Summary
हम एक का वर्णन
Protocol
सेल तैयारी
- सैटेलाइट सेल अलगाव
- चतनाशून्य करनेवाली औषधि के तहत, GFP ट्रांसजेनिक चूहों (C57BL / का βactin-EGFP) के अंग की मांसपेशियों को हटा रहे हैं. छोटे - छोटे टुकड़ों में काटने के बाद, उपग्रह कोशिकाओं dispase collagenase समाधान के 1 घंटे के लिए 2% के साथ 37 पर कीमा बनाया हुआ ऊतक डिग्री सेल्सियस incubating enzymatically dissociated
- विकास F-10 हाम और 20% FBS युक्त मीडिया के साथ एंजाइम पाचन बेअसर करने के लिए, एक पाश्चर विंदुक के साथ दोहराया triturating द्वारा मांसपेशियों को अलग कर देना. कोशिकाओं एक सेल झरनी (ø70 100μm) के माध्यम से फ़िल्टर्ड रहे हैं और फिर 37 पर एक 1 घंटे के लिए गैर लेपित पकवान डिग्री सेल्सियस पर चढ़ाया
- धीरे सतह पर तैरनेवाला और उन्हें एक कोलेजन लेपित पकवान पर थाली हटा दें. दोहराएँ इस कदम 1 घंटे बाद myoblasts शुद्ध. (पूर्व प्लेट)
- समय में मीडिया और प्लेट कोशिकाओं बदलें. अंतिम शुद्ध myoblasts मध्यम हाम एफ 10-, 20% FBS, 100 / यू मिलीलीटर पेनिसिलिन, और 37 ° 5% सीओ 2 के साथ सी, 95% हवा में 100 / μg मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन (मध्यम विकास) युक्त में सुसंस्कृत हैं.
- संस्कृति और 10 एनजी / मिली की बुनियादी FGF के अलावा के साथ मध्यम विकास में प्राथमिक myoblasts का विस्तार.
- Vivo में प्रयोगों में सब के लिए, हम 5 5x10 प्रादेशिक सेना मांसपेशियों प्रति कोशिकाओं इंजेक्षन.
- जब कटाई myoblasts, 0.25% / trypsin EDTA का उपयोग करके हम कोशिकाओं को अलग और पीबीएस के साथ उन्हें दो बार धोने. सेल नंबर एक hemocytometer के साथ गिना जाता है और कोशिकाओं HBSS में 5x10 4 कोशिकाओं / μl की एकाग्रता में resuspended हैं . HBSS में केंद्रित कोशिकाओं बर्फ पर रखा जाता है और संग्रह के बाद एक घंटे के भीतर इंजेक्शन.
Vivo इमेजिंग में
- 4-6 सप्ताह की आयु पर पुरुष MDX चूहों जैक्सन प्रयोगशाला से खरीदा जाता है और एक जानवर आवास की सुविधा में बनाए रखा.
- पर्यावरण के लिए आवास के बारे में एक सप्ताह के बाद, चूहों संवर्धित कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया जा के लिए तैयार हैं.
- कोशिका प्रत्यारोपण से पहले, माउस Ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) और Xylazine (10 मिग्रा / किग्रा) के मिश्रण का एक intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) के द्वारा anesthetized है. फिर प्रादेशिक सेना मांसपेशियों के आसपास के क्षेत्र बाल पैर नायर को लागू करने और 30 सेकंड के लिए इंतजार कर यह आसुत जल के साथ स्वच्छ पोंछ द्वारा हटा दिया जाता है.
- जबकि माउस संज्ञाहरण के तहत अभी भी है, 5x10 10μl HBSS में 5 कोशिकाओं को धीरे धीरे 3 एक 30 गेज सुई का उपयोग बिंदुओं पर प्रत्येक प्रादेशिक सेना की मांसपेशी में अंतःक्षिप्त है.
- 4 कदम के बाद, माउस नियमित रूप से vivo प्रतिदीप्ति इमेजिंग में imaged किया जा सकता है. प्रतिदीप्ति इमेजिंग स्टेशन NightOwl LB981 (Berthold टेक्नोलॉजीज इंक), एक उच्च संवेदनशील कैमरा आरोप युग्मित के साथ सुसज्जित, चूहों की बाधा पैरों से छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- Vivo इमेजिंग में दिन पर, हम पहले प्रादेशिक सेना मांसपेशियों पर बाल regrowth की जाँच करें. यदि आवश्यक हो, हम नायर फिर से लागू करने के लिए बाल ऊपर वर्णित के रूप में निकाल Ketamine और Xylazine के मिश्रण के साथ माउस anesthetizing के बाद.
- जबकि माउस संज्ञाहरण के अंतर्गत है, हम काले कागज गैर फ्लोरोसेंट (Strathmore से काले Artagain कागज) का एक टुकड़ा पर एक प्रवण स्थिति में माउस जगह है. पूरी तरह से बेहतर इमेजिंग के लिए प्रादेशिक सेना मांसपेशियों का पर्दाफाश करने के लिए, हम कागज के लिए हिंद पंजे टेप.
- हम इमेजिंग कक्ष और कैमरे के दृश्य के क्षेत्र के केंद्र में imaged किया जा हिंद पैर की स्थिति में माउस जगह है. हम पहली बार बाहर उत्सर्जन फिल्टर स्विच करने के लिए एक पारंपरिक ग्रे पैमाने पर 5 सेकंड के एक जोखिम समय के साथ पैर के फोटो चित्र ले. और यदि आवश्यक हो तो कैमरे के माउस और ध्यान की स्थिति बदल डालना. जोखिम समय (1250 एमएस), नमूना ऊंचाई (0.9 सेमी) आदि सहित इमेजिंग मापदंडों प्रयोगात्मक प्रक्रिया में स्थिर रखा जाता है.
- हम तो हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन तरंग दैर्ध्य के लिए उपयुक्त उत्सर्जन फिल्टर में स्विच. हम एमएस 1250 और 1 के एक binning संख्या का एक जोखिम समय के साथ प्रतिदीप्ति छवि ले. इमेजिंग के बाद, माउस इमेजिंग कक्ष से वसूली इंतजार पिंजरे से निकाल दिया जाता है.
- विश्लेषण के लिए, हम फ्लोरोसेंट संकेत से अधिक ब्याज की एक क्षेत्र (आरओआई) को आकर्षित करने के लिए प्रति सेकंड photons के मामले में उनकी तीव्रता को मापने. हम भी एक और मात्रा का ठहराव मूल्य के रूप में पिक्सेल की संख्या के मामले में रॉय के आकार को मापने. इमेजिंग प्रयोगों को हर हफ्ते दोहराया जा सकता है या अधिक बार कुछ महीनों में, अगर जरूरत थी, अनुदैर्ध्य डेटा प्राप्त करने.
प्रयोगों के अंत में, माउस और euthanized है और प्रादेशिक सेना की मांसपेशी ऊतक विज्ञान के विश्लेषण के लिए काटा जाता है.
Discussion
हम इस अध्ययन में मेजबान कंकाल की मांसपेशी में प्रतिदीप्ति लेबल प्रतिरोपित कोशिकाओं पर नज़र रखने के लिए एक विश्वसनीय और स्थिर इमेजिंग मंच सेट. GFP ट्रांसजेनिक माउस से GFP लेबल myoblasts वयस्क स्टेम सेल का एक प्रकार है कि भविष्य में सेल थेरेपी के लिए उम्मीदवार हो जाएगा के लिए खड़ा है. एक निरंतर हेरफेर सेल नंबर, सेल इंजेक्शन, साफ पृष्ठभूमि, इमेजिंग स्थिति और मशीन पैरामीटर सहित उच्च गुणवत्ता छवि को पाने के लिए और विशेष रूप से मात्रात्मक विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है.
प्रतिदीप्ति इमेजिंग जैव चिकित्सा अनुसंधान में कई आवेदन किया है के रूप में इसे गैर इनवेसिव, उपयोग करने के लिए आसान है, और एक उच्च throughput है. इसके अलावा प्रतिदीप्ति इमेजिंग एक मात्रात्मक माप फोटोन मायने रखता है, हालांकि बिखरने क्षीणन, और अवशोषण के कारण के आधार पर प्रदान कर सकते हैं, प्रकाश ऊतकों में एक बड़ी दूरी है, जो तकनीक की कमी है नहीं घुसना कर सकते हैं. लाल या अवरक्त के पास रिपोर्टर का उपयोग करने के लिए प्रकाश के प्रवेश गहराई बढ़ाने के प्रयास चल गया है.
प्रतिदीप्ति इमेजिंग के एक और लाभ यह है कि यह क्लीनिकों के लिए अनुवाद है अगर विशिष्ट फ्लोरोसेंट संवाददाता मानव उपयोग के लिए मंजूरी दे दी है. प्रतिदीप्ति इमेजिंग एमआरआई, सीटी, और पीईटी के साथ तुलना में, उच्च लचीलापन है के रूप में यह महंगा हार्डवेयर और इमेजिंग एजेंट की आवश्यकता नहीं है. एक उदाहरण प्रतिदीप्ति आधारित endoscope के और सूक्ष्म endoscope है कि क्लीनिक में इस्तेमाल किया गया है. अन्य रूपरेखा के साथ प्रतिदीप्ति इमेजिंग के संयोजन से, हम अंतर्निहित जैविक प्रक्रियाओं के बारे में दोनों शारीरिक और कार्यात्मक जानकारी प्राप्त करने की क्षमता हासिल करने की उम्मीद है.
Acknowledgments
Z यांग और वाई वैंग काम K02 अनुदान NIAMS / NIH से AR051181, पेशी Dystrophy एसोसिएशन और वाई वैंग के लिए हार्वर्ड स्टेम सेल इंस्टीट्यूट से अनुदान द्वारा संभव बनाया गया था. क्यू ज़ेंग और एक्स Xu के काम एक कार्यक्रम के ब्रिघम और महिला अस्पताल से ऑप्टिकल इमेजिंग लैब के लिए सम्मानित किया अनुदान द्वारा समर्थित हैं. लेखकों वेन लियू संज्ञाहरण के विभाग, BWH, से सेल के काम में तकनीकी मदद के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
References
- Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. Fluorescence imaging of tumors in vivo. Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).
- Green, fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. Three-dimensional fluorescence lifetime tomography. Med Phys. 32, 992-1000 (2005).
- Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models. Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).
- Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography. J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).
- Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers. , 107-121 Forthcoming.
- Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).
- In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. Annual Meeting of American Society of Gene Therapy, 2008 May 28-June 1, Boston, Ma, , American Society of Gene & Cell Therapy. Milwaukee, WI. (1985).
- Hoffman, R. M. In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins. Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).
- Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).
- Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).
- Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions. J Mol Med. 82, 102-115 (2004).
- Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts. Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).
- Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).
- Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
