Summary
يصف هذا البروتوكول التصوير من الخلايا العصبية الفردية أو الخلايا العصبية في قمة العيش الأجنة الزرد. ويستخدم هذا الأسلوب لدراسة سلوكيات الخلوية والتوطين أكتين باستخدام مضان مبائر الوقت الفاصل بين المجهري.
Abstract
والزرد هو النموذج المثالي للسلوك الخلية التصوير خلال التنمية في الجسم الحي. والأجنة المخصبة الزرد خارجيا ، وبالتالي يسهل الوصول إليها في جميع مراحل التنمية. علاوة على ذلك ، درجة وضوحها البصرية يسمح ارتفاع القرار التصوير من الخلايا والديناميات الجزيئية في البيئة الطبيعية للجنين سليمة. نحن باستخدام نهج التصوير العيش لتحليل سلوك الخلية العصبية خلال قمة الهجرة الخليوي ، وثمرة لتوجيهات ومحاور الخلايا العصبية.
يعيش التصوير مفيد بشكل خاص لفهم الآليات التي تنظم عمليات حركية الخلية. لتصور تفاصيل خلية حركية ، مثل النشاط تبارزي والديناميات الجزيئية ، فإنه من المفيد تسمية الخلايا الفردية. في الزرد ، البلازميد حقن الحمض النووي تعطي التعبير الفسيفساء عابرة نمط ويقدم فوائد متميزة عن غيرها من أساليب وسم الخلية. على سبيل المثال ، خطوط المعدلة وراثيا في كثير من الأحيان تسمية السكان الخلية بأكملها ، وبالتالي قد تحجب رؤية من نتوءات غرامة (أو تغييرات في توزيع الجزيئية) في خلية واحدة. بالإضافة إلى ذلك ، حقن الحمض النووي في مرحلة واحدة الخلية هو أقل الغازية وأكثر دقة من حقن صبغة في مراحل لاحقة.
نحن هنا تصف طريقة لوضع العلامات الفردية الخلايا العصبية أو خلايا النامية قمة العصبية والتصوير سلوكهم في الجسم الحي. نحن حقن الحمض النووي بلازميد في خلايا أجنة 1 المرحلة ، والذي ينتج التعبير التحوير الفسيفساء. ناقلات تحتوي على خلايا معينة المروجين هذا التعبير محرك الجين من الاهتمام في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحسية أو الخلايا العصبية العرف. نحن نقدم أمثلة من الخلايا المسمى مع GFP غشاء المستهدفة أو مع التحقيق الذي تجريه جهاز الاستشعار البيولوجي التي تسمح برؤية أكتين F - 1 في الخلايا الحية.
ساهم إيريكا أندرسون ، Asuri نامراتا ، وماثيو كلاي على قدم المساواة في هذا العمل.
Protocol
1. التجمع من الشرائح الحقن وشرائح التصوير
حقن شرائح :
- إعداد Sylgard الاستومر السيليكون وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- استخدام Sylgard إلى ثلاثة السندات القياسية ميكروسكوب الشرائح معا عن طريق التراص شريحة واحدة على رأس تقاطع الشرائح اثنين آخرين ، والتي رتبت جنبا إلى جنب على حواف طويلة. الشريحة الأعلى يخلق الزاوية اليمنى قائم الزاوية أو "الجدار" بين أعلى وأسفل الشرائح.
- اسمحوا تعيين Sylgard بين عشية وضحاها. هذه الشرائح هي التي يعاد استخدامها.
التصوير الشريحة :
- نستخدم مستطيلات الفولاذ المقاوم للصدأ لقطع نفس الحجم من شريحة زجاجية مجهر القياسية (75mm X 25mm X 1MM) بحيث يناسب غرفة حامل الشرائح على الساحة المجهر. يتم قطع ثقب الطول 1.5 في وسط المستطيل.
- اللاحقه حتى 22 مم 2 ساترة إلى المستطيل المعدن مع Sylgard. استخدام ما يكفي لاغلاق Sylgard بدقة ساترة. لصورة على مجهر مقلوب ، وسوف يتم تنظيمها على هذا الأجنة ساترة والتقط من القاع.
- اسمحوا تعيين Sylgard بين عشية وضحاها. هذه الشرائح هي التي يعاد استخدامها وتنظيفها مع الايثانول 70 ٪ بين الاستخدامات.
2. إعداد البنى الحمض النووي
للتعبير عن التحوير بطريقة محددة الأنسجة ، هو استنساخ الجينات وراء المصالح مروج خلية محددة. نستخدم العنصر مقرون التنظيم من الجينات neurogenin1 الزرد (- 3.1ngn1) 2 أو الجين sox10 (- 4.9sox10) 3 إلى محرك التعبير في الخلايا العصبية الحسية أو الخلايا العصبية العرف ، على التوالي. لتصور غشاء الخلية وديناميكية ، فإننا نعرب عن هيولي أو fluorophores الأغشية المترجمة. للتوزيع F - أكتين صورة ، فإننا نعرب عن الحمض النووي الترميز المجال للتناظر calponin utrophin تنصهر لmCherry (UtrCH - mCherry). المسبار جهاز الاستشعار البيولوجي UtrCH - mCherry تسمح برؤية أكتين - F دون التدخل في ديناميات أكتين 1. نحن تولد هذه بنيات باستخدام الحمض النووي عبارة Invitrogen إعادة التركيب القائم على استراتيجية الاستنساخ (4) وناقلات المنصوص عليها في Tol2kit الزرد 5.
- توليد ناقلات التعبير (ق) باستخدام متعددة المواقع ، بوابة التكنولوجيا وناقلات من الزرد Tol2kit 5. البلازميدات تحتوي على العمود الفقري Tol2 من pT2KXIGDin.
- تنقية البلازميد الحمض النووي مع البلازميد QIAfilter طقم الإعدادية ميدي (QIAGEN شركة) ، وأزل في الماء المعقم. الحمض النووي لا يحتاج إلى أن يكون خطي للحقن.
3. يبني حقن الحمض النووي
- يخفف من تركيز الحمض النووي للنهائي من الحمض النووي ميكروغرام / مل 10-50 في أحمر الفينول 0.2 ٪ (على التصور خلال حقن) في الماء.
- تعبئة ومعايرة الإبرة : عودة ملء إبرة سحب شعري مع ما يقرب من 1 ميكروليتر DNA الحل وأدخله حامل إبرة جهاز الحقن (نستخدم Picospritzer). باستخدام الملقط غرامة ، وكسر بلاغ الإبرة بحيث افتتاح القمة هو ما يقرب من 10 ملم في القطر. قياس قطرها الحبرية في الزيوت المعدنية مع ميكرومتر العين. ضبط ضغط مدة الإعداد للحصول على قطرات من حجم NL ما يقرب من 1.
- 1 جمع خلايا الأجنة في مرحلة المتوسطة الجنين E3 (كلوريد الصوديوم 5mm ، و 0.17mM بوكل ، 0.33mM CaCl 2 ، 4 * 0.33mM MgSO 7H 2 O ، ودرجة الحموضة 7.0).
- نقل حوالي 30-60 الأجنة إلى الشريحة الحقن ووضع الأجنة في الزاوية الزاوية اليمنى تشكلت بين أعلى وأسفل الشرائح. إزالة معظم E3 بحيث يتم عقد أجنة إلى الشريحة من التوتر السطحي.
- استخدام دبوس عازمة تشريح لتدوير الأجنة حتى الخلية هو ضد الجدار من الشريحة الحقن.
- استخدام micromanipulator لتوجيه الإبرة من خلال المشيماء الجنين ، من خلال والمح الى خلية واحدة من الجنين. حقن محلول الحمض النووي NL 0،5-1 في الخلية.
- نقل الأجنة في أطباق بتري في E3 واحتضان على 28،5 درجة مئوية. إذا لزم الأمر ، يمكن تباطأت التنمية من خلال احتضان الأجنة في درجة حرارة أقل.
4. تصاعد الأجنة للتصوير
- إزالة chorions من الأجنة مع ملقط غرامة قبل نحو ساعة من أجنة يبلغ سن المطلوب للتصوير (حوالي 14-17 ساعة بعد الإخصاب لأغراضنا).
- حدد أجنة باستخدام خلايا المسمى باستخدام مجهر تشريح مجهزة مضان. نحن نستخدم هدفا 4X (التكبير 40X) على نطاق AZ100 نيكون بسبب مزيج من العمل لمسافات طويلة والتكبير عالية.
- مكان الجنين في أنبوب microfuge مع ما يقرب من 50 E3 ميكرولتر تحتوي على 0.2 ٪ Tricaine مخدر (تركيز 10X).
- إضافة 500 ميكرولتر 1 ٪ نقطة انصهار منخفضة agarose في E3 مع HEPES 10 ملم (الاحتفاظ بها في درجة مئوية 42) ، وتمييع Tricaine إلى تركيز النهائي من 0.02 ٪.
- نقل على الفور في إسقاط الجنين في agaroseساترة من الشريحة التصوير باستخدام عدسة واسعة تحمل ماصة.
- قبل agarose يصلب ، والموقف الجنين وبالتالي فإن المنطقة مع الخلايا المسماة تواجه باستمرار ضد ساترة القاع (أسفل ظهري للخلايا العصبية والعرف ظهراني بانخفاض عن الخلايا العصبية الحسية الشوكي).
- التجمع غرفة التصوير : معطف جانب واحد من عصابة من البلاستيك (2 سم القطر الخارجي ، 3 مم) مع الشحوم فراغ السيليكون ويضعوا على المعدن شريحة التصوير. معطف على الجانب الآخر من الحلبة مع الشحوم.
- ملء الغرفة مع E3 تحتوي على 10 ملم وHEPES Tricaine 0.02 ٪. ختم أعلى القاعة الالصاق حتى 22 مم 2 ساترة إلى السطح العلوي مدهون من الحلبة.
5. 4D التصوير من السلوكيات خلية في أوليمبوس FV1000 مبائر مع IX81 المجهر
وتفاصيل الحصول على الصور تعتمد على خصوصيات النظام المجهر الخاص بك. نحن هنا وصف عملية اقتناء الوقت الفاصل عن المجهر FV1000 مبائر أوليمبوس. انظر بروتوكول إن الرب السابقة لمرور الزمن اقتناء مع نظام LSM زايس مبائر 510 6.
- مكان التصوير في غرفة حامل الشرائح على الساحة المجهر والتركيز على الجنين باستخدام 10X 20X أو موضوعية تحت الضوء المرسل.
- التحول إلى هدف 60X (NA من 1.2 أو أعلى) ، والتركيز على الخلية المسمى مع epifluorescence. نستخدم الغمر إما النفط (UPLSAPO 60xO NA 1.35) أو الماء الغمر (UPLSAPO 60xW NA 1.20) العدسة.
- في البرنامج FV (الإصدار 1.7c) ، انقر فوق تكرار لبدء XY المسح بواسطة أشعة الليزر.
- ضبط إعدادات اقتناء وضوابط الحصول على الصور (ليزر الإخراج ، سرعة المسح الضوئي ، HV ، واكتساب ، ويقابل المستويات) لتحسين إشارة مع الحفاظ على قوة الليزر كحد أدنى (25 ٪ أو أقل) لمنع تلف الأنسجة وتقليل photobleaching.
- للحصول على سلسلة Z - تعيين الحدود العليا والدنيا للض المكدس ، جنبا إلى جنب مع حجم الخطوة. تأكد من أن تعمل على رمز العمق بحيث رمز الاجتياح XY XY وقد أبرزت وZ. بدء اقتناء بالنقر على أيقونة الاجتياح XYZ.
- للحصول على سلسلة مرور الزمن ، تعيين الفاصل الزمني وعدد من النقاط الزمنية تحت عنوان TimeScan في اكتساب إعدادات الإطار. انقر فوق رمز الزمن في صورة نافذة التحكم اقتناء بحيث رمز الاجتياح XY وقد XY (Z) ، وأبرز تي. بدء اقتناء بالنقر على الاجتياح T XY (Z) رمز.
- بدلا من ذلك ، يمكن استخدام TimeController لاقامة مرور الزمن. هذه البرمجة مفيدة عند إنشاء مجموعات كبيرة من البيانات ، كما أنه لا يتجاوز تخصيص الذاكرة. تحت الأجهزة ، وفتح نافذة TimeController. إنشاء مهمة التصوير الجديدة. سوف نافذة المعلمة صورة مفتوحة. انقر على زر الحالة FV لتحديث إعدادات الاستحواذ. جعل متأكد من حفظ وحذف ويتم فحص تحت عنوان إنهاء. تعيين اسم ملف الإخراج وانقر فوق موافق لحفظ الإعدادات وأغلق النافذة. استخدام الدالة حلقة لتعيين الفاصل الزمني المطلوب ، وعدد من النقاط الزمنية. انقر فوق ابدأ وجاهزة للبدء في الاستحواذ. يمكن استخدام وقفة وظائف Z - التحول إلى إعادة تركيز حين التصوير.
6. ممثل النتائج
الأرقام والأفلام تصور أمثلة من الخلايا العصبية الحسية والخلايا العصبية المسماة قمة مع غشاء استهداف fluorophores أو جهاز الاستشعار البيولوجي أكتين التحقيق.
الشكل 1 الصور متحد البؤر (Z - إسقاطات) من (ngn1 : GFP - caax) تيراغرام. حقن الجنين وراثيا مع 25 بيكوغرام ngn1 : mCherry caax - DNA. التسميات mCherry - CAAX عصبون الحمراء (A) في الخلفية مع جميع الخلايا العصبية الحسية Rohon - اللحية المسمى الخضراء (B). C) صورة مدموجة من القنوات الخضراء والحمراء على حد سواء. مقياس بار = 50 ميكرومتر.
الشكل 2 متحد البؤر ض التوقعات من الخلايا العصبية في الأجنة حقنوا ص 20 ~ ngn1 :. mCherry DNA - UtrCH A) Rohon - اللحية الخلايا العصبية الحسية في جنين HPF 16.5. F - أكتين إشارة قوية في مخاريط النمو (السهام) ونتوءات على طول المحاور التي شكلت حديثا. B) الخلية العصبية في جنين 20 HPF الاداء القوي F - أكتين الإشارة في مخاريط نمو محور عصبي محيطي متفرعة (السهام) ، وأضعف إشارة في وسط أكثر نضجا المحاوير (الأسهم). مقياس بار = 50 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وسوف تركز الأمثل لحقن الحمض النووي تختلف تبعا لحجم وقوة بناء المروج وينبغي أن تحدد تجريبيا. ويمكن حقن الحمض النووي يؤدي إلى الكثير من الأجنة غير صحية واسعة النطاق مع موت الخلايا ، في حين أن القليل جدا سوف يؤدي إلى نسبة ضئيلة جدا من الأجنة حقن معربا عن التحوير. مستوى التعبير الحمض النووي يرتبط مع قوة الإشارة fluorophore ، والتي تختلف من خلية إلى أخرى. في حين فرز الأجنة تحت epifluorescence ، استبعاد الذين لديهم مستويات عالية للغاية من التعبير. الخلايا التي تظهر المسمى مشرقة جدا وعادة ما تظهر أيضا علامات واضحة على السمية ، مثل مورفولوجيا الخلايا الشاذة ، mislocalization من جزيئات ذات العلامات ، وموت الخلايا. وحقن الحمض النووي نموذجي الغلة 5-10 ٪ من الأجنة التي هي مناسبة للتصوير.
يمكن للجهاز الاستشعار البيولوجي F - أكتين الدالة بطريقة سلبية مهيمنة عندما أعرب عند مستويات مرتفعة. إذا المروج يحركها التعبير هي إشكالية ، يمكن التعبير عن جهاز الاستشعار البيولوجي بتواجد مطلق عن طريق حقن مرنا. ميزة الحقن مرنا هو أنه يمكن التحكم في مستويات التعبير عن طريق ضبط تركيز مرنا. وصفت الخلايا الفردية في هذه الأجنة عن طريق الحقن المشترك لبناء الحمض النووي يحتوي على القيادة المروج خلية محددة تعبيرا عن fluorophore الأغشية المترجمة. وقد استخدمنا هذا الأسلوب في الصورة F - الأكتين في الخلايا العصبية العرف 7.
نحن غالبا ما تحمل من تقنية وضع العلامات وحيدة الخلية في خطوط التعبير المعدلة وراثيا. على سبيل المثال ، حقن - 3.1ngn1 : mcherry البلازميد في الأجنة من تيراغرام (- 3.1ngn1 : GFP) خط سوف تسمية الخلايا العصبية الحسية الفردية أحمر على خلفية خضراء من الخلايا العصبية. هذه الاستراتيجية تسمح دراسة سلوك الفرد داخل خلية سياق السكان الخلية بأكملها.
نحن نركز هنا على التصوير والعصبية الخلية العصبية السلوكيات العرف وتوزيع أكتين. ومع ذلك ، يمكن توسيع الأسلوب العام لوضع العلامات المحددة فسيفساء نسيج الخلايا عن طريق الحقن في الحمض النووي للاستخدام البلازميد مع البروتينات الفلورية الانصهار فضلا عن غيرها من تحقيقات جهاز الاستشعار البيولوجي المرمزة وراثيا. يمكن الجمع بين هذه التقنيات تسمح للمحققين تصور التعريب التحت خلوية من جزيئات محددة وكذلك آليات إشارات في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 تم الحصول NS042228 لصحة الأم والطفل ومبائر FV1000 أوليمبوس مع الأجهزة المشتركة المعاهد الوطنية للصحة منح S10RR023717 إلى قسم علم الحيوان UW (PI بيل Bement).
ساهم إيريكا أندرسون ، Asuri نامراتا ، وماثيو كلاي بالتساوي على هذه الورقة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | A5040-250G | |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12243 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Picospritzer | Parker Hannifin Corporation | 051-0302-900 |
References
- Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones. Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. 24, (2009).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
