Summary
Сборка инфракрасный микроскоп ближнего поля для агрегатов визуализации белка описана.
Abstract
Целью данного документа является указание читателя в сборке и эксплуатации инфракрасных Микроскоп ближнего поля для работы с изображениями за дифракционный предел. Apertureless Микроскоп ближнего поля является рассеяние света типа инструмента, который обеспечивает инфракрасных спектров на около 20 нм разрешение. Полный список компонентов и шаг за шагом протокол для использования предоставляется. Распространенные ошибки при сборке и настройке инструмента, обсуждаются. Репрезентативный набор данных, который показывает, вторичной структуры амилоида фибрилл представлена.
Protocol
Справочная информация:
Apertureless зонд ближней ИК-микроскопии обеспечивает высокое пространственное разрешение изображения. Это относительно новый метод, в котором инцидент инфракрасный луч рассеивается на резкое атомно-силовой микроскопии (АСМ) наконечник колеблющегося на резонансной частоте колебаний кантилевера вблизи образца. ИК-детектор собирает рассеянный свет и демодулируется в этой резонансной частоты и ее гармоник. Таким образом, фон разброс сосредоточены лазерного пучка, падающего на остальной части поверхности образца может быть уменьшено и пространственным разрешением далеко за дифракционный предел света можно добиться получения инфракрасных отличие наноразмерных пространственное разрешение I, II, III . Так как кончик зонда АСМ намного меньше, чем основного направления лазерного луча, рассеянного света является слабой. В целях повышения этого рассеянного поля, гомодинных обнаружения используется там, где ссылкой на поле добавляется собраны рассеянного поля и относительной фазы полей установлено, что максимальная конструктивная интерференция происходит на детекторе. Интенсивности рассеяния затем пропорциональна величине электрического поля ссылкой IV, V, VI. Важным вопросом в ближнем поле изображения, чтобы избежать артефактов производства Z-движение АСМ VII, VIII, IX, X, XI. Эта проблема может быть уменьшен с правильного разрешения гомодинных фазы и без учета крупных топографические особенности, как уже продемонстрировали Мюллер и др.. Эта техника надежно затем используется для получения экспериментального спектра рассеяния материалов с пространственным разрешением менее 30 нм 15 . Использование ближнего поля микроскопию для биологических материалов было ранее продемонстрировано, в частности, для макромолекул, таких как вирус табачной мозаики XII и бактерии E. Coli XIII.
В этом докладе мы проиллюстрируем сборки таких изображений устройства. Мы также представляем вторичной информации структура амилоидные фибриллы формируется из # 21-31 пептидных фрагмента β 2-м получен apertureless ближнего поля сканирования инфракрасного микроскопа (ANSIM). Ближнего поля изображения собраны одновременно с рельефом, позволяя обнаружение и сбор спектр рассеяния отдельных фибрилл.
Наши apertureless ближнего поля сканирования инфракрасный микроскоп (ANSIM) измерений домашнего устройства. Схема экспериментальной установки показана на схеме 1. Микроскопа AFM (многомодовый, Veeco инструменты, Санта-Барбара, Калифорния) используется для измерения топографии образца, а также производить ближнего поля усиленного рассеяния модулированный с частотой колебаний кончика. При нажатии в режиме, NSC14/Ti-Pt платины покрытием консолей (MicroMasch, Эстония) используются для улучшения рассеяния непрерывный, перестраиваемых ИК-лазера (диапазон частот: 2000 см -1, 1600 см -1, PL3 CO газовый лазер, Эдинбургский Instruments, Великобритания) вблизи поверхности. Гелий неонового лазера (Меллес Griot, Альбукерке, NM) поле используется в качестве руководства для невидимого инфракрасного излучения. ИК свет лазера распространяется в направлении линзы после прохождения ZnSe частичный отражатель. Затем он фокусируется на вершине осциллирующих АСМ, с поляризации пучка параллельно длинной оси зонда. ИК-излучение собранные объектив затем добавляется к сигналу гомодинных ссылки. Параболического зеркала используется для фокусировки ИК-излучения на кадмия теллурида ртути (MCT) инфракрасный детектор (Graseby Инфракрасная, Орландо, штат Флорида). Драйвер пьезо (Thorlabs, Ньютон, штат Нью-Джерси) используется для максимально обнаруженного сигнала путем коррекции фазы гомодинных света. Большинство оптических компонентов, описанные выше, прочно прикрепляться к платформе и сдвигается в XY и Z позиции, используя поступательное стадии. Доли переменного тока обнаружен сигнал передается на синхронный усилитель (модель SR844 РФ, Stanford Research Systems, Саннивейл, Калифорния), которая демодулирует сигнал на частоте колебаний кончика. Интенсивности рассеяния наблюдается как АСМ сканирование пробы поверхности и топографии данные получены одновременно. Программное обеспечение, используемое для передачи данных и изображений коллекции Наноскоп V5.31r1 (Veeco инструменты, Санта-Барбара, Калифорния).
Scheme1 
Рисунок 1 - показывает части системы визуализации которого сборки и использования, которые мы будем описывать 
0) Оптический стол
1) База ММ AFM
2) Сканер М. М. АСМ
3) Повышение оптических макет
(13 "х 18" х 3 / 8 ", Thorlabs)
4) Руководящие зеркала (золото с покрытием, 1 "диам.)
7) Оптические трубки используются для обеспечения установки на подъемной платформой (17)
8) ИК цель
(FL 16 мм, NA 0.28, Илинг)
9) Оптическая труба для собрали обратно-рассеянного света
10) Куб ж / внеосевого параболического зеркала
(90 °, FL 5 ", Янош)
11) Куб провести Ge пластины @ 45 °
12) окуляр микроскопа (x10)
13) XY-обскуры этапе монтируется (0,5 мм)
14) ИК-детектор MCT (Graseby ИК-порт)
15) ИК-детектор предусилитель (переменного и постоянного тока)
16) XY этапе перейти положения пучка
17) Подъемный стол для фокусировки пучка
18) Z-этапе позиции ИК-детектор
19) X-этапе позиции ИК-детектор
Ассамблея шаг I.1
Соберите оптические установки и с настройкой зеркал и положения гелий-неоновый (He-Ne) пучка параллельно оптической таблице (0) примерно в правильной высоте (H) над оптической макет (3) и расстояние (D) из центра Сканер (2).
Эта высота H и расстояние D можно оценить с высоты (H1) образца на верхней части сканера (2) из оптического стола, нужный угол падения (α), высота верхней части макета над оптическим стол (ч), геометрических размеров оптических куба и ИК цели (6 и 8 на рисунке 1) и рабочим расстоянием объективных ИК (все вместе г, то здесь г = 1 "+2" +2 ")
Рисунок 2 
H = H1 + д * греха (α)-ч
D = D * соз (α)
Ассамблея шаг I.2
Рисунок 3 
Рисунок 3: Без светоделитель в кубе (5) и с удлиненной оптические трубки на другом конце куб (6) прямой Ne-пучка через ирисы прилагается на концах труб.
Ассамблея шаг I.3
Рисунок 4 
Рисунок 4: С помощью сканера (2) удалить, приложите долго оптическая труба с диафрагмой в конце вместо ИК цели. Вставьте ZnSe частичной отражатель направить луч в сторону образца, путешествуя по длинной оптической трубы. ZnSe частичный отражатель должен быть установлен так, что луч гелий-неонового хитов переднюю поверхность отражателя в геометрическом центре оптического куб проведения частичной отражателя.
Рисунок 5 
Рисунок 5: При вращении частичный отражатель, прямой луч гелий-неоновый через закрытую диафрагму выход. Так как гора частичной отражатель не держать ее строго перпендикулярно, Есть два дома установленные винты, позволяющие для вертикального движения пучка. Используйте их, если это необходимо.
Рисунок 6 
Ассамблея шаг I.4
Рисунок 6. Горы параболического зеркала с резиновыми уплотнительными кольцами в оптическом куб (см. 1, рисунок 5). По закручивает гайки, уплотнительные кольца сжатия, что позволяет регулировки зеркал.
Рисунок 7 
С помощью дополнительных зеркал (одно показано на рисунке 7) прямые гелий-неоновый луч в противоположном направлении, как показано на рисунке 7. Отрегулируйте луч проходит через ранее использовавшиеся ирисов. Этот луч будет использоваться для настройки параболического зеркала.
Рисунок 8 
Рисунок 8: параболического зеркала помещается в оптическую куб (10) отражает свет на положение детектора. Регулировочные винты прямого пучка через отверстие помещается на выходе из куба (11), которая проведет германия (Ge) окна. После луча настраивается через отверстие, место MCT гetector близко к обскуры. Отрегулируйте положение ИК-детектор, что гелий-неонового луча на чувствительный элемент детектора. Переместите детектор вниз на ~ 2 мм (ИК-луч будет смещенная вниз на окна Ge).
Ассамблея шаг I.5
Рисунок 9 
Рисунок 9: Вставьте крепление с окном Ge в оптический куб (11). Антибликовое (AR), покрытых окна Ge служит ИК-фильтра и позволяет визуальных наблюдений кантилевера и образца. Прикрепить окуляр (12). Скручивание Угол куба (11) по отношению к кубу (10) позволяет указать окуляра в нужном направлении. Вращая горе окна Ge, луч гелий-неонового направляется через середину окуляра.
Рисунок 10 
Рисунок 10: Подключение ИК цель (8) и АСМ-сканера (2). Прикрепить beamstop к выходу конце оптической трубы (5). Используйте защитный фильтр при просмотре HeNe пучка через окуляр. Позиция образца на сканере и прямой HeNe пучка через входной оптической трубы (5). Убедитесь, что луч гелий-неонового является достаточно широким, чтобы перекинуться beamstop. Beamstop используется потому, что объективных Кассегрена, который только собирает входящий свет от периферии пучка. Регулируя нить окуляра четкое изображение гелий-неоновый луч сосредоточены на образце получается.
Ассамблея шаг I.6
Окончательные корректировки параболического зеркала не требуется. Выход отверстие заменяется диафрагмы в фокальной положение параболического зеркала. Удалить окно Ge-и ИК-детектором (марка положение ИК-детектор!). Присоединить дополнительные линзы после диафрагмы на приблизительный фокусное расстояние объектива от радужной оболочки. На данный момент занимается консольные должны быть видны через объектив. Отрегулируйте положение параболического зеркала к центру конце наконечника через закрытые диафрагмы. Обратите внимание, что когда луч гелий-неонового правильно фокусируется на кончик, он делает яркие искры между зондом и это отражение на поверхности образца. Повторно приложить окна Ge; настроить его для удобного визуального наблюдения консоли. Замените диафрагму с отверстием и помните, что отверстие для обнаружения ИК должен быть смещен от центра за счет смещения ИК-луча окна Ge. Место ИК-детектор на ранее отмеченные позиции.
Наконец, прямые ИК луч так, чтобы она путешествует вместе с видимым пучком гелий-неонового используется для настройки.
Теперь все должно быть готово для повседневного регулирования.
Рутинное Изменение:
Регулировка шага A.1:
Согласование с HeNe-Laser
Это проще для согласования с видимым HeNe (632nm), чем с невидимой ИК (около 6 мкм).
Путь HeNe и ИК-лучей сходятся в наклонный зеркало. Если это зеркало наклонена вниз HeNe может пройти, если зеркало находится в положении луч ИК распространяется на ближней зоне установки. Для выравнивания один из лучей только, используйте два зеркала не общее с другим путем и находятся перед наклонный зеркало. Если вы случайно переехал другого зеркала, сначала попробуйте довести это зеркало обратно в свои старые позиции.
A.1.1. Грубые Согласование с двумя зеркалами
Использование двух зеркал близки к гелий-неоновый лазер для выравнивания пучка через все ирисы на пути к ближней стадии. Если вы посмотрите на бревно в руки гомодинных, корона-подобный профиль пучка должны соблюдаться (из-за пучка окон в оптическую трубу). Это означает, что луч проходит прямо через трубы.
А1.2. Изобразительное Согласование с Near-Field этап
Прикрепите голову АСМ и заниматься кантилевера на образец. Фокус гелий-неоновый луч на конце кантилевера изображений. Если таким образом вытесняет пучка от середины входной оптической трубы (5) повторить шаг настройки A.1. и А.1.2. пока луч по центру.
Перемещая поступательного оптических этапе, отражающие микроскопом цель для фокусировки света на вершине острия кантилевера, где он рассеивается.
Поверните зеркало Ge ниже окуляр (расположенный в оптическом куб) и посмотрите в окуляр. Пучок фокусируется в этой точке (или на ИК-детектор, когда зеркало Ge извлекается из куба) по параболического зеркала. Перемещение этапе назад или вперед, пока резкое изображение острия и ее отражение на поверхности образца не наблюдается. Используйте два отам направлений (вверх / вниз и вправо / влево) для размещения иглой АСМ примерно в середине окуляра.
Глядя в телескоп, консольные АСМ и его кончик не наблюдается. Опять же, не забывайте использовать защитный фильтр при просмотре гелий-неоновый луч. Без луч гелий-неоновый, некоторые красный свет по-прежнему наблюдается которая берет начало от внутреннего света дистанционного управления АСМ. Перемещение этап в поступательном вправо-влево и / или вверх-вниз направлении, пока ярко-красный блеск наблюдается на вершине наконечника. Если выравнивание довольно плохо, двигаться на сцену, чтобы слева от АСМ и двигаться вправо медленно. Следите за красной отражение, перемещаемых через отражающую поверхность образца. Если красный отражение по-прежнему не наблюдается, переводить на сцену, чтобы еще раз налево и двигаться в верх-низ моды. Держите переводе влево-вправо, вверх-вниз, пока красный блеск наблюдается как вам сосредоточиться гелий-неоновый луч на кончик зонда АСМ.
A1.3. Перекрытие гомодинных поле с рассеянным светом
Открытое гомодинных руки и смотреть тщательного окуляра. Три или более мест в соответствии с уменьшением интенсивности видел и эти пятна в результате многократных отражений от передней и зад различных оптики. Перемещение зеркала в гомодинных руку так, чтобы второе место (снизу и по интенсивности) накладывается светлый образ наконечник, который является, где кончик и ее отражение идут вместе.
A1.4. Установите детектор
Удалить зеркало Ge и луч гелий-неонового должны идти в направлении, где ИК-детектор находится. За оптическую трубу, две кольцевые пятна не наблюдается. Второе место (по интенсивности) является местом, которое должно пройти через отверстие фольгой тепловой защиты на лице ИК-детектора. Месте с высокой интенсивностью должно рассматриваться на границе отверстия.
A1.5. Переход от одного образца к другому
После изменения образца АСМ больше не находится в том же положении, как и раньше, но не должно быть слишком далеко. Начните с шагом A.1.2, так как различие, как правило, не очень велик.
Примечание: Если выравнивание не горит, проверьте, чтобы убедиться, луч гелий-неонового по-прежнему проходит через все ирисы и создает ярко-красный блеск на кончик AFM. Иногда вы не заметили, что вы коснулись, и поэтому переехал зеркало в исходное положение. Если выравнивание по-прежнему плохо, к сожалению, вся процедура согласования должна быть завершена еще раз.
Регулировка шага 2: Согласование ИК-луча
Используйте линии СО-лазера с высокой интенсивностью / мощность (не менее 100 мВт), как это сделает выравнивание проще. Заполните детектор с жидким азотом, и пусть она равновесие в течение 30 минут.
2.1. Грубые Согласование с двумя зеркалами
Место измеритель мощности за первое диафрагмы для контроля мощности входящего луч ИК-порт. Затем настроить зеркало, которое находится перед наклонный зеркало, чтобы получить наибольшую степень чтения. Возьмите измеритель мощности и удерживать его позади радужной оболочки, которая ближе к ближней стадии и настроить наклонный зеркало, пока максимальное показание мощности получается. Повторите этот шаг несколько раз, для оптимальной настройки.
2.2. Смотря 1f сигнала
Ведения синхронный усилитель должен быть установлен в изоляции частота частота колебаний кончика, установив его на 1F (доб.), который является частота колебаний АСМ. Установить размер сканируемого оригинала в силе участок в режиме Наноскоп программного обеспечения до 3 мкм. После грубой регулировки в п. 2.1., Искать нужные формы сигнала 1F. Теперь выполните тонкую настройку фазы между рассеянным светом собранные зондом и homodyned свет от гомодинных руки, регулируя водитель пьезо. Это диски зеркало в гомодинных руку Изменяя напряжение пьезо-, так что первый минимум сигнала 1F составляет около 500 нм, начиная с нуля. Потому что каждое изменение в расстановке изменится длина обоих путей света и, следовательно, их относительные фазы, фазы должно быть исправлено с пьезо.
| Что Вы увидите (1f сигнал)? | |
| Плохо Мировоззрение: | Две шишки на 3 мкм размер сканирования г будет наблюдаться. |
| Средний Мировоззрение: | Кривизны первый удар выглядит немного больше, чем вогнутые и выпуклые второй удар меньше, чем первый. |
| (Почти) Хороший Мировоззрение: | Две шишки будут соблюдены. Первый удар выше, чем второй удар, и кривизна на правой стороне первый удар будет отрицательным (вогнутая). |
| Что делать для выравнивания? | |
| Плохо выравнивания: | Повторите процедуру выравнивания в шаге 2,1 по мере необходимости. Поскольку диаметр ИК-луча большой, большинство из луч пройдет ирисы, даже если оно не идеально ровные. Даже если две шишки все еще наблюдается, количество сигнал 1F может быть увеличена путем настройки одного или обоих выравнивание зеркал. Следите за небольшие изменения в кривизне первый удар. Прежде всего, будьте терпеливы, поскольку это самая трудная часть выравнивания. |
| Средний Мировоззрение: | Попробуйте настроить один или оба выравнивание зеркала получить почти хорошее выравнивание. Попробуйте переместить XYZ поступательного сцене, как хорошо, но приведение ее к очень маленьким шагом. |
| (Почти) Хороший Мировоззрение: | Отрегулируйте зеркала и попробовать увеличить максимум первого удар. 1F сигналы, как правило, от 8 до 16 В, для малых мощностях входного меньше. Изменение фазы путем изменения напряжения с помощью драйвера пьезо-, так что первый минимум приближается к нулю. Если есть значительный сигнал 1F, переключатель ведения синхронный усилитель, чтобы изолировать 2F сигнала. Некоторые из сигнала должны быть соблюдены и попытаться улучшить его немного больше по чуть-чуть настройки зеркал и изменение фазы. |
2.3. Переход от одного образца к другому
Выполните шаг A.1.5 под выравнивания луч гелий-неоновый. Привлекать иглой АСМ и распространять ИК-луча через микроскоп. Наблюдать сигнал 1F. Если сигнал 1F-прежнему наблюдается, отрегулируйте наклонный зеркала и настроить фазу. Хорошо, если сигнал и, следовательно, хорошее 2F сигнала могут по-прежнему наблюдается. Если нет, мелко выровнять пучка с помощью шагом 2.2.
Представитель Результаты:
Подготовка образцов # 21-31 пептид был синтезирован в Центре биотехнологии и биоинженерии в Университете Питтсбурга и очищенный (> 95%) с помощью ВЭЖХ. Для синтеза амилоидные фибриллы, 0,8 мг ТМАО (Sigma-Aldrich) добавляют к раствору 1 мм # 21-31 пептида в 18 МОм воды, похож на процедуры выполняются Yang и соавт. XIV
Ultraflat золотой подложки XV были сделаны. 40 мкл одного месяца решение (комнатной температуры инкубации, рН 5,5) наносился в течение нескольких минут на свежем субстратов золота ultraflat. Они были на некоторое время промыть поток 18 МОм водой, сушат с проточной N 2 газовых и позиционируется в инструмент ANSIM.
На рисунке 11 показано топографии и ближнего поля изображений, собранных для # 21-31 пептидные фибриллы. ) Топография изображение, полученное одновременно с соответствующим ближнего поля изображения. Этикетки представляют отдельные фибриллы, и используются, чтобы показать тип вторичной конформации каждой фибриллы имеет. В и С) корреспондент ближнего поля изображения, собранные на двух разных волновых чисел: 1631 и 1691 см -1. Площадь каждого изображения 1 х 1 мкм 2. Левая шкала представляет высоту, правая шкала является рассеянное поле от синхронный усилитель.
Рисунок 11 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы выражаем искреннюю благодарность NSF, NSERC, NIH, и ОНР.
References
- Mueller, K., Yang, X., Paulite, M., Fakhraai, Z., Gunari, N., Walker, G. C. Chemical imaging of the surface of self-assembled polystyrene-b-poly(methyl methacrylate) diblock copolymer films using apertureless near-field IR microscopy. Langmuir. 24, 6946-6951 (2008).
- Lahrech, A., Bachelot, R., Gleyzes, P., Boccara, A. C. Infrared-reflection-mode near-field microscopy using an apertureless probe with a resolution of lambda/600. Opt. Lett. 21, 1315-1317 (1996).
- Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. Performance of visible and mid-infrared scattering-type near-field optical microscopes. J. Microsc. 210, 311-314 (2003).
- Kim, Z. H., Leone, S. R. Polarization-selective mapping of near-field intensity and phase around gold nanoparticles using apertureless near-field microscopy. Optics Express. 16, 1733-1741 (2008).
- Bridger, P. M., McGill, T. C. Observation of nanometer-scale optical property discrimination by use of a near-field scanning apertureless microscope. Opt. Lett. 24, 1005-1007 (1999).
- Stebounova, L., Akhremitchev, B. B., Walker, G. C. Enhancement of the weak scattered signal in apertureless near-field scanning infrared microscopy. Rev. Sci. Instrum. 74, 3670-3674 (2003).
- Akhremitchev, B. B., Pollack, S., Walker, G. C. Apertureless Scanning Near-Field Infrared Microscopy of a Rough Polymeric Surface. Langmuir. 17, 2774-2781 (2001).
- Hecht, B., Bielefeldt, H., Inouye, Y., Pohl, D. W., Novotny, L. Facts and Artifacts in Scanning Near-Field Optical Microscopy. J. Appl. Phys. 81, 2492-2498 (1997).
- Labardi, M., Patane, S., Allegrini, M. Artifact-free near-field optical imaging by apertureless microscopy. Appl. Phys. Lett. 77, 621-623 (2000).
- Palanker, D. V., Simanovskii, D. M., Huie, P., Smith, T. I. On Contrast Parameters and Topographic Artifacts in Near-Field Infrared Microscopy. J. Appl. Phys. 88, 6808-6814 (2000).
- Akhremitchev, B. B., Sun, Y., Stebounova, L., Walker, G. C. Monolayer-Sensitive Infrared Imaging of DNA Stripes Using Apertureless Near-Field Microscopy.Langmuir. 18, 5325-5328 (2002).
- Brehm, M., Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. Infrared Spectroscopic Mapping of Single Nanoparticles and Viruses at Nanoscale Resolution. Nano Lett. 7, 1307-1310 (2006).
- Dazzi, A., Prazeres, R., Glotin, F., Ortega, J. M. Analysis of nano-chemical mapping performed by an AFM-based ("AFMIR") acousto-optic technique. Ultramicroscopy. 107, 1194-1200 (2007).
- Yang, D. S., Yip, C. M., Huang, T. H. J., Chakrabartty, A., Fraser, P. E. Manipulating the Amyloid-β Aggregation Pathway with Chemical Chaperones. J. Biol. Chem. 274, 32970-32974 (1999).
- Meadows, P. Y., Walker, G. C. Force Microscopy Studies of Fibronectin Adsorption and Subsequent Cellular Adhesion to Substrates with Well-Defined Surface Chemistries. Langmuir. 21, 4096-4107 (2005).
