Summary
L'assemblaggio di un microscopio a raggi infrarossi per nearfield aggregati proteici di imaging è descritto.
Abstract
Questo lavoro si propone di istruire il lettore nel montaggio e funzionamento di un vicino infrarosso microscopio a campo per l'imaging oltre il limite di diffrazione. Il apertureless microscopio a campo vicino è una luce scattering-tipo di strumento che fornisce gli spettri infrarossi a circa 20 nm risoluzione. Un elenco completo dei componenti e uno step-by-step del protocollo per l'uso è fornito. Gli errori più comuni in assemblea e messa a punto dello strumento sono discussi. Un insieme rappresentativo di dati che mostra la struttura secondaria di fibrille amiloidi è presentato.
Protocol
Di fondo:
Apertureless sonda di campo vicino microscopia IR offre immagini ad alta risoluzione spaziale. Si tratta di una tecnica relativamente nuova, in cui è diffusa un fascio incidente a infrarossi da un forte microscopia a forza atomica (AFM) punta oscilla alla frequenza di risonanza del cantilever vicino al campione. Un rivelatore IR raccoglie la luce diffusa ed è demodulato a questa frequenza di risonanza o sue armoniche. In questo modo, la dispersione sfondo della vicenda fascio laser focalizzato sul resto della superficie del campione può essere ridotta e una risoluzione spaziale ben oltre il limite di diffrazione della luce può essere raggiunto per ottenere contrasto infrarossi con risoluzione nanometrica i spaziale, II, III . Dal momento che l'apice della punta AFM è molto più piccola della zona focale del fascio laser, la luce diffusa è debole. Al fine di migliorare questo campo diffuso, viene utilizzato il rilevamento omodina dove un campo di riferimento viene aggiunto al campo di raccolta sparsi e la fase relativa dei campi è impostato in modo che l'interferenza costruttiva si verifica al massimo il rivelatore. L'intensità di scattering è quindi proporzionale alla grandezza del campo elettrico di riferimento IV, V, VI. Una questione importante nel campo vicino di imaging è di evitare gli artefatti prodotti dal z-movimento della punta AFM VII, VIII, IX, X, XI. Questo problema può essere ridotto con una corretta regolazione della fase omodina ed escluse le grandi caratteristiche topografiche, come precedentemente dimostrato da Mueller et al. Questa tecnica è affidabile poi utilizzato per ottenere lo spettro sperimentale dispersione di materiali con una risoluzione spaziale di meno di 30 nm 15 . L'uso del campo vicino microscopia dei materiali biologici è stato dimostrato in precedenza, in particolare per macromolecole quali virus del mosaico del tabacco xii e xiii batteri E. Coli.
In questo rapporto, ci illustrano il montaggio di tale dispositivo di imaging. Siamo presenti anche informazioni secondarie struttura di fibrille amiloidi formate dai frammenti # 21-31 peptide di β 2-m ottenuto apertureless campo vicino microscopia a scansione a raggi infrarossi (ANSIM). Near-field immagini sono raccolte in concomitanza con la topografia, consentendo la rilevazione e la raccolta dello spettro di dispersione di fibrille individuali.
Il nostro apertureless campo vicino la scansione a raggi infrarossi microscopio (ANSIM) misurazioni è un dispositivo fatto in casa. Lo schema del setup sperimentale è mostrato nello Schema 1. Un microscopio AFM (Multimode, Veeco Instruments, Santa Barbara, CA) è utilizzato per misurare la topografia del campione oltre a produrre il campo vicino dispersione maggiore modulato alla frequenza di oscillazione della punta. Tapping-mode, NSC14/Ti-Pt platino rivestita cantilever (MicroMasch, Estonia) vengono utilizzati per migliorare la dispersione del continuo, laser sintonizzabile IR (gamma di frequenza: 2000 cm -1 a 1600 cm -1, PL3 laser a gas CO, Strumenti Edimburgo, Gran Bretagna) in prossimità della superficie. Un laser elio neon (Melles Griot, Albuquerque, NM) campo è utilizzato come guida per la radiazione infrarossa invisibile. La luce laser a infrarossi si propaga verso un obiettivo dopo aver superato un riflettore ZnSe parziale. E 'poi focalizzata sulla apice della punta AFM oscillante, con la polarizzazione del fascio parallela all'asse lungo della sonda. La radiazione IR raccolti dalla lente viene quindi aggiunto a un segnale omodina di riferimento. Uno specchio paraboloidal viene usato per concentrare la radiazione IR su un tellururo di cadmio, mercurio (MCT) rilevatore a infrarossi (Infrared Graseby, Orlando, FL). Un driver piezo (Thorlabs, Newton, NJ) è utilizzata per massimizzare il segnale rilevato correggendo la fase della luce omodina. La maggior parte dei componenti ottici sopra descritte sono solidamente apposta su una piattaforma e spostata in XY o Z posizioni utilizzando una fase traslazionale. La frazione AC del segnale rilevato viene trasmesso ad un amplificatore lock-in (modello SR844 RF, Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA) che demodula il segnale alla frequenza di oscillazione della punta. L'intensità di scattering si osserva come la punta AFM esplora la superficie del campione e dati topografici si ottiene contemporaneamente. Il software utilizzato per la raccolta di dati e immagini è Nanoscope V5.31r1 (Veeco Instruments, Santa Barbara, CA).
Scheme1 
Figura 1 - mostra le parti del sistema di imaging il cui montaggio ed uso verranno descritti 
0) tavolo ottico
1) Base di MM AFM
2) Scanner di MM AFM
3) breadboard elevati ottico
(13 "x 18" x 3 / 8 ", Thorlabs)
4) specchi guida ("dia rivestiti d'oro, 1.)
7) Tubo ottico utilizzato per assicurare l'installazione sulla piattaforma elevabile (17)
8) obiettivo IR
(FL 16 mm, NA 0.28, Ealing)
9) Tubo ottico per la raccolta di back-luce diffusa
10) Cube w / fuori asse specchio paraboloidal
(90 °, FL 5 ", Janos)
11) Cubo di tenere piastra Ge @ 45 °
12) Microscopio oculare (x10)
13) XY stadi montato foro stenopeico (0,5 mm)
14) MCT rivelatore di raggi infrarossi (Infrared Graseby)
15) preamplificatore rivelatore IR (AC e DC)
16) XY per spostare la posizione del fascio
17) tavola elevazione di focalizzare il fascio
18) Z-stadio per posizionare il rivelatore IR
19) X-stadio per posizionare il rivelatore IR
Assemblea passo I.1
Montare la configurazione ottica e con specchi tuning e la posizione del Elio-Neon (HeNe) fascio parallelo al tavolo ottico (0) all'altezza di circa corretta (H) al di sopra della basetta ottico (3) e la distanza (D) dal centro della scanner (2).
Questa altezza H e la distanza D può essere definita l'altezza (H1) del campione sulla parte superiore dello scanner (2) dalla tabella ottico, angolazione desiderata di incidenza (α), l'altezza della parte superiore della basetta sopra la tabella ottico (h), dimensioni geometriche del cubo ottico e obiettivo IR (6 e 8 in Figura 1) e la distanza di lavoro di obiettivo IR (tutti insieme d, qui d = 1 "+2" +2 ")
Figura 2 
H = H1 + d * sin (α)-h
D = d * cos (α)
Assemblea passo I.2
Figura 3 
Figura 3: Senza il beamsplitter nel cubo (5) e allungata con tubo ottico all'altra estremità del cubo (6) diretta He-Ne fascio attraverso l'iride attaccato alle estremità dei tubi.
Assemblea passo I.3
Figura 4 
Figura 4: Con lo scanner (2) rimosso, collegare il lungo tubo ottico con l'iride, alla fine al posto dell'obiettivo IR. Inserire il riflettore ZnSe parziale per dirigere il fascio verso il campione che viaggia attraverso il lungo tubo ottico. Il riflettore ZnSe parziale deve essere fissata in modo che il raggio HeNe colpisce la superficie frontale del riflettore nel centro geometrico del cubo ottico tenendo premuto il riflettore parziale.
Figura 5 
Figura 5: Ruotando il riflettore parziale, dirigere il fascio HeNe attraverso il diaframma di uscita chiuso. Dal momento che il monte del riflettore parziale non tenerlo esattamente perpendicolare, ci sono due in casa installato viti di regolazione, consentendo il movimento verticale del fascio. Utilizzare tali, se necessario.
Figura 6 
Assemblea passo I.4
Figura 6. Montare lo specchio paraboloidal con gomma O-ring nel cubo ottico (vedi 1, Figura 5). Serrando le viti, gli O-ring comprimere inoltre, la regolazione dello specchio.
Figura 7 
Con specchi supplementari (uno è mostrata in Figura 7) dirigere il fascio HeNe nella direzione opposta, come illustrato in figura 7. Regolare il fascio di passare attraverso l'iride precedentemente utilizzato. Questo fascio verrà utilizzato per regolare lo specchio paraboloidal.
Figura 8 
Figura 8: Uno specchio paraboloidal posto nel cubo ottici (10) riflette la luce verso la posizione del rivelatore. Viti di regolazione dirigere il fascio attraverso il foro posto al di uscita del cubo (11), che si terrà il (Ge) germanio finestra. Dopo che il fascio è sintonizzato attraverso il foro stenopeico, luogo d MCTetector vicino al foro stenopeico. Regolare la posizione del rilevatore a infrarossi in modo tale che He-Ne fascio è l'elemento sensibile del rivelatore. Spostare il rivelatore dalla ~ 2 mm (IR raggio sarà spostata dalla finestra Ge).
Assemblea passo I.5
Figura 9 
Figura 9: inserire il monte con finestra Ge in cubo ottici (11). L'anti-riflesso (AR) rivestito finestra Ge funge da filtro IR e permette osservazioni visuali del cantilever e il campione. Attaccare l'oculare (12). Torsione angolo del cubo (11) rispetto a cubo (10) permette di puntare il oculare nella direzione desiderata. Ruotando il montaggio della finestra Ge, il raggio HeNe è diretto attraverso il centro dell'oculare.
Figura 10 
Figura 10: Collegamento IR obiettivo (8) e AFM scanner (2). Fissare il beamstop alla fine di uscita del tubo ottico (5). Utilizzare un filtro protettivo durante la visualizzazione del fascio HeNe attraverso l'oculare. Posizione di un campione sullo scanner e dirigere il fascio HeNe attraverso il tubo di ingresso ottico (5). Assicurarsi che il fascio HeNe è sufficientemente ampia per traboccare il beamstop. Il beamstop viene utilizzato perché l'obiettivo Cassegrain, che raccoglie solo la luce in arrivo dalla periferia del fascio. Regolando il filo dell'oculare un'immagine nitida del fascio HeNe focalizzato sul campione si ottiene.
Assemblea passo I.6
Una messa a punto finale di specchio paraboloidal è richiesto. Il foro di uscita è sostituita con l'iride nella posizione focale dello specchio paraboloidal. Rimuovere la finestra di Ge e il rivelatore IR (posizione marchio di sensore IR!). Fissare un obiettivo aggiuntivo dopo l'iride alla lunghezza approssimativa focale dell'obiettivo da l'iride. In questo momento il impegnati a sbalzo deve essere visibile attraverso l'obiettivo. Regolare la posizione dello specchio paraboloidal al centro la fine della punta attraverso l'iride chiuso. Si noti che quando il raggio HeNe è correttamente focalizzato sulla punta, fa una scintilla luminosa tra la punta ed è una riflessione sulla superficie del campione. Ricollegare la finestra di Ge; regolarlo per una comoda osservazione visuale del cantilever. Sostituire l'iride con il foro stenopeico e ricordate che il foro utilizzato per il rilevamento a infrarossi dovrebbe essere spostato fuori dal centro a causa dello spostamento del fascio IR dalla finestra Ge. Posizionare il rivelatore IR nella posizione precedentemente segnata.
Infine, dirigere il fascio di raggi infrarossi in modo che cammina con il fascio HeNe visibile utilizzati per il tuning.
Ora tutto dovrebbe essere pronto per la regolazione di routine.
Regolazione di routine:
Regolazione passo A.1:
Allineamento con HeNe-Laser
E 'più facile allineamento con il HeNe visibile (632nm) che con l'invisibile IR (circa 6μm).
Il percorso del HeNe e dei raggi IR si uniscono allo specchio ribaltabile. Se questo specchio è inclinato verso il basso il HeNe può passare, se lo specchio è in posizione il raggio IR si propaga al campo vicino installazione. Per l'allineamento di una delle travi solo, non utilizzare i due specchi in comune con l'altro percorso e si trovano davanti allo specchio ribaltabile. Se avete accidentalmente spostato un altro specchio, in primo luogo cercare di portare questo specchio torna nella sua vecchia posizione.
A.1.1. Allineamento grossolana con due specchi
Utilizzare i due specchi nei pressi del laser HeNe per allineare il fascio in tutte le iridi lungo il percorso del campo vicino stadio. Se si guarda la trave nel braccio omodina, una corona come profilo del fascio devono essere osservati (a causa del blocco del fascio nel tubo ottico). Ciò indica che il raggio passa direttamente attraverso i tubi.
A1.2. Allineamento fine con near-field Stadio
Fissare la testa AFM e coinvolgere la punta a sbalzo sul campione. Concentrare il raggio HeNe sull'estremità del cantilever imaging. Se così facendo sposta il raggio a partire dalla metà del tubo di ingresso ottico (5) ripetere i passi di sintonia A.1. e A.1.2. fino a quando il fascio è centrato.
Spostando il palcoscenico traslazionale ottica, l'obiettivo microscopio riflettente è regolata per focalizzare la luce sul vertice della punta cantilever, dove si sparse.
Ruotare lo specchio Ge sotto l'oculare (che si trova nel cubo ottico) e guardare attraverso l'oculare. Il fascio è focalizzato a questo punto (o il rivelatore IR quando lo specchio Ge è tirato fuori dal cubo) dallo specchio paraboloidal. Spostare lo stadio indietro o in avanti fino a un'immagine nitida della punta e il suo riflesso sulla superficie del campione si osserva. Utilizzare i due oci direzioni (alto / basso e destra / sinistra) per posizionare la punta AFM circa a metà dell'oculare.
Guardando attraverso un telescopio, il cantilever AFM e la sua punta si osserva. Anche in questo caso, ricordatevi di usare un filtro protettivo durante la visualizzazione del fascio HeNe. Senza il raggio HeNe, po 'di luce rossa si osserva ancora che nasce dalla luce interna del controllo a distanza AFM. Spostare lo stadio traslazionale in un destra-sinistra e / o direzione alto-basso fino a quando una scintilla di colore rosso vivo è osservata della punta. Se l'allineamento è abbastanza cattivo, spostare il palco per la sinistra del AFM e spostare verso destra lentamente. Guardare per un riflesso rosso che si muove attraverso la superficie riflettente del campione. Se il riflesso rosso non è ancora osservato, tradurre la fase di nuovo a sinistra e si muovono in un up-down. Tenere tradurre sinistra-destra, alto-basso fino a quando una scintilla rossa si osserva come ci si concentra il fascio HeNe all'apice della punta AFM.
A1.3. Sovrapposizione del campo omodina con luce diffusa
Aprire il braccio omodina e sguardo approfondito l'oculare. Tre o più punti in una linea con intensità decrescente è visto e queste macchie sono il risultato di riflessioni multiple sulla fronte e fondoschiena di ottiche diverse. Spostare lo specchio nel braccio omodina in modo che il secondo posto (dal basso e di intensità) si sovrappone con l'immagine brillante della punta, che è dove la punta e la sua riflessione si uniscono.
A1.4. Posizionare il rilevatore
Rimuovere lo specchio Ge e il fascio HeNe dovrebbe andare nella direzione in cui si trova il rivelatore IR. Dietro il tubo ottico, due macchie a forma di anello siano rispettate. Il secondo posto (in intensità) è il luogo che dovrebbe passare attraverso il foro del foglio di protezione termica sulla faccia del rivelatore IR. Lo spot con la più alta intensità dovrebbe essere visto sul bordo del foro.
A1.5. Il passaggio da un campione ad un altro
Dopo aver modificato il campione la punta AFM non è più nella stessa posizione di prima, ma non dovrebbe essere troppo lontano. Inizia con passo A.1.2, dal momento che la differenza non è normalmente molto grandi.
Nota: Se l'allineamento è spenta, verificare se il raggio HeNe passa ancora attraverso tutte le iridi e crea una scintilla di colore rosso vivo sulla punta AFM. A volte non si nota che hai toccato e quindi spostato uno specchio dalla sua posizione originale. Se l'allineamento è ancora brutto, purtroppo l'intera procedura di allineamento deve essere completata di nuovo.
Regolazione fase 2: Allineamento del fascio IR
Utilizzare una linea laser CO con un alta intensità / potenza (almeno 100 mW) in quanto ciò renderà più facile l'allineamento. Riempire il rivelatore con azoto liquido e lasciare equilibrare per almeno 30 minuti.
2.1. Allineamento grossolana con due specchi
Posizionare un misuratore di potenza dietro l'iride primi a monitorare la potenza del fascio in ingresso IR. Quindi, regolare lo specchio che si trova davanti allo specchio ribaltabile per ottenere la lettura più alta potenza. Prendete il misuratore di potenza e tenerlo dietro l'iride che è la più vicina al campo vicino stadio e regolare lo specchio inclinabile fino a quando una lettura massima potenza si ottiene. Ripetere questa operazione un paio di volte per la regolazione ottimale.
2.2. Guardando il segnale 1f
Il riferimento del amplificatore lock-in deve essere impostato per isolare la frequenza della frequenza di oscillazione punta impostandolo su 1F (est.), che è la frequenza di oscillazione AFM. Impostare il formato di scansione in modalità trama vigore nel software Nanoscope a 3 micron. Dopo la regolazione grossolana al punto 2.1., Cercare la forma giusta del segnale 1F. Successivamente, regolare la fase tra la luce diffusa raccolti dalla punta e la luce homodyned dal braccio omodina regolando il driver piezo. Questa guida lo specchio nel braccio omodina Cambiando la tensione del piezo in modo che il primo minimo del segnale di 1F è di circa 500 nm a partire da zero. Perché ogni cambiamento nel allineamento cambierà la lunghezza di entrambi i percorsi di luce e quindi la loro relative fasi, la fase deve essere corretto con il piezo.
| Che cosa vedrete (1f segnale)? | |
| Allineamento Bad: | Due dossi sulla misura 3 micron z scansione sarà osservato. |
| Allineamento media: | La curvatura del primo urto sembra un po 'più concavo che convesso e l'urto secondo è più piccolo del primo. |
| (Quasi) Allineamento Buono: | Due dossi sarà osservato. Il primo urto è superiore al secondo urto, e la curvatura sul lato destro del primo urto sarà negativa (concava). |
| Cosa fare per l'allineamento? | |
| Allineamento Bad: | Ripetere la procedura di allineamento al punto 2,1, come richiesto. Poiché il diametro del fascio IR è di grandi dimensioni, la maggior parte del fascio passerà l'iride, anche se non è perfettamente allineato. Anche se due dossi sono ancora osservati, la quantità di segnale 1F può essere aumentata mettendo a punto uno o di entrambi gli specchi di allineamento. Guarda per lievi modifiche nella curvatura del primo urto. Soprattutto, siate pazienti poiché questa è la parte più difficile del tracciato. |
| Allineamento media: | Provate a regolare uno o entrambi gli specchi di allineamento per ottenere un allineamento quasi bene. Provare a spostare lo stadio traslazionale XYZ pure, ma adeguandolo con incrementi molto piccoli. |
| (Quasi) Allineamento Buono: | Regolare gli specchi e cercare di aumentare il massimo del primo urto. 1F segnali sono di solito circa 8 a 16 V, per potenze di ingresso bassa è meno. Cambiare la fase cambiando la tensione utilizzando il driver piezo in modo che il primo minimo si avvicina a zero. Se c'è un segnale significativo 1F, passare il riferimento del amplificatore lock-in per isolare il segnale 2F. Alcuni dei segnali devono essere osservati e cercare di migliorarlo un po 'più da molto leggermente la messa a punto specchi e cambiando la fase. |
2.3. Il passaggio da un campione ad un altro
Esegui Passo A.1.5 sotto l'allineamento del fascio HeNe. Inserire la punta AFM e propagare il fascio di raggi infrarossi attraverso il microscopio. Guarda il segnale 1F. Se un segnale 1F si osserva ancora, regolare lo specchio inclinabile e regolare la fase. Un buon segnale IF e quindi un buon segnale 2F può ancora essere osservato. In caso contrario, finemente allineare il fascio con passo 2.2.
Rappresentante dei risultati:
Preparazione del campione # 21-31 Il peptide è stato sintetizzato presso il Centro di Biotecnologie e Bioingegneria presso l'Università di Pittsburgh e purificati (> 95%) mediante HPLC. Per sintetizzare le fibrille amiloidi, 0,8 mg di TMAO (Sigma-Aldrich) è stato aggiunto ad una soluzione di 1 mm # peptide 21-31 in 18 MΩ acqua, simile ad una procedura eseguita da Yang et al. Xiv
Ultrapiatte oro substrati xv sono state fatte. 40 ml di un mese, vecchia soluzione (temperatura di incubazione in camera, pH 5,5) è stato depositato per diversi minuti su substrati fresco oro ultrapiatte. Sono stati brevemente sciacquato con un flusso di 18 MΩ acqua, asciugato con flusso di gas N 2 e posizionati nello strumento ANSIM.
Figura 11 mostra le immagini topografia e nel vicino campo di raccolta per il # 21-31 fibrille del peptide. A) immagine Topografia ottenuti simultaneamente con il suo corrispondente near-field immagine. Le etichette rappresentano fibrille individuali e sono utilizzati per caratterizzare il tipo di conformazione secondaria ogni fibrilla ha. B e C) Corrispondente near-field immagini raccolte in due differenti numeri d'onda: 1631 e il 1691 cm -1. L'area di ciascuna immagine è di 1 x 1 micron 2. Scala di sinistra rappresenta l'altezza, la scala a destra è il campo diffuso dalla amplificatore lock-in.
Figura 11 
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Acknowledgments
Noi riconosciamo con gratitudine NSF, NSERC, NIH, e ONR.
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