Summary
イメージングタンパク質凝集体のためのニアフィールド赤外顕微鏡の組み立てが記載されている。
Abstract
本論文では、回折限界を超えたイメージングのための赤外近接場顕微鏡の組み立てと操作のリーダーに指示することを目指しています。 apertureless近接場顕微鏡は、およそ20nmの分解能で赤外スペクトルを提供する光散乱型測定器です。コンポーネントと使用のためのステップバイステップのプロトコルの完全なリストが提供されます。アセンブリと楽器のチューニングの一般的なエラーについて説明します。アミロイド線維の二次構造を示す代表的なデータセットが表示されます。
Protocol
背景：
Aperturelessプローブ近接場赤外顕微鏡は高空間分解能のイメージングを提供しています。それは、入射赤外線ビームが近い試料にカンチレバーの共振周波数で振動するシャープな原子間力顕微鏡（AFM）の先端によって散乱されている比較的新しい技術です。 IRの検出器は、散乱光を収集し、この共振周波数やその高調波で復調される。この方法で、試料表面の残りの上に集光レーザービーム入射のバックグラウンド散乱を低減することができ、遠く光の回折限界を超えた空間分解能はナノスケールの空間分解能I、II、IIIと赤外線のコントラストを得るために達成することができます。 AFMの先端の頂点は、レーザービームの焦点面積よりもはるかに小さいので、散乱光は弱いです。この散乱界を強化するために、ホモダイン検出は、基準フィールドが収集散乱フィールドに追加され、フィールドの相対的な位相がそのようなその最大の建設的干渉が検出器で発生する設定されている場合に使用されます。散乱強度は、基準電場IV、V、VIの大きさに比例する。近接場イメージングの重要な問題は、AFM先端VII、VIII、IX、X、XIのz -運動によって生成されたアーティファクトを避けるためです。この問題は、適切なホモダイン位相の調整や大規模な地形、前述ミュラーらによって明らかに除くことによって低減することができます。この手法は、その後確実に30nm未満15空間分解能で物質の実験的散乱スペクトルを取得するために使用される。生物学的材料のための近接場顕微鏡の使用は、以前は特にそのようなタバコモザイクウイルスXIIと大腸菌の細菌XIIIなどの巨大分子のために、実証されている。
このレポートでは、我々はこのような撮像装置の組立を示しています。 apertureless近接場走査型赤外顕微鏡（ANSIM）で得られたβ2 - mの＃21から31のペプチド断片から形成されたアミロイド線維の我々も現在の二次構造の情報。近視野像は、個々の線維の散乱スペクトルの検出と収集を可能にする、地形と並行して収集されます。
私たちのapertureless近接場走査型赤外顕微鏡（ANSIM）測定は、自家製のデバイスです。実験セットアップの概略をスキーム1に示されています。 AFM顕微鏡は（マルチモード、Veeco社インスツルメンツ、サンタバーバラ、カリフォルニア州）サンプルの地形を測定するだけでなく、先端の発振周波数で変調された近接場増強散乱を製造するために使用されます。 2000センチメートル-1〜1600 cm -1の 、PL3 COガスレーザー、：タッピングモード、NSC14/Ti-Ptプラチナコーティングされたカンチレバー（MicroMasch、エストニア）は連続的な、波長可変赤外レーザー（周波数範囲の散乱を強化するために使用されています表面付近のエジンバラインスツルメンツ、英国）。ヘリウムネオンレーザー（メレスグリオ、アルバカーキ、NM）フィールドは、目に見えない赤外線のためのガイドとして使用されます。 IRレーザー光は、ZnSeの部分的なリフレクタを通過した後、レンズに向かって伝播されます。その後、プローブの長軸にビームの平行の偏光で、振動探針の先端に焦点を当てています。レンズによって収集されたIR放射は、参照ホモダイン信号に追加されます。放物面鏡は水銀カドミウムテルル（MCT）赤外線検出器（Graseby赤外線、オーランド、フロリダ州）に赤外線を当てるために使用されます。ピエゾドライバ（Thorlabs、ニュートン、ニュージャージー州）は、ホモダイン光の位相を補正することにより、検出された信号を最大化するために利用されている。上記の光学部品のほとんどは、しっかりとプラットフォームに貼付し、並進ステージを使用してXYまたはZの位置にシフトされます。検出信号のACの画分をロックインアンプ（モデルSR844 RF、スタンフォードリサーチシステムズ、サニーベール、カリフォルニア州）先端の発振周波数の信号を復調するために送信されます。 AFM先端がサンプリングされた表面をスキャンし、地形データが同時に得られるように散乱強度が観察される。データと画像の収集に使用されるソフトウェアは、ナノスコープV5.31r1（Veeco社インスツルメンツ、サンタバーバラ、カリフォルニア州）です。
Scheme1 
図1 -アセンブリと使用するイメージングシステムの一部を示して我々が記述する
0）光学テーブル
1）MM AFMの基本は、
MM AFMの2）スキャナ
3）上昇光学ブレッドボード
（13"× 18"× 3 / 8"、Thorlabs）
4）ガイディングミラー（ゴールドコーティングされた、1"径）
昇降プラットフォーム（17）で設定を保護するために使用されている7）光管
8）IRの目標
（FL 16mmのNA 0.28、イーリング）
9）収集した後方散乱光の光チューブ
10）キューブのw /軸外し放物面鏡
（90 °、FL 5"、ヤーノシュ）
11）のGe板@ 45 °を保持するためにキューブ
12）顕微鏡の接眼レンズ（× 10）
13）XYステージは、ピンホール（0.5 mm）を装着
14）MCT赤外線検出器（Graseby赤外線）
15）赤外線検出器のプリアンプ（ACおよびDC）
16）ビームの位置を移動するXYステージ
17）ビームを集中させる昇降テーブル
18）IRの検出器を配置するZステージ
IRの検出器を配置する19）Xステージ
アセンブリのステップI.1
光学セットアップを組み立て、チューニングのミラーとの位置の中心から光学ブレッドボード（3）と距離（D）上記の約正しい高さ（H）での光学テーブル（0）へのヘリウムネオン（HeNeレーザ）ビームの平行スキャナ（2）。
この高さHとの距離Dは光学テーブル上にブレッドボードの上部の高さは、入射角（α）、目的、光学テーブルからスキャナ（2）の上に試料の高さ（H1）から推定することができます。 （H）、光学キューブとIRの目標（図1の6、8）とIRの目的の作動距離（すべて一緒にD、ここでD = 1"2"+2"）の幾何学的大きさ
図2 
H = H1 + D *罪（α）- H
D = D * COS（α）
アセンブリのステップI.2
図3 
図3：キューブ（5）のビームスプリッタを使用しないとキューブ（6）の一方の端に細長い鏡筒では、管の両端に接続されている虹彩を通してのHe - Neビームを指示する。
アセンブリのステップI.3
図4 
図4：取り外したスキャナ（2）では、IRの目的の場所で終わりにアイリスとの長い鏡筒を取り付けます。長い鏡筒を下に移動して、サンプルに向かってビームを指示するZnSeの部分的な反射板を挿入します。 ZnSeの部分的な反射は、ヘリウムネオンビームが部分的な反射鏡を保持している光学キューブの幾何学的中心にリフレクタの前面に当たるように取り付ける必要があります。
図5 
図5：部分的な反射鏡を回転させることにより、クローズド出力虹彩を通してHeNeレーザビームを向ける。部分的な反射板のマウントは完全に垂直に保持していないので、2つのホームにインストールさ調節ネジは、ビームの垂直方向の動きを可能にする、があります。必要に応じてそれらを使用してください。
図6 
アセンブリのステップI.4
図6。光学キューブ内のゴム製O -リング（1を参照、図5）と放物面鏡をマウントします。ネジを締めて、O -リングは、ミラーの調整を可能にする、圧縮する。
図7 
図7に示すように追加のミラーを（いずれかを図7に示されている）、反対方向にHeNeレーザビームを指示する。以前に使用される虹彩を通過するビームを調整します。このビームは放物面鏡を調整するために使用されます。
図8 
図8：光キューブ（10）に配置された放物面鏡は、検出器の位置に向かって光を反射する。調整ネジは、ゲルマニウム（Ge）のウィンドウを保持するキューブ（11）、の出力に配置されたピンホールを介してビームを指示する。ビームがピンホールを介して調整されて後、MCT Dを配置etectorは、ピンホールに近い。のHe - Neビームが検出器の検出素子上に配置されるようにIR検出器の位置を調整します。約2 mm（IRビームがGeのウィンドウが下にシフトされる）で検出器を下に移動します。
アセンブリのステップI.5
図9 
図9：光学式キューブ（11）にGeのウィンドウで、マウントを挿入。反射防止（AR）コーティングされたGeのウィンドウには、IRフィルターとして機能し、カンチレバーと試料の目視観察を可能にします。接眼レンズ（12）を取り付けます。キューブに関してキューブ（11）の角度をねじると（10）いずれかの所望の方向に接眼レンズを指すことができます。 Geのウィンドウのマウントを回転させることにより、ヘリウムネオンの光が接眼レンズの真ん中へ送信されます。
図10 
図10：接続IR目標（8）およびAFMスキャナ（2）。鏡筒（5）の出力端にbeamstopを取り付けます。接眼レンズを介してヘリウムネオンビームを表示するときは保護フィルターを使用してください。スキャナにサンプルを置き、入力光チューブ（5）を介してヘリウムネオンビームを指示する。 HeNeレーザビームがbeamstopを波及するのに十分な幅であることを確認してください。 beamstopがあるためだけビームの周辺部から入ってくる光を収集カセグレンの目標、のために使用されます。接眼レンズのスレッドを調整することによって、サンプルに焦点を当てたHeNeレーザビームのシャープな画像が得られる。
アセンブリのステップI.6
放物面鏡の最終的な調整が必要です。出力ピンホールは、放物面鏡の焦点位置に絞りに置き換えられます。 GeのウィンドウとIR検出器（IR検出器のマークの位置！）を取り外します。虹彩からレンズのおおよその焦点距離で絞り後に追加のレンズを取り付ける。この瞬間に従事するカンチレバーは、レンズを通して見えるはずです。センター閉鎖虹彩を通して先端の端をへの放物面鏡の位置を調整します。 HeNeレーザビームが正しく先端に集束されている場合、それは探針と試料の表面のそれの反射の間に明るい輝きを作ることに注意してください。 Geのウィンドウを再び取り付けます。カンチレバーの便利な視覚的な観察のためにそれを調整する。ピンホールで絞りを交換し、赤外線の検出に使用されるピンホールがGeのウィンドウが原因で赤外線ビームの変位にオフセンターにシフトする必要があることに注意してください。以前にマークされた位置に赤外線検出器を置きます。
最後に、それはチューニングのために使用される可視HeNeレーザビームと一緒に移動するように、IRビームを指示する。
今すべてがルーチン調整のための準備ができているはずです。
ルーチン調整：
調整ステップA.1：
ヘリウムネオンレーザーとの整合性
それは目に見えない赤外線（量6μm程度）と比べて可視HeNeレーザ（632nm）に合わせて簡単です。
ヘリウムネオンのとIRビームのパスは、角度可変ミラーで一緒に来る。このミラーがダウンして傾いている場合、ミラーは、赤外線ビームが近接場設定に伝播位置にある場合はヘリウムネオンは、渡すことができます。ビームの一方の位置合わせのためにのみ、他のパスとの共通点は2つのミラーをしない使用し、角度可変ミラーの前に位置しています。もし誤って別のミラーを移動した場合は、まず古い位置のために戻ってこの鏡を持参してみてください。
A.1.1。つのミラーを持つ粗アライメント
ニアフィールドステージへのパスに沿ったすべての虹彩を介してビームを位置合わせするHeNeレーザーに近い2つのミラーを使用してください。あなたがホモダインの腕にビームを見ると、コロナのようなビームプロファイルは、（鏡筒のビームの遮断のために）観察する必要があります。これは、ビームが直管を通過することを示しています。
A1.2。近接場ステージでファインアライメント
AFMヘッドを取り付け、試料にカンチレバーの先端に従事する。イメージングカンチレバーの端にHeNeレーザビームを当てる。入力光チューブ（5）の真ん中からビームがチューニング手順A.1を繰り返す変位ように行っている場合。とA.1.2。ビームがセンタリングされるまで。
並進光学ステージを移動することにより、反射する顕微鏡対物は、それが分散しているカンチレバーの先端の頂点に光を当てるように調整されます。
接眼レンズ下のGeミラーを（光学キューブ内にある）に回転させ、接眼レンズに目を通してみてください。ビームは放物面鏡によって（またはGeのミラーは立方体の中から引き出されているIR検出器上で）この時点で焦点を当てています。試料表面上でのヒントとその反射のシャープな画像が観察されるまで、後方または前方にステージを移動します。 2つのoを使用してください約接眼レンズの真ん中にAFMチップを配置することがある方向（アップ/ダウン、左/右）。
望遠鏡を通して見ると、AFMのカンチレバーとその先端が観察される。再び、HeNeレーザビームを表示するときは保護フィルターを使用することを忘れないでください。 HeNeレーザビームなしで、いくつかの赤い光が依然としてAFMの距離制御の内部の光から元となる観察される。鮮やかな赤い輝きが先端の頂点に観察されるまで、右と左/または上下方向に並進ステージを移動します。アライメントがかなり悪い場合は、AFMの左にステージを移動し、ゆっくりと右に移動します。反射試料の表面を横切って移動する赤の反射を監視。赤色の反射がまだ観察されていない場合は、再び左にステージを翻訳し、アップダウン方式で移動する。あなたがAFMの先端の頂点にHeNeレーザビームの焦点を合わせるように赤い輝きが観察されるまで左右、上下に翻訳してください。
A1.3。散乱光とホモダインフィールドをオーバーラップ
ホモダインアームを開いて、接眼レンズを徹底しております。強度の減少に伴い、三つ以上のスポットが見られ、これらのスポットは、フロントと異なる光学系のbacksides上の複数の反射の結果ですさ。ホモダインアームのミラーを移動する先端とその反射が一緒に来ているところである先端の明るいイメージと秒のスポットは（下からと強度の）重なっているので。
A1.4。検出器を配置
Geのミラーを削除し、HeNeレーザビームは、IRの検出器が配置されている方向に行く必要があります。鏡筒の後ろに、二つのringlikeスポットが観察される。秒のスポットは（強度の）IRの検出器の表面に熱保護箔の穴を通過するはずの場所です。最高の強度を持つスポットが穴の境界線に見られるべきである。
± 1.5。 1つのサンプルから別のに変更する
サンプルを変更した後AFMチップは以前とまったく同じ位置に表示されなくなりますが、あまりにも遠くはないはず。違いは、通常は非常に大きいではないので、ステップA.1.2で始まります。
注：アライメントがオフになっている場合は、ヘリウムネオンビームはまだすべての虹彩を通過し、AFMの先端に鮮やかな赤色の輝きを作成するかどうかを確認してください。時にはあなたが触れていることに気付くため、元の位置からミラーを移動しないでください。アライメントが依然として悪ければ、残念ながら全体の調整手順をもう一度完了する必要があります。
調整ステップ2：IRビームのアライメント
これはアライメントが容易になるように高輝度/パワー（少なくとも100 mW）を持つCOレーザーのラインを使用してください。液体窒素で検出器を記入し、それが少なくとも30分間平衡ができます。
2.1。つのミラーを持つ粗アライメント
着信IRビームのパワーを監視する最初の虹彩の後ろにパワーメータを置きます。次に、最も高い消費電力の測定値を得るために傾斜可能な鏡の前に置かれているミラーを調節する。パワーメータを取ると最大電力の測定値が得られるまでの近接場のステージに最も近いと角度可変ミラーを調整している虹彩の後ろにそれを保持する。このステップの最適な調整のために数回繰り返します。
2.2。 1Fの信号を見て
ロックインアンプの参照は、AFMの発振周波数である1階（内線）、それを設定することにより、先端の発振周波数の周波数を分離するために設定する必要があります。 3μmまでナノスコープのソフトウェアの力をプロットモードでのスキャンサイズを設定します。 2.1の粗調整した後、1Fの信号の右側の形状を探します。次に、先端およびピエゾドライバを調整することによりホモダインアームからhomodyned光から収集された散乱光間の位相を調整する。これは1Fの信号の最初の最小値がゼロから始まる約500nm以下になるように、ピエゾの電圧を変えることによりホモダインアームのミラーを駆動します。アライメントが変化するたび、光、したがって、その相対的な位相の両方のパスの長さを変更するので、位相はピエゾで修正する必要があります。
| あなたは（1F信号）は何が表示されます？ | |
| 悪いアライメント： | 3μmのZスキャンサイズに関しては、二つのバンプが観察されます。 |
| 培地のアライメント： | 第一バンプの曲率は、凸よりも少し凹面に見えると第二バンプは最初のものより小さいです。 |
| （ほぼ）グッドアライメント： | 二つのバンプが観察されます。第一バンプ秒バンプよりも高いですし、最初のバンプの右側の曲率は（凹）負の値になります。 |
| アライメントのために何をするか？ | |
| 悪いアラインメント： | 必要に応じてステップ2.1に調整手順を繰り返します。 IRのビーム径が大きいため、ビームのほとんどは、それが完全に整列されていなくても、虹彩を通過します。 twoバンプはまだ観測されていても、1Fの信号の量を調整つまたはアライメントミラーの両方が増加することができます。第一バンプの曲率のわずかな変化を監視します。これは、アラインメントの最も難しい部分であるため、すべてのほとんどは、患者である。 |
| 培地のアライメント： | ほぼ良好なアライメントを得るためにアライメントミラーの一方または両方を調整してみてください。同様にXYZ並進ステージを移動するが、非常に小さな単位で、それを調整してみてください。 |
| （ほぼ）グッドアライメント： | ミラーを調整し、最初のバンプの最大値を大きくしてみてください。 1Fの信号は、それが小さい、低入力パワーに対して、8〜16 Vの周りには通常です。最初の最小のゼロに近い来るようにピエゾドライバを使用して電圧を変えることによって位相を変更します。重要な1Fの信号がある場合は、2F信号を分離するためにロックインアンプの参照を切り替える。信号の一部が観察され、非常にわずかにミラーを調整して位相を変えることで少しそれを改善しようとしてください。 |
2.3。 1つのサンプルから別のに変更する
HeNeレーザビームの位置合わせの下A.1.5をステップ実行する。 AFMチップをかけますし、顕微鏡でIR光を伝播する。 1Fの信号を監視します。 1Fの信号がまだ観察されている場合は、角度可変ミラーを調整して位相を調整します。したがって、信号と良い2F信号はまだ観測されるIF良い。されていない場合は、細かくステップ2.2を使用してビームの位置を合わせます。
代表的な結果：
サンプル調製は、＃21〜31ペプチドは、HPLCによるピッツバーグと精製（> 95％）の大学のバイオテクノロジーとバイオのためのセンターで合成した。アミロイド線維を合成するには、TMAO（Sigma - Aldrich）を0.8 mgのYang らによって実行される手順に似て18MΩ水中で1 mMの＃21〜31ペプチド、の溶液に添加した。XIVは、
Ultraflat金基板XVが行われた。一ヶ月の溶液（室温でインキュベーション液（pH5.5））40μlを新鮮なultraflatの金基板上に数分間堆積した。それらは簡単にN 2ガ スを流すと乾燥しANSIM機器内に配置、18MΩ水の流れですすいだ。
図11は、＃21〜31ペプチド原線維のために収集された地形と近視野像を示しています。その対応ニアフィールド画像と同時に得られるA）地形の画像。ラベルには、個々の線維を表し、それぞれのフィブリルが持っている二次コンフォメーションの種類を特徴とするために使用されます。 1631および1691センチメートル-1：BとC）対応ニアフィールドのイメージは、2つの異なる波数で収集。各画像の面積は1 × 1μmの2です。左のスケールは、高さを表す、右軸はロックインアンプからの散乱フィールドです。
図11 
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Acknowledgments
我々は感謝NSF、NSERC、NIH、およびONRを認めます。
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