Summary
El montaje de un microscopio de campo cercano infrarrojo de agregados de proteínas de imagen se describe.
Abstract
Este documento tiene como objetivo instruir al lector en el montaje y operación de un infrarrojo cercano microscopio de campo para obtener imágenes más allá del límite de difracción. El apertureless cerca de microscopio de campo es una dispersión de luz, tipo de instrumento que proporciona espectros infrarrojos a una resolución de alrededor de 20 nm. Una lista completa de componentes y un protocolo de paso a paso para su uso se proporciona. Errores comunes en el montaje y ajuste de instrumentos se discuten. Un conjunto de datos representativo que muestra la estructura secundaria de un amiloide fibrilar se presenta.
Protocol
Antecedentes:
Apertureless sonda cerca de la microscopía de campo IR ofrece imágenes de alta resolución espacial. Es una técnica relativamente nueva en la que se dispersa un haz incidente de infrarrojos por un fuerte microscopía de fuerza atómica (AFM) de punta que oscila a la frecuencia de resonancia del cantilever cerca de la muestra. Un detector de infrarrojos recoge la luz dispersada y se demodula en esta frecuencia de resonancia o sus armónicos. De esta manera, la dispersión de fondo del incidente de rayo láser enfocado en el resto de la superficie de la muestra puede ser reducida y una resolución espacial mucho más allá del límite de difracción de la luz se puede lograr obtener el contraste de infrarrojos con resolución espacial nanométrica i, ii, iii . Desde la cima de la punta del AFM es mucho menor que el área focal del rayo láser, la luz dispersada es débil. Con el fin de mejorar este campo dispersas, la detección homodinas se utiliza cuando un campo de referencia se agrega al campo recogidos dispersa y la fase relativa de los campos se ajusta de tal manera que la interferencia constructiva máxima se produce en el detector. La intensidad de dispersión es proporcional a la magnitud de la referencia de campo eléctrico iv, v, vi. Una cuestión importante en el campo cercano de imagen es para evitar los artefactos producidos por el z-movimiento de la punta de AFM VII, VIII, IX, X, XI. Este problema se puede reducir con el ajuste adecuado de la fase de homodinas y excluyendo a grandes rasgos topográficos, como ya se demostró por Mueller et al. Esta técnica es entonces fiable para obtener el espectro de la dispersión experimental de materiales con una resolución espacial de menos de 30 nm 15 . El uso de cerca de la microscopía de campo de los materiales biológicos se ha demostrado anteriormente, en particular para las macromoléculas como el tabaco xii virus del mosaico y las bacterias E. Coli xiii.
En este informe, se expone el conjunto de este tipo de dispositivo de imágenes. También se presenta información de la estructura secundaria de las fibrillas amiloides formadas a partir del fragmento # 21-31 péptido de β 2-m obtenidos por apertureless campo cercano microscopía de barrido de infrarrojos (ANSIM). Cerca de las imágenes de campo se recogen al mismo tiempo que la topografía, lo que permite la detección y recogida de todo el espectro de dispersión de las fibrillas individuales.
Nuestra apertureless campo cercano microscopio de escaneado por infrarrojos (ANSIM) mediciones es un dispositivo hecho en casa. El esquema del montaje experimental se muestra en el Esquema 1. Un microscopio AFM (multimodo, Veeco Instruments, Santa Barbara, CA) se utiliza para medir la topografía de la muestra, así como la producción de la dispersión mejorada de campo cercano modulada a la frecuencia de oscilación punta. Tapping-mode, recubierto de platino NSC14/Ti-Pt voladizos (MicroMasch, Estonia) se utilizan para mejorar la dispersión de la continua, ajustable láser IR (rango de frecuencia: 2000 cm -1 a 1600 cm -1, PL3 láser de gas CO, Instrumentos de Edimburgo, Gran Bretaña), cerca de la superficie. Un láser de neón helio (Melles Griot, Albuquerque, NM) se utiliza como guía para la radiación infrarroja invisible. La luz del láser de infrarrojos se propaga hacia un objetivo después de pasar un reflector parcial ZnSe. A continuación se centró en el ápice de la punta del AFM oscilante, con la polarización de la viga paralela al eje longitudinal de la sonda. La radiación IR recogidos por la lente se añade a una señal homodinas referencia. Un espejo parabólico se utiliza para enfocar la radiación IR en un detector de teluro de cadmio mercurio (MCT), infrarrojo (Infrared Graseby, Orlando, FL). Un conductor piezoeléctrico (Thorlabs, Newton, Nueva Jersey) se utiliza para maximizar la señal detectada por la corrección de la fase de la luz homodinas. La mayoría de los componentes ópticos descritos anteriormente se fijará firmemente en una plataforma y se movió en la posición XY o Z con una etapa de traducción. La fracción de AC de la señal detectada se transmite a un amplificador lock-in (modelo SR844 RF, Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA), que demodula la señal en la frecuencia de oscilación punta. La intensidad de la dispersión que se observa como la punta del AFM escanea la superficie de la muestra y los datos topográficos se obtiene al mismo tiempo. El software utilizado para la recopilación de datos e imagen es Nanoscope V5.31r1 (Veeco Instruments, Santa Barbara, CA).
Scheme1 
Figura 1 - muestra las partes del sistema de imagen cuyo montaje y el uso que se describen 
0) mesa óptica
1) Base de MM AFM
2) Scanner de MM AFM
3) mesa óptica elevada
(13 "x 18" x 3 / 8 ", Thorlabs)
4) Guía espejos (recubierto de oro, 1 "de diámetro.)
7) del tubo óptico utilizado para asegurar la instalación en la plataforma elevadora (17)
8) El objetivo de IR
(FL 16 mm, NA 0.28, Ealing)
9) del tubo óptico de recogida retrodispersados luz
10) Cubo w / fuera del eje del espejo parabólico
(90 °, FL 5 ", Janos)
11) Cubo para mantener la placa Ge @ 45 °
12) Microscopio ocular (x10)
13) XY etapa montada estenopeica (0,5 mm)
14) MCT detector IR (infrarrojos Graseby)
15) previo IR detector (AC y DC)
16) XY para mover la posición del haz
17) La elevación de la tabla para enfocar el haz
18) Z-etapa a la posición del detector de infrarrojos
19) X-etapa a la posición del detector de infrarrojos
Asamblea paso I.1
Montar la configuración óptica y con espejos de ajuste y la posición del Helio-Neón (HeNe) haz paralelo a la mesa óptica (0) a la altura de aproximadamente correcta (H) por encima de la mesa óptica (3) y la distancia (D) del centro de la escáner (2).
Esta altura H y D la distancia se puede estimar a partir de la altura (H1) de la muestra en la parte superior del escáner (2) de la mesa óptica, el ángulo deseado de incidencia (α), la altura de la parte superior de la placa por encima de la mesa óptica (h), dimensiones geométricas del cubo óptico y el objetivo de infrarrojos (6 y 8 en la Figura 1) y la distancia de trabajo del objetivo de IR (d todos juntos, aquí d = 1 "2" 2 ")
Figura 2 
H = H1 + d * sen (α)-h
D = d * cos (α)
Asamblea I.2 paso
Figura 3 
Figura 3: Sin el divisor en el cubo (5) y con tubo alargado óptica en el otro extremo del cubo (6) directa de He-Ne haz a través del iris unidos en los extremos de los tubos.
Asamblea paso I.3
Figura 4 
Figura 4: Con el escáner (2) eliminar, conectar el tubo óptico de largo con el iris al final en lugar del objetivo de IR. Inserte el reflector parcial ZnSe para dirigir el rayo hacia la muestra viaja por el tubo óptico de largo. El reflector parcial ZnSe debe ser montado de tal manera que el haz de HeNe llega a la superficie frontal del reflector en el centro geométrico del cubo de la celebración de la óptica de reflector parcial.
Figura 5 
Figura 5: Al girar el reflector parcial, dirigir el haz de He-Ne a través del iris de salida cerrada. Desde el monte del reflector parcial no se puede dar por exactamente perpendicular, hay dos instalados en casa tornillos de ajuste, lo que permite el movimiento vertical de la viga. Utilizar esos si es necesario.
Figura 6 
Asamblea paso I.4
Figura 6. Monte el espejo parabólico con juntas tóricas de goma en el cubo de óptica (ver 1, Figura 5). Apretando los tornillos, las juntas tóricas comprimir, permitiendo un ajuste espejo.
Figura 7 
Con espejos adicionales (uno se muestra en la Figura 7) dirigir el haz de He-Ne en la dirección opuesta, como se ilustra en la Figura 7. Ajustar el haz de pasar a través del iris utilizado anteriormente. Este rayo se utiliza para ajustar el espejo parabólico.
Figura 8 
Figura 8: Un espejo parabólico situado en el cubo óptico (10) refleja la luz hacia la posición del detector. Tornillos de ajuste de dirigir el haz a través del agujero situado en la salida del cubo (11), que celebrará el germanio (Ge) de la ventana. Después de la viga se sintoniza a través del agujero, el lugar d MCTetector cerca del agujero de alfiler. Ajustar la posición del detector de infrarrojos de modo que He-Ne haz en el elemento sensor del detector. Mover el detector hacia abajo por ~ 2 mm (IR haz se desplaza hacia abajo por la ventana Ge).
Asamblea paso I.5
Figura 9 
Figura 9: Inserte el montaje con la ventana de Ge en cubo óptico (11). El anti-reflejo (AR) recubierto ventana de Ge actúa como un filtro de infrarrojos y permite observaciones visuales del cantilever y la muestra. Coloque el ocular (12). Torcer el ángulo del cubo (11) con respecto al cubo (10) le permite a uno punto del ocular en la dirección deseada. Al girar el montaje de la ventana de Ge, el haz de He-Ne se dirige a través del centro del ocular.
Figura 10 
Figura 10: Conexión IR objetivo (8) y AFM escáner (2). Conecte el beamstop al extremo de salida del tubo óptico (5). Use un filtro de protección cuando se ve la viga HeNe a través del ocular. Posición de una muestra en el escáner y dirigir el haz de He-Ne a través del tubo de entrada óptica (5). Asegúrese de que el haz de He-Ne es lo suficientemente amplia como para derramar sobre el beamstop. El beamstop se utiliza debido a que el objetivo Cassegrain, que sólo recoge la luz que entra por la periferia de la viga. Mediante el ajuste de la rosca del ocular una imagen nítida de la viga HeNe se centró en la muestra se obtiene.
Asamblea paso I.6
Un ajuste final del espejo parabólico es necesario. El orificio de salida se sustituye por el iris en la posición del foco del espejo parabólico. Quitar la ventana de Ge y el detector IR (posición de la marca de detector IR!). Coloque una lente adicional después de que el iris en la duración aproximada focal de la lente del iris. En este momento el cantilever comprometida debe ser visible a través de la lente. Ajustar la posición del espejo parabólico al centro de la final de la punta a través del iris cerrado. Tenga en cuenta que cuando el haz de HeNe la debida atención en la punta, tiene una chispa brillante entre la punta y la reflexión que sobre la superficie de la muestra. Vuelva a colocar la ventana de Ge, ajustar lo conveniente para la observación visual del cantilever. Vuelva a colocar el diafragma con el agujero y recuerda que el ojo de aguja utilizada para la detección de IR debe pasar fuera del centro, debido al desplazamiento del haz de infrarrojos por la ventana Ge. Coloque el detector IR en la posición previamente marcada.
Por último, dirigir los rayos infrarrojos de modo que viaja junto con el haz de HeNe visibles utilizadas para la puesta a punto.
Ahora todo debería estar listo para el ajuste de rutina.
Ajuste de la rutina:
Ajuste de paso A.1:
Alineación con Láser HeNe
Es más fácil para alinearse con el HeNe visible (632nm) que con el invisible IR (alrededor de 6μm).
El camino de los He-Ne y de los rayos infrarrojos se dan cita en el espejo basculante. Si el espejo se inclina por la HeNe puede pasar, si el espejo está en posición de los rayos infrarrojos se propaga a la configuración de campo cercano. Para la alineación de una de las vigas, use no los dos espejos en común con el otro camino y se encuentran ante el espejo basculante. Si usted ha movido accidentalmente el otro espejo, en primer lugar tratar de traer de vuelta a este espejo en su antigua posición.
A.1.1. Alineación aproximada con dos espejos
Use los dos espejos cerca del láser HeNe para alinear el haz a través de todos los iris a lo largo de la ruta de la etapa de campo cercano. Si nos fijamos en la viga en el brazo homodinas, un perfil de la viga corona, como deben ser observados (por el bloqueo del haz en el tubo óptico). Esto indica que el rayo pasa directamente a través de los tubos.
A1.2. Ajuste fino con campo próximo Etapa
Coloque la cabeza AFM y participar en su punta sobre la muestra. Enfocar el haz de HeNe en el extremo del voladizo de imágenes. Si haciendo lo que el haz se desplaza desde el centro del tubo de entrada óptica (5) pasos de sintonía repetir A.1. y A.1.2. hasta que el rayo se centra.
Al pasar la etapa de traslación óptica, el objetivo del microscopio que reflejan se ajusta para enfocar la luz en el ápice de su punta, donde se encuentra dispersa.
Girar el espejo debajo de la Ge ocular (localizado en el cubo óptico) y mirar a través del ocular. El haz se enfoca en este momento (o en el detector IR cuando el espejo Ge se saca del cubo) por el espejo parabólico. Mover el escenario hacia atrás o hacia adelante hasta que una imagen nítida de la punta y su reflejo en la superficie de la muestra se observa. Utilice el o doshay direcciones (arriba / abajo y derecha / izquierda) para colocar la punta del AFM aproximadamente en el centro del ocular.
Mirando a través de un telescopio, el cantilever de AFM y la punta que se observa. Una vez más, recuerde que debe utilizar un filtro de protección al ver el haz de He-Ne. Sin el haz de He-Ne, un poco de luz roja se sigue observando que se origina a partir de la luz interna del control de distancia de AFM. Mueva la etapa de traducción en una derecha-izquierda y / o dirección de arriba hacia abajo hasta que un destello de color rojo brillante que se observa en el ápice punta. Si la alineación es bastante malo, desplazar el escenario a la izquierda de la AFM y moverse hacia la derecha lentamente. Esté atento a un reflejo rojo en movimiento a través de la superficie de la muestra reflexivo. Si el reflejo rojo todavía no es observado, traducir el escenario a la izquierda de nuevo y moverse en una manera de arriba hacia abajo. Mantenga la traducción de izquierda-derecha, arriba-abajo hasta que un destello rojo se observa como enfocar el haz de HeNe en el ápice de la punta del AFM.
A1.3. La superposición del campo homodinas con luz difusa
Abra el brazo del homodinas y profunda mirada al ocular. Tres o más puntos en una línea con intensidad decreciente que se ve y estos puntos son el resultado de múltiples reflexiones en la parte frontal y trasero de la óptica diferente. Mueva el espejo en el brazo homodinas para que el segundo lugar (desde el fondo y en la intensidad) se solapa con la imagen brillante de la punta, que es donde la punta y su reflexión se unen.
A1.4. La posición del detector
Quitar el espejo Ge y el haz de HeNe debe ir en la dirección donde se encuentra el detector IR. Detrás del tubo óptico, dos puntos de anillo que se observan. El segundo lugar (en intensidad) es el lugar que debe pasar por el agujero de la lámina de protección contra el calor en la cara del detector de infrarrojos. El punto de mayor intensidad debe ser visto en el borde del agujero.
A1.5. El cambio de una muestra a otra
Después de cambiar la muestra de la punta del AFM ya no está en la misma posición que antes, pero no debe estar muy lejos. Comience con el paso A.1.2, ya que la diferencia no suele ser muy grande.
Nota: Si la alineación está apagado, compruebe si el haz de HeNe todavía pasa por todos los iris y crea un brillo de color rojo brillante en la punta del AFM. A veces no te das cuenta que has tocado y por lo tanto, se movió un espejo de su posición original. Si la alineación sigue siendo mala, por desgracia, todo el procedimiento de alineación tiene que ser completado de nuevo.
Ajuste el paso 2: Alineación de IR del haz
Use una línea láser de CO con una alta intensidad / potencia (mínimo de 100 MW) ya que esto hará que la alineación sea más fácil. Rellene el detector con nitrógeno líquido y dejar reposar y estabilizar durante al menos 30 minutos.
2.1. Alineación aproximada con dos espejos
Colocar un medidor de potencia detrás del iris primero para controlar el poder de los rayos infrarrojos entrantes. A continuación, ajuste el espejo que se encuentra ante el espejo inclinable para obtener la lectura de potencia más alto. Tome el medidor de potencia y mantenerlo detrás del iris, que es el más cercano a la etapa de campo cercano y ajustar el espejo basculante hasta que una lectura de potencia máxima se obtiene. Repita este paso varias veces para un ajuste óptimo.
2.2. Viendo la señal 1f
La referencia del amplificador lock-in se debe establecer en el aislamiento de la frecuencia de la frecuencia de oscilación mediante el establecimiento de punta a 1F (ext.), que es la frecuencia de oscilación AFM. Establecer el tamaño de escaneado en el modo de la fuerza en el terreno del software Nanoscope a 3 micras. Después del ajuste grueso de 2.1., Buscar la forma correcta de la señal de 1F. A continuación, ajustar la fase entre la luz dispersada recogida de la punta y la luz homodyned del brazo homodinas mediante el ajuste del driver piezo. Esto lleva el espejo en el brazo homodinas Al cambiar el voltaje de la piezo para que el primer mínimo de la señal de 1F es de alrededor de 500 nm a partir de cero. Debido a que cada cambio en la alineación va a cambiar la longitud de ambos caminos de la luz y por lo tanto, sus fases relativas, la fase debe ser corregido con el piezo.
| ¿Qué vas a ver (1F de la señal)? | |
| Mala alineación: | Dos golpes en el tamaño de 3 micras z análisis se observó. |
| Alineación medio: | La curvatura de la protuberancia primero se ve un poco más cóncava que convexa y la protuberancia segunda es más pequeña que la primera. |
| (Casi) una buena alineación: | Dos protuberancias que se observan. El primer tropiezo es mayor que el segundo golpe, y la curvatura en la parte derecha de la protuberancia de la primera negativa (cóncava). |
| ¿Qué hacer para la alineación? | |
| Mala alineación: | Repita el procedimiento de alineación en el paso 2.1 según se requiera. Debido a que el diámetro del haz de infrarrojos es grande, la mayor parte de la viga pasará el iris, incluso si no está perfectamente alineado. Incluso si dos golpes aún se observa, la cantidad de la señal 1F se puede aumentar mediante la regulación de una o dos de los espejos de alineación. Esté atento a ligeros cambios en la curvatura de la protuberancia en primer lugar. Por encima de todo, ser paciente ya que esta es la parte más difícil de la alineación. |
| Alineación medio: | Trate de ajustar uno o ambos de los espejos de alineación para obtener una alineación casi bien. Trate de mover el escenario XYZ traslación también, pero el ajuste por incrementos muy pequeños. |
| (Casi) una buena alineación: | Ajustar los espejos y tratar de aumentar el máximo de la primer tropiezo. 1F señales suelen ser alrededor de 8 a 16 V, para potencias de entrada baja, es menos. Cambiar la fase de cambio de la tensión con el controlador de piezo de modo que el primer mínimo se acerca a cero. Si hay una significativa señal de 1F, cambie la referencia del amplificador lock-in para aislar la señal de 2F. Algunas de las señales deben ser observados y tratar de mejorarlo un poco más por muy poco de ajuste de los espejos y el cambio de la fase. |
2.3. El cambio de una muestra a otra
Ejecutar Paso A.1.5 en la alineación del haz de He-Ne. Involucrar a la punta del AFM y se propagan los rayos infrarrojos a través del microscopio. Ver la señal de 1F. Si una señal 1F todavía se observa, ajustar el espejo basculante y ajustar la fase. Una buena señal de IF y por lo tanto una señal de buena 2F todavía se pueden observar. Si no, finamente alinear el haz con el paso 2.2.
Los resultados representativos:
Preparación de la muestra El péptido # 21-31 fue sintetizado en el Centro de Biotecnología y Bioingeniería de la Universidad de Pittsburgh y purificado (> 95%) por HPLC. Para sintetizar las fibrillas de amiloide, 0,8 mg de OTMA (Sigma-Aldrich) se añadió a una solución de 1 mM # 21-31 péptido de 18 mW de agua, similar a un procedimiento ejecutado por Yang et al. Xiv
Ultraplano oro sustratos xv se hicieron. 40 ml de la solución de un mes de edad (de incubación a temperatura ambiente, pH 5,5) fue depositado durante varios minutos en fresco sustratos ultraplano oro. Ellos fueron lavadas brevemente con una corriente de 18 mW agua, se seca con un chorro de gas N 2 y se coloca en el instrumento ANSIM.
La figura 11 muestra las imágenes y la topografía de campo cercano-recogidos para las fibrillas # 21-31 del péptido. A) Topografía imagen obtenida de forma simultánea con su correspondiente campo cercano de la imagen. Las etiquetas representan fibrillas individuales y se utilizan para ofrecer el tipo de conformación secundaria cada fibrilla tiene. Correspondiente B y C), cerca de las imágenes de campo recolectados en dos números de onda diferentes: 1631 y 1691 cm -1. El área de cada imagen es de 1 x 1 m 2. Escala de la izquierda representa la altura, escala de la derecha es el campo dispersas del amplificador lock-in.
Figura 11 
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Acknowledgments
Agradecemos NSF, NSERC, NIH, y ONR.
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