Summary
Montering av en nearfield infraröd mikroskop för avbildning protein aggregat beskrivs.
Abstract
Detta dokument syftar till att instruera läsaren i montering och drift av en infraröd närområdet mikroskop för avbildning bortom diffraktionsgränsen. Den apertureless närområdet mikroskop är en ljusspridning typ instrument som ger infraröda spektra på ca 20 nm upplösning. En fullständig lista över komponenter och en steg-för-steg-protokoll för användningen. Vanliga fel i montering och instrument tuning diskuteras. En representant datauppsättning som visar den sekundära strukturen av en amyloid ROTHÅR presenteras.
Protocol
Bakgrund:
Apertureless sond närområdet IR-mikroskopi ger hög rumslig upplösning. Det är en relativt ny teknik där en incident infraröd stråle är utspridd av en skarp atomkraftsmikroskopi (AFM) spets oscillerande vid resonansfrekvens av fribärande nära provet. En IR-detektor samlar spritt ljus och är demodulerade vid denna resonansfrekvens eller dess övertoner. På detta sätt kan bakgrunden skingra den fokuserade laserstrålen incident på resten av provets yta minskas och en rumslig upplösning långt bortom den diffraktionsgränsen av ljus kan uppnås för att få infraröd kontrast till nanoskala rumsliga upplösningen I, II, III . Sedan toppen av AFM spets är mycket mindre än det prioriterade området för laserstrålen, är det spridda ljuset svagt. För att stärka detta splittrade område är homodyne detektion används där en hänvisning fält läggs till den samlade utspridda fältet och den relativa fasen av fälten är inställd så att de största konstruktiv interferens förekommer i detektorn. Den spridningen intensitet är då proportionell mot storleken av hänvisningen elektriska fält IV, V, VI. En viktig fråga i närområdet avbildning är att undvika artefakter som produceras av Z-rörelse AFM spets VII, VIII, IX, X, XI. Detta problem kan minskas med rätt inställning av homodyne fas och exklusive stora topografiska funktioner, som tidigare visat Mueller et al. Denna teknik sedan tillförlitligt används för att få experimentella spridning spektrum av material med en rumslig upplösning på mindre än 30 nm 15 . Användningen av närområdet mikroskopi för biologiskt material har tidigare påvisats, särskilt för makromolekyler såsom tobak viruset XII och E. coli-bakterier XIII.
I denna rapport belyser vi montering av en sådan bildenhet. Vi presenterar också sekundär struktur information amyloidfibrerna bildas från # 21-31 peptid fragment av β 2-m erhålls genom apertureless närområdet scanning infraröd mikroskopi (ANSIM). Närområdet bilder samlas in samtidigt med topografi, vilket möjliggör upptäckt och insamling av spridning spektrum av individuella fibriller.
Vår apertureless närområdet scanning infraröd mikroskop (ANSIM) mätningar är en hemmagjord anordning. Den schematiska av experimentuppställning visas i Scheme 1. En AFM mikroskop (Multimode, Veeco Instrument, Santa Barbara, CA) används för att mäta topografin av provet samt tillverka närområdet bättre spridning modulerade i spetsen oscillationsfrekvens. Tapping-läge, NSC14/Ti-Pt platina-belagd utliggare (MicroMasch, Estland) används för att öka spridningen av den kontinuerliga, avstämbara IR-laser (frekvensområde: 2000 cm -1 till 1600 cm -1, PL3 CO-gas laser, Edinburgh Instrument, Storbritannien) nära ytan. En helium-neon laser (Melles Griot, Albuquerque, NM) området används som en guide för osynlig infraröd strålning. IR-laser ljuset sprids mot en lins efter passage av en ZnSe partiell reflektor. Det är då fokuseras på toppen av den oscillerande AFM spets, med polarisering av balken parallellt med den långa axeln av sonden. IR-strålningen som samlas in av linsen läggs sedan till en referens homodyne signal. En paraboloidal spegel används för att fokusera IR-strålningen på en kvicksilver kadmiumtellurid (MCT) IR-detektor (Graseby Infraröd, Orlando, FL). En piezo-drivrutin (Thorlabs, Newton, NJ) utnyttjas för att maximera de upptäckta signalen genom att korrigera fasen av homodyne ljus. De flesta av optiska komponenter som beskrivs ovan är väl fäst på en plattform och skiftade i XY eller Z-position med hjälp av en translationell skede. AC bråkdel av de upptäckta signal överförs till en lock-in förstärkare (modell SR844 RF, Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA) som demodulerar signalen i spetsen oscillationsfrekvens. Den spridningen intensitet observeras som AFM spets scannar urvalet yta och topografi uppgifter erhålls samtidigt. Den programvara som används för data och bildsamling är NanoScope V5.31r1 (Veeco Instrument, Santa Barbara, CA).
Scheme1 
Figur 1 - visar delar av imaging system vars montering och användning kommer vi att beskriva 
0) Optisk tabellen
1) Bas av MM AFM
2) Scanner av MM AFM
3) Förhöjd optisk bakbord
(13 "x 18" x 3 / 8 ", Thorlabs)
4) Vägledande speglar (guld belagd, 1 "dia.)
7) Optisk tub som används för att säkra inställningar på upplyftande plattformen (17)
8) IR-målet
(FL 16 mm, NA 0,28, Ealing)
9) Optiskt rör för in back-spritt ljus
10) Cube w / off-axis paraboloidal spegel
(90 °, FL 5 ", Janos)
11) Cube hålla Ge plattan @ 45 °
12) Mikroskop okular (x10)
13) XY steg monterade hål (0,5 mm)
14) MCT IR-detektor (Graseby Infraröd)
15) IR-detektor preamp (AC och DC)
16) XY steg att flytta strålen ställning
17) Höjning bordet för att fokusera strålen
18) Z-stadiet att placera IR-detektor
19) X-stadiet att placera IR-detektor
Montering steg I.1
Montera den optiska setup och med tuning speglar och placera Helium-Neon (HeNe) stråle parallell med den optiska bordet (0) ungefär rätt höjd (H) över den optiska bakbord (3) och avstånd (D) från mitten av scanner (2).
Denna höjd h och avståndet D kan beräknas från höjd (H1) av provet på toppen av skannern (2) från den optiska bordet, önskad infallsvinkel (α), höjden på toppen av breadboard ovanför den optiska bordet (h), geometriska storleken på optiska kuben och IR-objektiv (6 och 8 i figur 1) och arbetar avstånd av IR-objektiv (alla tillsammans d, här d = 1 "2" 2 ")
Figur 2 
H = H1 + d * sin (α)-h
D = D * cos (α)
Montering steg I.2
Figur 3 
Figur 3: Utan beamsplitter i kuben (5) och med långsträckta optiska röret i andra änden av kuben (6) direkt He-Ne stråle genom iris fäst i ändarna av rören.
Montering steg I.3
Figur 4 
Figur 4: Med scanner (2) tas bort, fäst den långa optiska röret med iris i slutet i stället för IR-målet. Sätt ZnSe partiella reflektorn att rikta strålen mot provet genom reser ner de långa optiska tuben. Den ZnSe partiella reflektorn bör monteras så att HeNe strålen träffar den främre ytan av reflektorn i geometriska mittpunkt optiska kuben håller delvis reflektorn.
Figur 5 
Figur 5: Genom att rotera partiella reflektor, styra HeNe stråle genom det stängda utgång iris. Eftersom fästet av den partiella reflektorn inte håller den exakt vinkelrätt finns det två hem-installerade justerskruvarna, vilket möjliggör vertikal rörelse av balken. Använd dem vid behov.
Figur 6 
Montering steg I.4
Figur 6. Montera paraboloidal spegeln med gummi O-ringar i den optiska kub (se 1, Figur 5). Genom att dra åt skruvarna, komprimera O-ringar, vilket möjliggör spegel justering.
Figur 7 
Med ytterligare speglar (en visas i Figur 7) styra HeNe balk i motsatt riktning, vilket illustreras i Figur 7. Justera strålen att passera genom den tidigare använda iris. Denna stråle kommer att användas för att justera paraboloidal spegeln.
Figur 8 
Figur 8: En paraboloidal spegel placerad i den optiska kuben (10) reflekterar ljuset mot den position detektorn. Justerskruvarna direkta strålen genom hål placeras på utgången av kuben (11), som kommer att hålla germanium (Ge) fönster. Efter att strålen är inställd genom hål, placera MCT detector nära hål. Justera placeringen av IR-detektor, så att Han-Ne stråle på avkänning del av detektorn. Flytta detektorn fastställts av ~ 2 mm (infraröda strålen kommer att flyttas ner från Ge fönster).
Montering steg I.5
Figur 9 
Figur 9: Sätt in fästet med GE fönster till optiska kub (11). Den anti-reflektion (AR) belagd Ge fönster fungerar som ett IR-filter och tillstånd visuella observationer av fribärande och provet. Montera okularet (12). Vrida vinkel kuben (11) med avseende på kuben (10) gör att man kan peka okularet i önskad riktning. Genom att rotera fästet av GE fönstret är HeNe strålen riktas genom mitten av okularet.
Figur 10 
Figur 10: Anslut IR-målet (8) och AFM skanner (2). Fäst beamstop till utgången änden av den optiska tuben (5). Använd en skyddande filter när du tittar på HeNe stråle genom okularet. Placera ett prov på skannern och rikta HeNe stråle genom ingången optiska tuben (5). Se till att HeNe strålen är tillräckligt brett för att spilla över beamstop. Den beamstop används på grund av Cassegrain mål som bara samlar inkommande ljuset från periferin av balken. Genom att justera tråd av okularet en skarp bild av HeNe balken fokuserade på provet erhålls.
Montering steg I.6
En slutlig justering av paraboloidal spegel krävs. Utgången Pinhole ersätts med iris i centrala position paraboloidal spegeln. Ta bort Ge fönster och IR-detektor (markera positionen för IR-detektor!). Fäst en extra lins efter iris vid den ungefärliga brännvidd objektivet från iris. I detta ögonblick engagerade fribärande ska vara synliga genom objektivet. Justera positionen för paraboloidal spegeln till mitten slutet av spetsen genom den stängda iris. Observera att när HeNe strålen är rätt fokuserad på spetsen, gör det en ljus gnistrar mellan spetsen och det är reflektion över provets yta. Sätt tillbaka Ge fönstret, justera den för bekväm visuell kontroll av fribärande. Ersätt iris med hål och komma ihåg att hål används för IR-detektering bör flyttas från centrum på grund av den infraröda strålen förskjutning av Ge fönstret. Placera IR-detektor på den tidigare markerade positionen.
Slutligen direkt den infraröda strålen så att den färdas tillsammans med synliga HeNe stråle som används för trimning.
Nu är allt bör vara redo för rutinmässig justering.
Rutin justering:
Justering steg A.1:
Anpassningen till HeNe-Laser
Det är lättare att anpassa den synliga HeNe (632nm) än med den osynliga IR (ca 6μm).
Sökvägen till HeNe och IR-strålarna samlas på det ställbara spegeln. Om detta speglar lutar ner HeNe kan passera, om spegeln är på plats den infraröda strålen propagerar till närområdet setup. För anpassning av en av strålarna endast använder två speglar inte gemensamt med den andra vägen och ligger före den vinklingsbara spegeln. Om du av misstag har flyttat en annan spegel, först försöka få denna spegel tillbaka i sin gamla position.
A.1.1. Grov Anpassningen till två Speglar
Använd två speglar nära HeNe laser för att rikta strålen genom alla iris längs vägen till närområdet skede. Om man tittar på balk i homodyne armen bör en korona-liknande stråle profil observeras (på grund av balken blockerare i den optiska tuben). Detta indikerar att balken passerar rakt igenom rören.
A1.2. Fin Anpassningen till närområdet Stage
Fäst AFM huvudet och engagera fribärande spetsen på provet. Fokusera HeNe stråle på slutet av avbildning fribärande. Om detta förskjuter strålen från mitten av indata optiska tuben (5) Upprepa tuning steg A.1. och A.1.2. tills strålen är centrerad.
Genom att flytta translationell optiska skede är det reflekterande mikroskop målet justeras för att fokusera ljuset på toppen av cantilever spets, där den är utspridd.
Rotera Ge spegeln under okularet (finns i den optiska kuben) och titta genom okularet. Balken är fokuserad på denna punkt (eller på IR-detektorn när GE spegeln dras ut av kuben) av paraboloidal spegeln. Flytta scenen bakåt eller framåt tills en skarp bild av spets och att reflektera över provets yta observeras. Använd de två Ofinns riktningar (upp / ner och höger / vänster) för att placera AFM spets ungefär i mitten av okularet.
Letar du genom ett teleskop, är AFM fribärande och dess spets observerats. Återigen, kom ihåg att använda ett skyddande filter när du tittar på HeNe strålen. Utan HeNe bom, några röda ljus fortfarande observeras som härrör från den interna bakgrund av AFM längdkontroll. Flytta translationell steget i en höger-vänster-och / eller upp-ned riktning tills en klarröd gnistrar observeras på spetsen spetsen. Om inriktningen är ganska dålig, flytta scenen till vänster om AFM och flytta till rätt långsamt. Håll utkik efter en röd reflektion rör sig över den reflekterande provets yta. Om den röda reflektion är fortfarande inte iakttas, översätta scenen åt vänster igen och rör sig i en upp-ner mode. Håll översätta vänster-höger, upp och ner tills en röd gnistra observeras när du fokuserar på HeNe strålen på spetsen av AFM spets.
A1.3. Överlappar homodyne fältet med spritt ljus
Öppna homodyne armen och titta grundligt okularet. Tre eller fler platser i en rad med minskande intensitet ses och dessa platser är ett resultat av flera reflektioner om fram-och bakdelen av olika optik. Flytta spegeln i homodyne armen så att den andra platsen (från botten och i intensitet) överlappar den ljusa bilden av spetsen, som är där spetsen och dess reflektion går samman.
A1.4. Placera detektorn
Ta bort Ge spegeln och HeNe strålen bör gå i den riktning där IR-detektorn är placerad. Bakom den optiska tuben, två ringlike fläckar observerats. Den andra platsen (i intensitet) är den plats som ska gå genom hålet i värmeskydd folien på framsidan av IR-detektor. Platsen med den högsta intensiteten ska ses på gränsen till hålet.
A1.5. Byte från ett prov till ett annat
När du har ändrat provet AFM spets är inte längre i exakt samma position som förut, men bör inte vara alltför långt borta. Börja med steg A.1.2, eftersom skillnaden är normalt inte särskilt stor.
Observera: Om inriktningen är avstängd kontrollera om de HeNe strålen fortfarande går igenom alla iris och skapar en klarröd gnistrar på AFM spets. Ibland kan du inte märker att du har berört och därför flyttade en spegel från sin ursprungliga position. Om inriktningen är fortfarande dålig tyvärr hela anpassning förfarande måste fyllas igen.
Justering steg 2: Justering av IR-Beam
Använd en linje CO laser med en hög intensitet / effekt (minst 100 mW) eftersom detta kommer att göra justeringen enklare. Fyll detektorn med flytande kväve och låt jämvikta i minst 30 minuter.
2,1. Grov Anpassningen till två Speglar
Placera en kraftmätare bakom den första iris att övervaka makt inkommande IR-strålen. Därefter, justera spegeln som är placerad innan den vinklingsbara spegeln för att få den högsta makten läsning. Ta wattmetern och håll den bakom iris som är närmast närområdet scenen och justera det ställbara spegeln tills en maximal effekt avläsning erhålls. Upprepa detta steg några gånger för optimal justering.
2,2. Titta på 1f Signal
Hänvisningen till låset förstärkaren måste vara inställd på isolera frekvensen av spetsen oscillationsfrekvens genom att ställa den till 1F (extern), som är AFM oscillationsfrekvens. Ställ skanningsstorlek i kraft tomt läge i NanoScope programvara till 3 mikrometer. Efter grovjustering i 2,1., Leta efter rätt form 1F signalen. Därefter ställa in fasen mellan det spridda ljuset samlas in från spetsen och homodyned ljuset från homodyne armen genom att justera piezo föraren. Detta driver spegeln i homodyne armen Genom att ändra spänningen av piezo så att det första minimum av 1F signalen är ca 500 nm med början från noll. Eftersom varje förändring i inriktningen kommer att ändra längden på både vägar av ljus och därmed deras relativa faser behöver fasen ska korrigeras med piezo.
| Vad kommer du att se (1f signal)? | |
| Bad Justering: | Två knölar på 3 ìm z skanningsstorlek kommer att beaktas. |
| Medium Justering: | Krökning av den första knölen ser lite mer konkav än konvex och den andra bump är mindre än den första. |
| (Nästan) Bra Justering: | Två gupp kommer att beaktas. Den första bump är högre än den andra gupp, och krökning på höger sida av det första bump blir negativ (konkav). |
| Vad göra för anpassning? | |
| Dålig anpassning: | Upprepa justeringen proceduren i steg 2,1 som krävs. Eftersom den infraröda strålen diameter är stor, kommer de flesta av balken passerar iris även om det inte helt är i linje. Även om två gupp fortfarande följs, kan det belopp som 1F signalen ökas genom att ställa en eller båda av anpassning speglar. Håll utkik efter små förändringar i kurvatur första bula. Mest av allt, ha tålamod eftersom det är den svåraste delen av justeringen. |
| Medium Justering: | Prova att justera en eller båda av anpassning speglar för att få en nästan bra anpassning. Prova att flytta XYZ translationell scenen också, men anpassa den med mycket små steg. |
| (Nästan) Bra Justering: | Ställ in speglarna och försök att höja den högsta av de första bula. 1F signaler är vanligen omkring 8 till 16 V, för låg input krafter det är mindre. Ändra fas genom att ändra spänningen med piezo-drivrutinen så att den första minst kommer närmare noll. Om det finns en betydande 1F signal, byta referens låset förstärkaren att isolera 2F signalen. Några av signalen bör observeras och försöka förbättra det lite mer av en aning finjustera speglar och ändring av fasen. |
2,3. Byte från ett prov till ett annat
Utför Steg A.1.5 under anpassningen av HeNe balken. Engagera AFM spets och sprida den infraröda strålen genom mikroskop. Titta på 1F signalen. Om en 1F-signalen är fortfarande observeras, justera tiltbar spegeln och justera fasen. En god IF signal och därför ett bra 2F signal kan fortfarande observeras. Om inte, fint rikta strålen med hjälp av steg 2,2.
Representativa resultat:
Provberedning Den # 21-31 peptid sammanställdes vid Centrum för bioteknik och Bioteknik vid University of Pittsburgh och renat (> 95%) av HPLC. För att syntetisera amyloidfibrerna, 0,8 mg TMAO (Sigma-Aldrich) lades till en lösning av 1 mm # 21-31 peptid i 18 Mohm vatten, ungefär som ett förfarande som utförs av Yang et al. Xiv
Ultraflat guld substrat xv gjordes. 40 mikroliter av den en månad gamla lösningen (rumstemperatur inkubation, pH 5,5) deponerades i flera minuter på färska substrat ultraflat guld. De var kort sköljas med en ström av 18 Mohm vatten, torkas med flytande N 2 gas och placerad i ANSIM instrumentet.
Figur 11 visar topografi och närområdet bilder som samlats in för # 21-31 peptid fibriller. A) Topografi bild som erhålls samtidigt med motsvarande närområdet bild. Etiketterna representerar enskilda fibriller och används för att presentera den typ av sekundära konformation varje ROTHÅR har. B och C) Motsvarande närområdet bilder som samlats in på två olika wavenumbers: 1631 och 1691 cm -1. Området varje bild är 1 x 1 mm 2. Vänster skala representerar höjd, höger skala det spridda fältet från lock-in förstärkare.
Figur 11 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi erkänner tacksamt NSF, NSERC, NIH, och ONR.
References
- Mueller, K., Yang, X., Paulite, M., Fakhraai, Z., Gunari, N., Walker, G. C. Chemical imaging of the surface of self-assembled polystyrene-b-poly(methyl methacrylate) diblock copolymer films using apertureless near-field IR microscopy. Langmuir. 24, 6946-6951 (2008).
- Lahrech, A., Bachelot, R., Gleyzes, P., Boccara, A. C. Infrared-reflection-mode near-field microscopy using an apertureless probe with a resolution of lambda/600. Opt. Lett. 21, 1315-1317 (1996).
- Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. Performance of visible and mid-infrared scattering-type near-field optical microscopes. J. Microsc. 210, 311-314 (2003).
- Kim, Z. H., Leone, S. R. Polarization-selective mapping of near-field intensity and phase around gold nanoparticles using apertureless near-field microscopy. Optics Express. 16, 1733-1741 (2008).
- Bridger, P. M., McGill, T. C. Observation of nanometer-scale optical property discrimination by use of a near-field scanning apertureless microscope. Opt. Lett. 24, 1005-1007 (1999).
- Stebounova, L., Akhremitchev, B. B., Walker, G. C. Enhancement of the weak scattered signal in apertureless near-field scanning infrared microscopy. Rev. Sci. Instrum. 74, 3670-3674 (2003).
- Akhremitchev, B. B., Pollack, S., Walker, G. C. Apertureless Scanning Near-Field Infrared Microscopy of a Rough Polymeric Surface. Langmuir. 17, 2774-2781 (2001).
- Hecht, B., Bielefeldt, H., Inouye, Y., Pohl, D. W., Novotny, L. Facts and Artifacts in Scanning Near-Field Optical Microscopy. J. Appl. Phys. 81, 2492-2498 (1997).
- Labardi, M., Patane, S., Allegrini, M. Artifact-free near-field optical imaging by apertureless microscopy. Appl. Phys. Lett. 77, 621-623 (2000).
- Palanker, D. V., Simanovskii, D. M., Huie, P., Smith, T. I. On Contrast Parameters and Topographic Artifacts in Near-Field Infrared Microscopy. J. Appl. Phys. 88, 6808-6814 (2000).
- Akhremitchev, B. B., Sun, Y., Stebounova, L., Walker, G. C. Monolayer-Sensitive Infrared Imaging of DNA Stripes Using Apertureless Near-Field Microscopy.Langmuir. 18, 5325-5328 (2002).
- Brehm, M., Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. Infrared Spectroscopic Mapping of Single Nanoparticles and Viruses at Nanoscale Resolution. Nano Lett. 7, 1307-1310 (2006).
- Dazzi, A., Prazeres, R., Glotin, F., Ortega, J. M. Analysis of nano-chemical mapping performed by an AFM-based ("AFMIR") acousto-optic technique. Ultramicroscopy. 107, 1194-1200 (2007).
- Yang, D. S., Yip, C. M., Huang, T. H. J., Chakrabartty, A., Fraser, P. E. Manipulating the Amyloid-β Aggregation Pathway with Chemical Chaperones. J. Biol. Chem. 274, 32970-32974 (1999).
- Meadows, P. Y., Walker, G. C. Force Microscopy Studies of Fibronectin Adsorption and Subsequent Cellular Adhesion to Substrates with Well-Defined Surface Chemistries. Langmuir. 21, 4096-4107 (2005).
