Summary
Vi beskriver ett
Abstract
Muskeldystrofi är en grupp av degenerativa muskel sjukdomar som kännetecknas av progressiv förlust av kontraktila muskelceller. För närvarande finns ingen botande behandling att tillgå. Senaste framstegen inom stamcellsbiologi har genererat nya förhoppningar för att utveckla effektiva cellbaserade terapier för behandling av dessa sjukdomar. Transplantation av olika typer av stamceller märkta med fluorescerande proteiner i musklerna dystrofa djurmodeller har använts i stort sett i fält. En icke-invasiv teknik med möjlighet att spåra de transplanterade celler öde längden kan ytterligare vår förmåga att bedöma muskler engraftment av transplanterade celler mer noggrant och effektivt.
I den aktuella studien visar vi att in vivo fluorescens avbildning är en känslig och tillförlitlig metod för att spåra transplanterade GFP (grönt fluorescerande protein)-märkta celler i musen skelettmuskulaturen. Trots den oro bakgrunden på grund av användningen av ett externt ljus som behövs för excitation av fluorescerande proteinet, fann vi att med hjälp av antingen naken mus eller eliminera hår med reagenser hårborttagning mycket av detta problem elimineras. Med hjälp av en CCD-kamera, kan fluorescerande signal detekteras i tibialis anterior (TA) efter injektion av 5 x 10 5 celler från antingen GFP transgena möss eller EGFP transduced myoblast kultur. För mer ytliga muskler som extensor digitorum longus (EDL), injektion av färre celler ger en detekterbar signal. Signalstyrka kan mätas och kvantifieras som antalet utsända fotoner per sekund i en region av intresse (ROI). Eftersom de förvärvade Bilderna visar tydliga gränser som avgränsar engrafted området, kan storleken på ROI mätas också. Om ben placeras konsekvent varje gång, förändringarna i antalet fotoner per sekund per muskel och storlek på ROI återspegla förändringarna i antalet engrafted celler och storleken på engrafted området. Därför är de förändringar i samma muskel över tiden kan kvantifieras. In vivo fluorescerande bildteknik har använts främst för att spåra tillväxten av tumorogenic celler, visar vår studie att det är ett kraftfullt verktyg som ger oss möjlighet att spåra öde transplanterade stamceller.
Protocol
Cellberedningen
- Satellit-cell isolering
- Under bedövning, är lem muskler GFP transgena möss (C57BL / Ka-βactin-EGFP) bort. Efter skär i små bitar, satellit-cellerna enzymatiskt dissocierade genom inkubering av malet vävnaden med 2% dispase kollagenas lösning under 1 timme vid 37 ° C.
- Neutralisera enzymet uppslutning med tillväxt media som innehåller Ham F-10 och 20% FBS, särskilja muskeln genom upprepad finfördelande med en pasteurpipett. Cellerna är filtrerad genom en cell sil (Ø70-100μm) och sedan pläterade på icke-coated fat under 1 timme vid 37 ° C.
- Ta försiktigt bort supernatanten och platta dem på en kollagen bestruket maträtt. Upprepa detta steg 1 timme senare för att rena myoblasts. (Pre-platta)
- Byt media och platta celler i tiden. Den slutliga renade myoblasts odlas i medium som innehåller Ham F-10, 20% FBS, 100 U / ml penicillin, och 100 mikrogram / ml streptomycin (tillväxt medium) vid 37 ° C med 5% CO2, 95% luft.
- Kultur och expandera den primära myoblasts tillväxt medium med tillsats av grundläggande FGF på 10 ng / ml.
- För alla in vivo-experiment, injicera vi 5x10 5 celler per TA muskler.
- Vid skörd av myoblasts, lossa vi cellerna genom att använda 0,25% trypsin / EDTA och tvätta dem med PBS två gånger. I cell nummer räknas med hemocytometer och cellerna är suspenderade i HBSS vid en koncentration av 5x10 4 celler / mikroliter. Den koncentrerade celler i HBSS läggs på is och injiceras inom 1 timme efter provtagningen.
In Vivo Imaging
- Man mdx möss i en ålder av 4-6 veckor köps från Jackson labb och underhålls på ett djurstall anläggning.
- Efter ungefär en veckas boende till miljön, möss är redo att implanteras med odlade celler.
- Innan celltransplantation är musen bedövas genom en intraperitoneal (ip) injektion av en blandning av Ketamin (100 mg / kg) och Xylazine (10 mg / kg). Då håret runt TA muskeln område tas bort genom att Nair på benet och vänta i 30 sekunder för att torka rent med destillerat vatten.
- Även musen är fortfarande under narkos, är 5x10 5 celler i 10μl HBSS långsamt injiceras i varje TA muskel på 3 poäng med en 30 gauge nål.
- Efter steg 4, kan musen regelbundet avbildas av in vivo fluorescens avbildning. Den fluorescens avbildning stationen Nightowl LB981 (Berthold Technologies, Inc.), utrustad med en högkänslig charge-coupled kamera används för att få bilder från hindra benen på möss.
- På dagen för in vivo imaging, kontrollerar vi först hår återväxt på TA muskeln. Om det behövs, vi ny ansökan Nair att ta bort hår som beskrivits ovan, efter anesthetizing musen med den blandning av ketamin och xylazin.
- Medan musen är under narkos, placerar vi musen i en utsatt position på en bit svart icke fluorescerande papper (svart Artagain papper från Strathmore). För att till fullo avslöja TA muskeln för bättre avbildning, tejp vi hinden tassar på papperet.
- Vi lägger musen i bildbehandling kammare och placera bakben som ska avbildas i centrum av synfältet på kameran. Vi först växla ut utsläpp filtret för att ta en traditionell gråskala fotografisk bild av benet med en exponeringstid på 5 sekunder. Justera positionen för musen och fokus på kameran om det behövs. Den avbildning parametrar inklusive exponeringstid (1250 ms), prov höjd (0,9 cm) etc. hålls konstanta i den experimentella processen.
- Vi växlar sedan i lämpliga utsläppsnormer filtret för det grönt fluorescerande proteinet våglängd. Vi tar fluorescens bild med en exponeringstid på 1250 ms och en binning antal 1. Efter avbildning, är musen bort från avbildning kammaren till en bur att vänta återhämtning.
- För analys, drar vi en region av intresse (ROI) över fluorescerande signaler för att mäta deras intensitet i form av fotoner per sekund. Vi mäter också storleken på ROI i termer av antalet pixlar som en annan kvantifiering värde. Den avbildning experimenten kan upprepas varje vecka eller oftare under ett par månader, om det behövs, att förvärva longitudinella data.
I slutet av experiment, är musen euthanized och TA muskler skördas för histologi analys.
Discussion
Vi satte upp en tillförlitlig och stabil avbildning plattform för att spåra fluorescens märkt transplanterade cellerna i mottagarländerna skelettmuskulaturen i denna studie. GFP-märkta myoblasts från GFP transgen mus stöd för en typ av stamceller som kommer att vara kandidater för cellterapi i framtiden. En ständig manipulation, inklusive mobilnummer, cell injektion, tydlig bakgrund, bildbehandling position och maskinens parameter är viktig för att få hög bildkvalitet och speciellt för kvantitativ analys.
Fluorescens avbildning har många användningsområden inom den biomedicinska forskningen eftersom den är icke-invasiv, lätt att använda, och har en hög genomströmning. Dessutom fluorescens avbildning kan ge ett kvantitativt mått baserat på fotonen räknas, men på grund av spridning, dämpning och absorption kan ljuset tränga in inte ett stort avstånd i vävnad, vilket är en brist av tekniken. Insatser har pågått för att använda röd eller nära infraröda reporter att öka penetration av ljus.
En annan fördel med fluorescens avbildning är att det är att överföra till kliniker om den specifika fluorescerande reporter är godkänd för humant bruk. Jämfört med MR, CT och PET har fluorescens avbildning hög flexibilitet, eftersom det inte kräver dyr hårdvara och agenter avbildning. Ett exempel är fluorescens-baserade endoskop och mikro-endoskop som har använts på kliniker. Genom att kombinera fluorescens avbildning med andra modaliteter, förväntar vi oss att få möjlighet att få både anatomisk och funktionell information om de underliggande biologiska processerna.
Acknowledgments
Arbetet med Z-Yang och Y Wang har gjorts möjlig genom bidrag K02 AR051181 från NIAMS / NIH anslag från muskeldystrofi Association och Harvard Stem Cell Institute för Y Wang. Arbetet med Q Zeng och X Xu stöds av ett program för bidrag som beviljas för optisk avbildning Lab från Brigham and Women sjukhus. Författarna vill tacka Wen Liu från Department of anestesi, BWH för teknisk hjälp i cell arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
References
- Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S.
- Green, fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J.
- Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models. Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).
- Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography. J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).
- Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers. , 107-121 Forthcoming.
- Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).
- In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. Annual Meeting of American Society of Gene Therapy, 2008 May 28-June 1, Boston, Ma, , American Society of Gene & Cell Therapy. Milwaukee, WI. (1985).
- Hoffman, R. M. In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins. Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).
- Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).
- Morgan, J. E., Partridge, T. A.
- Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).
- Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions. J Mol Med. 82, 102-115 (2004).
- Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts. Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).
- Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).
- Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
