大会，调整和使用蛋白成像Apertureless近场红外显微镜

Summary

描述成像蛋白质总量的大会，是一个近场红外显微镜。

Abstract

本文旨在指导读者在超越衍射极限的成像的红外线近场显微镜的装配和操作。 apertureless近场显微镜是一种光散射式仪器，可提供大约20 nm分辨率的红外光谱。一个组件的完整列表和使用一步一步的协议提供。大会和仪器调谐常见的错误进行了讨论。一个有代表性的数据集，显示了二级结构的淀粉样原纤维。

Protocol

背景：

Apertureless探头近场红外显微镜提供高空间分辨率的成像。它是一个相对较新的技术，其中一个事件的红外光束被锋利的原子力显微镜（AFM）在接近样品的悬臂共振频率振荡提示分散。红外探测器收集的散射光，并在这个共振频率及其谐波解调。这样一来，其余样品表面上的聚焦激光束事件的背景分散可以降低一个远远超出了光的衍射极限的空间分辨率可以达到获得与纳米^{级空间分辨率的我} ，二，三红外对比。由于针尖的顶点是比较小的激光束的重点领域，散射光较弱。为了加强这方面的散射场，零差检测是用来参考字段被添加到收集的散射场的相对相位的领域是这样，最大的建设性干扰发生在探测器。散射光强度，然后参考电场^IV，V，VI的大小成正比。在近场成像的一个重要的问题是，以^{避免针尖第七，第八，九，十} ，十一Z -议案生产的工件。这个问题可以减少零差阶段的适当调整，但不包括大的地形特点，穆勒等人证明，可靠地使用这种技术获得的空间分辨率_小于 30纳米的15的实验材料散射光谱。近场显微镜的生物材料的使用已证明以前，特别是大分子，如^烟草花叶病毒^第十二和大肠杆菌第十三。

在这份报告中，我们说明了这样一个成像设备的组装。我们也出席了会议淀粉样纤维的形成apertureless扫描近场红外显微镜（ANSIM）＃21-31肽片段的_β2 - M的二级结构信息。近场图像采集的同时，地形，使个别纤维的散射光谱探测和收集。

我们的apertureless近场扫描红外显微镜（ANSIM）测量的是一个自制的设备。实验装置的原理是在Scheme 1所示。原子力显微镜显微镜（多模，威科仪器，圣巴巴拉，CA）是用于测量样品的地形，以及生产的近场增强散射在尖端振荡频率调制。攻模式，NSC14/Ti-Pt铂金涂层的悬臂（MicroMasch爱沙尼亚），以提高散射连续的，可调谐红外激光（频率范围^{：2000厘米} -1到¹⁶⁰⁰厘米-1，PL3二氧化碳气体激光，爱丁堡仪器，大不列颠）附近的表面。一个氦氖激光器（梅勒斯Griot，新墨西哥州）字段是用来作为一个不可见的红外辐射的指导。红外激光光源是传播传递ZnSe的部分反射后，对镜头。然后集中到振荡针尖的顶点，与探头长轴平行的光束的偏振。镜头收集红外辐射，然后添加一个参考零差信号。一个抛物面镜聚焦到一个汞镉碲（MCT）红外探测器（红外Graseby，佛罗里达州奥兰多市）的红外辐射。利用压电驱动器（Thorlabs，牛顿，新泽西州）是最大限度地纠正阶段的零差光检测到的信号。上文所述的光学元件大部分都是在一个平台上，紧紧贴在XY或Z位置使用平移阶段转移。交流的一小部分检测到的信号传送到锁相放大器（SR844模型，斯坦福研究系统，加利福尼亚州桑尼维尔，射频）信号解调提示振荡频率。散射强度观察，针尖扫描采样表面的地形数据是同时获得。数据和图像采集所用的软件是奈米级V5.31r1（Veeco Instruments公司，圣巴巴拉，CA）。

计划

图1 -显示成像系统部件的组装和使用，我们将描述

0）光学表
1）基地的MM原子力显微镜
2）MM的原子力显微镜的扫描仪
3）高架光学面包板
（13“× 18”× 3 / 8“，Thorlabs）
4）指导镜子（镀金，1“直径）
6）光学的多维数据集W / ZnSe的部分反射
7）光电管，用于确保升降平台上的安装（ 17）
8）红外目标
（NA 0.28，伊林佛罗里达州16毫米，）
9）收集回来的散射光的光管
10）立方W /离轴抛物面镜
（90 °，佛罗里达州5“，亚诺什）
11）立方举行GE板@ 45 °
12）显微镜目镜（X10）
13）XY阶段安装针孔（0.5毫米）
14）的MCT红外探测器（Graseby红外）
15）红外探测器前置放大器（AC和DC）
16）XY工作台移动光束位置
17）升降表，以集中光束
18），Z级定位红外探测器
19）的X期位置的红外探测器

一，最初的装配的光学装置

大会一步一.1

装配的光学装置和调节后视镜和位置的氦氖（氦氖）束平行光表约正确的高度以上的光学实验电路板（3）和距离（D）（H）从中心（0）扫描仪（2）。

这个高度H和距离 D可估计从样品的高度，从光学扫描器表（2），所需的入射角（α），实验电路板的顶部的高度以上的光学表上（H1） （H），光立方体和红外目标（图1 6和8）和红外目标的工作距离（ 所有D，这里D = 1“2”2“）的几何尺寸

图2

H = H1 + D *罪（α）- H

D = D * COS（α）

装配步骤.2

图3

图3：在立方体分光镜（5）没有拉长光管在多维数据集（6）的另一端直接通过氦氖束管的两端连接的虹膜。

大会步骤.3

图4

图4：与扫描仪（2）删除，重视与红外目标的虹膜长的光管。插入部分的硒化锌反射沿着长的光管，直接走向样品的光束。 ZnSe的部分反射应安装这样的氦氖光束击中的前表面反射光学控股的部分反射立方体的几何中心。

图5

图5：通过旋转的部分反射，直接通过封闭的输出虹膜的氦氖光束。由于部分反射镜的安装并不持有完全垂直，安装有两个调整螺丝，允许梁的垂直运动。如果有必要使用这些。

图6

大会步骤.4

图6。安装抛物面镜光立方体的橡胶O型圈（参见图1，图5）。通过拧紧螺丝，O型圈压缩，使后视镜调节。

图7

附加镜（一种是如图7所示）直接在相反方向的氦氖的光束，如图7所示。调整光束通过以前使用的虹膜。这束将用于调整抛物面镜。

图8

图8：一个抛物面反射镜放置在光学的多维数据集（10）反映朝着探测器的位置。调整螺丝直接通过针孔放置在多维数据集（11），将持有的锗（Ge）窗口的输出光束。后束是通过针孔调整，放置在MCT ðetector关闭针孔。调整的红外探测器等，氦氖光束探测器的传感元件是的位置。移动探测器下降1〜2毫米（红外线光束将被转移由GE窗口）。

大会一步一.5

图9

图9：与GE窗口插入到光学的多维数据集（11）坐骑。涂上防反射（AR）的葛窗口作为红外过滤器，并允许目视观测的悬臂和样品。将目镜（12）。扭到多维数据集的多维数据集（11）角度（10）允许一个指向所需方向的目镜。氦氖光束通过旋转葛窗口装载，直接通过目镜中。

图10

图10：连接红外目标（8）和原子力显微镜扫描仪（2）。附加的beamstop光管（5）的输出端。氦氖光束通过目镜观看，使用保护性过滤器。样品扫描仪上的位置，并直接通过输入光管（5）氦氖光束。确保氦氖光束足够宽，溢出的beamstop。 beamstop是因为卡塞格林目标，其中仅收集入射光束的外围。通过调整目镜的线程，一个侧重于样品的氦氖束锐利的图像。

大会一步一.6

一个抛物面镜的最后的调整是必需的。输出针孔的抛物面镜的焦点位置的虹膜代替。删除葛窗口和红外探测器（红外探测器的位置标志！）。镜头焦距的大约从虹膜虹膜后附加一个额外的镜头。在这一刻，从事悬臂应通过镜头可见。调整的抛物面镜中心通过封闭的虹膜提示的位置。需要注意的是正确的氦氖光束集中到尖端时，它使明亮旌宇之间的针尖与样品的表面上它的反射。重新连接GE窗口;调整的悬臂，方便直观地观察它。更换针孔的光圈，并记住，用于红外探测针孔应移出中心由GE窗口的红外线光束位移。红外探测器放置在前面的显着位置。

最后，直接红外线光束，使同行可见的氦氖用于调谐梁。
现在，一切都应该是准备进行例行调整。

常规调整：

调整步骤A.1：

与氦氖激光对准

它比可见的氦氖（632nm）与不可见的红外线（约6μm）配合。

氦氖和红外光束的路径走到了一起，在可倾斜的镜子。如果这面镜子是倾斜的氦氖可以通过，如果镜子中的地位是的红外线光束传播到近场的设置。仅用于校准梁之一，使用两镜在共同与其他的路径，均位于前可倾斜的镜子。如果您不小心移到另一个镜像，第一次尝试，使这面镜子，在旧的位置。

第A.1.1条。粗对准两镜

使用氦氖激光的两镜对准光束通过近场阶段沿路径的虹膜。如果你看一下在零差臂梁，电晕般的光束轮廓，应注意观察（由于束在光管受体阻滞剂）。这表明，电子束直接通过管道传递。

A1.2。近场阶段的精细对齐

将原子力显微镜头，并参与到样品的悬臂尖端。氦氖光束聚焦到成像悬臂结束。如果这样取代从中间的输入光管（5）重复调整步骤A.1梁。 A.1.2。直到梁为中心。

通过移动平移光学阶段，反射显微镜的目标是调整，把重点放在悬臂尖端的顶点，它是分散的光。

旋转低于目镜葛镜（位于光立方体），并期待通过目镜。束聚焦在这个点由抛物面反射镜（或红外探测器的立方体时，葛镜拉）。向前或向后移动舞台，针尖与样品表面的反射，直至观察到清晰的图像。使用中的两个o有方向（上/下和左/右）的地方，大约在目镜中的针尖。

透过望远镜，观察原子力显微镜的悬臂，其尖端。同样，请记住使用保护的过滤器，当观看氦氖光束。没有氦氖光束，一些红灯还是从内部的原子力显微镜远程控制光的起源。在右左和/或上下方向移动，直到鲜红的旌宇观察针尖上的平移阶段。如果校准是相当糟糕，移动舞台的原子力显微镜的左侧，慢慢向右移动。观察反射样品表面上的一个红色的移动反射。如果仍然没有观察到红色的反映，是舞台，翻译左再移动上下的时尚。保持左，右，上下翻译，直到一个红色的旌宇观察氦氖光束集中在针尖的顶点。

A1.3。重叠零差场散射光

打开零差臂，并期待彻底目镜。降低强度在三个或更多点看到，这些斑点是前端和背部不同的光学多次反射的结果。在零差臂移动的镜子，让第二的位置（从底部和强度）的一角，这是提示和它的反射走到一起的美好形象重叠。

A1.4。位置探测器

删除葛镜和氦氖光束红外探测器是位于方向走。背后的光管，两个环形斑。第二点（强度）是现货，应该去面对红外探测器的热保护箔孔通过。当场强度最高的应该被看作孔的边界。

A1.5。更改从一个样品到另一个

更改后的样品针尖不再像以前一样的确切位置，但不应该太离谱。步骤A.1.2启动以来所不同的是通常不是很大。

注意：如果校准是关闭的，请检查如果氦氖光束仍能通过，所有的虹膜和针尖上创建了一个明亮的红色旌宇。有时候，你不通知你有感动，因此移动从其原始位置的一面镜子。如果对齐方式仍然是坏的，不幸的是，整个校准程序再次完成。

调整第2步：对准红外线光束

使用CO激光线与高强度/功率（至少100毫瓦），因为这会更容易对齐。用液态氮填充探测器，让它平衡至少30分钟。

2.1。粗对准两镜

广场后面的第一个虹膜的功率计监测传入的红外线光束的功率。其次，调整，这是位于前可倾斜的镜子的镜子，以获得最高的的功率读数。功率计和虹膜后面的这是最接近近场阶段，调整的可倾斜的镜子，直到获得最大功率读数举行。重复此步骤，优化调整了几次。

2.2。看着1F信号

参考锁相放大器必须设置隔离1F（分机），这是原子力显微镜的振荡频率设置提示振荡频率的频率。设置生效至3微米的奈米级软件的情节模式的扫描尺寸。 2.1粗调后，寻找1F信号的形状。其次，通过调整压电驱动器的提示和homodyned光从零差臂从收集到的散射光之间的调整阶段。这驱动器在零差臂通过改变压电电压，使1F信号最低为500纳米左右，从零起步的一面镜子。因为在走线的每一次变化会改变两个光路，因此它们的相对阶段的长度，相需要与压电纠正。

你会看到（1F信号）？
坏对齐：	将观察到3微米的Z扫描大小颠簸。
中等对齐：	第一凹凸曲率看起来有点超过凸凹，和第二个凸点是比第一次小。
（几乎）都配合得很好：	将观察到两个颠簸。第一凸点高于第二个凸点，第一凸点右侧的曲率将是负面的（凹）。

对齐怎么办？
错误的对齐方式：	根据需要重复步骤2.1校准程序。由于红外光束直径大，梁的大部分将通过虹膜，即使是不完全一致。即使两个颠簸仍在观察，1F信号量可以增加调整一个或两个对齐镜子。观察第一凹凸曲率的轻微变化。最重要的是，要有耐心，因为这是最困难的部分对齐。
中等对齐：	尝试调整一个或两个对准镜子获得了近良好的对齐。尝试以及移动XYZ平移阶段，但非常小的增量调整。
（几乎）都配合得很好：	调整镜子，并设法增加第一凸点的最大。一楼的信号通常是8至16 V左右，低输入功率则较少。更改通过改变电压，使用第一个最小的压电驱动程序，以便更接近零的阶段。如果有一个重大1F信号，开关锁定放大器的参考隔离2F信号。信号的一些应注意观察，并尝试改善非常轻微调整的镜子和不断变化的阶段多一点点。

2.3。更改从一个样品到另一个

执行步骤下的氦氖光束对准A.1.5。搞针尖，并通过显微镜传播的红外线光束。观看1F信号。如果1F信号仍然是观察，调整的可倾斜的镜子和调整阶段。一个良好的中频信号，因此一个良好2F信号可能仍有待观察。如果没有，精细对准的光束，使用步骤2.2。

代表性的成果：

在匹兹堡大学和纯化（> 95％）的高效液相色谱大学生物技术和生物工程研究中心＃21-31肽合成样品制备。 ^第十四合成淀粉样纤维，0.8毫克（Sigma - Aldrich公司）TMAO添加到1毫米的解决方案＃21-31肽在18MΩ的水，由杨等人执行的程序类似。

Ultraflat黄金基板^第十五发了言。为期一个月的老解决方案（室温孵育，pH值5.5）40μL沉积到新鲜ultraflat黄金基板的几分钟。他们简要地流的18MΩ的水冲洗， _流动的N 2气体干燥，在ANSIM仪器定位。

图11显示为＃21-31肽纤维收集到的地形和近场图像。一）地形图像的同时获得其相应的近场图像。标签代表个人纤维和使用功能的二级构象类型，每个须根。 B和C）通讯近场图像收集在两个不同的波数：1631和1691年厘米^-1。每幅图像的面积是1 × 1 ^微米 2 。左边刻度代表的高度，正确的规模是从分散的领域的锁相放大器。

图11