBS, 100 U / ML 페니실린, 37 ° C 5 % CO2와 95 %의 공기를 100 μg / ML 스트렙토 마이신 (의 성장 매체)이있는에 양식 있습니다.
- 문화 10 NG / ML의 기본 FGF의 추가와 함께 성장 매체의 기본 myoblasts을 확장합니다.
- 생체내 실험의 모든을 위해, 우리는 TA의 근육 당 5x10 5 세포를 주입.
- myoblasts을 수확하면, 우리는 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 사용하여 세포를 분리하여 두 번 PBS로 그들을 씻으십시오. 휴대폰 번호는 hemocytometer로 집계되고 세포는 5x10 4 셀 / μl의 농도에 HBSS에 resuspended 있습니다. HBSS에 집중 세포는 얼음에 게재 및 수집 후 1 시간 이내에 주입하고 있습니다.
VIVO 이미징에
- 4~6주의 나이에 남자 MDX 마우스는 잭슨 실험실에서 구입 동물 주거 시설에서 유지 관리됩니다.
- 환경에 숙박 시설 중 하나에 대한 주 후 생쥐는 교양 세포와 이식 준비하고 있습니다.
- 세포 이식하기 전에 마우스 케타민을 (100 MG / kg)과 Xylazine (10 MG / kg)의 혼합물의 intraperitoneal (IP) 주입에 의해 anesthetized 있습니다. 다음 TA 근육 주변 머리가 다리에 나이르를 적용하고 증류수로 깨끗이 닦아 30 초 동안 대기에 의해 제거됩니다.
- 마우스가 마취하에 여전히 있지만, 10μl HBSS에 5x10 5 전지 천천히 30 게이지 바늘을 사용하여 3 점 각 TA 근육에 주입하고 있습니다.
- 4 단계 후, 마우스는 정기적으로 생체내 형광 이미징에 의해 몇 군데하실 수 있습니다. 높은 민감한 전하 결합 카메라가 장착된 형광 이미징 역 NightOwl LB981 (베르톨드 기술 주식 회사)는, 생쥐의 방해 다리의 이미지를 얻는 데 사용됩니다.
- 생체내 이미징에의 날, 우리는 먼저 TA 근육에 머리 regrowth를 확인하십시오. 필요한 경우, 우리는 케타민을과 Xylazine의 혼합으로 마우스를 anesthetizing 후, 위에 설명된대로 머리를 제거하는 나이르를 다시 적용됩니다.
- 마우스가 마취하는 동안, 우리는 검은 비 형광 종이 (스트라 스에서 검은 Artagain 용지)의 작품에 자주 발생하는 위치에 마우스를 놓으십시오. 충분히 더 나은 이미지를위한 TA 근육을 노출하기 위해, 우리는 종이로 뒷다리 발톱 테이프.
- 우리는 이미징 챔버와 위치 카메라의 시야의 중심에 몇 군데로 뒷다리 다리에 마우스를 놓으십시오. 우리는 처음 5 초 노출 시간과 다리의 전통 회색 스케일 사진 사진을 찍을 수있는 방사 필터를 전환합니다. 필요한 경우 카메라의 마우스와 초점의 위치를 재조정. 노출 시간 (1250 MS), 표본의 높이 (0.9 ㎝) 등 이미징 매개 변수는 실험 과정에서 지속적으로 보관됩니다.
- 그러면 녹색 형광 단백질 파장에 해당하는 방출 필터에 스위치. 우리는 1250 MS와 1 비닝 번호 노출 시간 형광 이미지를 가져가라. 이미징 후, 마우스 회복을 기다릴 수있는 케이지에 이미징 챔버에서 제거됩니다.
- 분석을 위해, 우리는 초당 광자의 관점에서 그들의 강도를 측정하는 형광 신호를 통해 관심 영역 (ROI)을 그립니다. 우리는 또한 다른 부량 값으로 픽셀의 측면에서 투자 수익 (ROI)의 크기를 측정합니다. 세로 데이터를 취득하기 위해 필요한 경우 이미징 실험은 몇 개월 동안 더 자주 매주 반복하거나 수 있습니다.
실험의 마지막에는, 마우스 euthanized되고 TA 근육은 조직학 분석에 수확합니다.
Discussion
우리는이 연구에서 호스트 골격근에 형광 표시 이식 세포를 추적하기위한 안정적이고 안정적인 이미지 플랫폼을 설정할 수 있습니다. GFP 유전자 변형 마우스 GFP - 라벨 myoblasts은 향후 세포 치료를위한 후보 것입 성인 줄기 세포의 유형을 나타냅니다. 휴대폰 번호, 휴대 사출, 명확한 배경 이미지 위치 및 기계 매개 변수를 포함하여 지속적인 조작은 높은 품질의 이미지를 확보와 특히 정량 분석을 위해 중요합니다.
형광 이미징은 사용하는 비침습, 쉬운으로 생물 의학 연구에 많은 응용 프로그램을 가지고 있으며, 높은 처리량을하고 있습니다. 또한 형광 이미징의 산란, 감쇠 및 흡수에 의한하지만 광자 건의에 따라 양적 측정을 제공할 수 불빛이 기법의 단점이다 조직에 큰 거리를 침투할 수 없습니다. 노력은 빛의 침투 깊이를 높이기 위해 빨간색이나 가까운 적외선 기자를 사용하여 진행되었습니다.
형광 이미징의 또 다른 장점은 특정 형광 기자가 인간의 사용 승인을하는 경우가 클리닉에 번역되어있다. 그것이 고가의 하드웨어 및 이미징 에이전트를 필요로하지 않으므로 MRI, CT 및 PET과 비교, 형광 이미징 높은 유연성을했다. 한 예로 클리닉에서 사용되었습니다 형광 기반의 내시경 및 마이크로 내시경이다. 다른 modalities와 형광 이미징을 결합함으로써, 우리는 기본적인 생물 학적 과정에 대한 해부학 및 기능 정보를 모두 얻을 수있는 기능을 달성하기 위해 기대하고 있습니다.
Acknowledgments
Z 양 및 Y 왕의 작품은 NIAMS / NIH에서 교부금 K02 AR051181, 근육질 영양 장애 협회와 Y 왕에 대한 하버드 줄기 세포 연구소에서 부여에 의해 가능하게되었다. Q Zeng 및 X 쑤의 작품은 브리검 앤드 위민스 병원에서 광학 이미징 연구실에게 수여 프로그램 부여에 의해 지원됩니다. 저자는 셀 작업에 기술적인 도움을 마취학과, BWH에서 웬 리우 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
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